Crispr-Cas12a在成人弥漫性胶质瘤异柠檬酸脱氢酶2基因突变检测中的应用.pdf

中国临床神经外科杂志2023年8月第28卷第8期 Chin J Clin Neurosurg,August 2023,Vol.28,No.8【摘要】目的探讨Crispr-Cas12a方法对成人弥漫性胶质瘤异柠檬酸脱氢酶2（IDH2）基因R172K单核苷酸多态性的检测效能。方法 选择2019年1月至2022年9月手术切除的初治成人弥漫性胶质瘤组织样本112例，利用Crispr-Cas12a方法和直接测序法检测样本IDH2-R172K位点突变情况，以直接测序法为金标准。结果 112例中，9例IDH2-R172K突变型，103例IDH2-R172K野生型。ROC曲线分析显示，曲线下面积为0.967，约登指数为0.892，最佳截断值为590。以590作为IDH2-R172K突变型和野生型样本的阈值，Crispr-Cas12a法的灵敏性为96.3%（95%CI 81.7%99.3%），特异性为92.9%（95%CI 89.5%95.3%）。Crispr-Cas12a法与直接测序法一致性检验Kappa值为0.658，一致性较好。结论 Crispr-Cas12a方法能快速、准确地检测成人弥漫性胶质瘤组织样IDH2-R172K突变情况，可作为术中快速检测IDH2-R172K突变的方法。【关键词】成人弥漫性胶质瘤；异柠檬酸脱氢酶2；基因突变；Crispr-Cas12a；基因直接测序【文章编号】1009-153X（2023）08-0517-05【文献标志码】A【中国图书资料分类号】R 739.41Application of Crispr-Cas12a in the detection of isocitrate dehydrogenase 2 gene mutation in adult diffuse gliomasFENG Zhe-bin,KONG Dong-sheng,WU Qi-jia,ZHANG Yu,WANG Jun-xiang,YU Xin-guang,FENG Shi-yu.Department ofNeurosurgery,The First Medical Center of PLA General Hospital,Beijing 100089,China【Abstract】Objective To investigate the efficacy of Crispr-Cas12a in the detection of R172K single nucleotide polymorphism ofisocitrate dehydrogenase 2(IDH2)gene in adult diffuse gliomas.Methods A total of 112 newly diagnosed adult diffuse glioma tissuesamples were selected from January 2019 to September 2022,and IDH2-R172K mutations were detected by Crispr-Cas12a and directsequencing,with direct sequencing as the gold standard.Results Of 112 samples,9 were IDH2-R172K mutant and 103 were IDH2-R172K wild type.ROC curve analysis of Crispr-Cas12a detection results showed that the area under the curve was 0.967,the Jordenindex was 0.892,and the best cutoff value was 590.Using 590 as the threshold for IDH2-R172K mutant and wild-type,the sensitivityand specificity of Crispr-Cas12a were 96.3%(95%CI 81.7%99.3%)and 92.9%(95%CI 89.5%95.3%),respectively.The Kappa valueof Crispr-Cas12a and direct sequencing was 0.658,showing good consistency.Conclusions Crispr-Cas12a can rapidly and accuratelydetect IDH2-R172K mutation in adult diffuse glioma tissues,and can be used as a method for rapid intraoperative detection of IDH2-R172K mutation.【Key words】Adult diffuse gliomas;Isocitrate dehydrogenase 2;Crispr-Cas12a;Direct sequencingCrispr-Cas12a在成人弥漫性胶质瘤异柠檬酸脱氢酶2基因突变检测中的应用冯哲斌张宇孔东生武其嘉王俊祥余新光冯世宇实验研究实验研究弥漫性星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤的诊断标准要求对异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）基因突变情况进行准确检测1。IDH基因突变不仅是成人弥漫性胶质瘤的重要的分子分型依据，而且与手术方案的制定及预后的预测密切相关2；因此，快速、准确地检测IDH状态对于成人弥漫性胶质瘤的诊断和预后评估至关重要。目前发现成人弥漫性胶质瘤IDH基因突变包括IDH1和IDH2两种基因突变类型3，二者均可导致IDH蛋白的结构与活性改变，继而影响细胞代谢及肿瘤微环境4，5。相较于IDH1，IDH2突变发生率更低6，7，且缺乏免疫组化检测位点的覆盖，临床实践中更容易被忽视。Crispr-Cas系统是一种体外核酸快速检测的有效工具8，9。本研究应用Crispr-Cas12a工具对成人弥漫性胶质瘤组织IDH2-R172K位点突变（c.515GA）进行快速检测，并以二代测序结果为金标准，初步评价该方法的检测效能。1 材料与方法1.1 样本来源 纳入标准：术后病理证实为WHO分级24级成人弥漫性胶质瘤参考 世界卫生组织doi:10.13798/j.issn.1009-153X.2023.08.011基金项目：军队装备研发项目（LB20201A060004）作者单位：100089 北京，解放军总医院第一医学中心神经外科医学部（冯哲斌、张宇、孔东生、武其嘉、王俊祥、余新光、冯世宇）通讯作者：冯世宇，E-mail：余新光，E-mail：-517中国临床神经外科杂志2023年8月第28卷第8期 Chin J Clin Neurosurg,August 2023,Vol.28,No.8中枢神经系统肿瘤分类1，肿瘤样本于术后进行直接测序检测；术后24 h内样本放置于冻存管，低温液氮保存，使用前未进行冻融；病人或家属签署知情同意书。排除标准：合并胶质瘤外的其他恶性肿瘤；术前曾行针对胶质瘤的放化疗、电场治疗、生物治疗等；同时伴有严重细菌、真菌、病毒感染性疾病、传染病。本研究通过解放军总医院伦理委员会批准（伦审第S2018-268-02号）。选择2019年1月至2022年9月手术切除的初治成人弥漫性胶质瘤组织样本（术后液氮冻存）作为Crispr-Cas12a检测对象。共筛选出116例符合标准的成人弥漫性胶质瘤样本，其中IDH2-R172K突变型9例，IDH2-R172M突变型1例，IDH2-R172S突变型1例，IDH2野生型105例。4例IDH2野生型样本的肿瘤细胞含量小于10%（依据HE染色结果），被排除，因此最终纳入9例IDH2-R172K突变型样本及103例IDH2-R172K野生型样本进行Crispr-Cas12a检测。11例IDH2突变的胶质瘤病人资料见表1。1.2 Crispr-Cas12a荧光检测体系的构建及验证 选择IDH2-R172K作为检测位点。参照特异性检测位点区域设计野生型和突变型模板，设计PCR扩增引物，同时针对这些突变区域设计Crispr DNA（crDNA）并合成所需的寡核苷酸Crispr RNA（crRNA）。crDNA、引物、IDH野生型及突变型靶标等信息见表2。扩增条件：95/180 s；95/10 s、58/20 s，30次循环；25/2 s。检测蛋白为Fncas12a。将合成的靶标模板（15 l）加入检测试剂混合液（含有 2 l crRNA、2 lFncas12a、10 l荧光探针及3 l C Buffer，最后补充ddH2O至50 l）37 反应0.5 h读取荧光值，分析荧光曲线，以进行Crispr-Cas12a荧光检测体系验证。这些反应均在3742内进行。1.3 胶质瘤样本的检测 由两名检测员完成全部组织样本检测，检测员不知晓样本IDH突变情况。将样本进行随机排序，依排序升序对样本依次进行Crispr-Cas12a检测。每例样本重复检测3次。在未解冻情况下剪取少许冰冻肿瘤组织（约0.1ml），常温下融化，进行DNA 快速提取并获得待检DNA上清液。以5 l上清液为模板，使用常规引物进行 PCR 扩增。将扩增体系（上清液 5 l，Primermix 2 l，扩增mix 25 l，ddH2O 18 l，总体积50 l）加入反应耗材下层储液管中。将检测体系（纯化的Cas12a 2 l，crRNA 2 l，荧光探针10 l，C Buffer 3l，ddH2O 33 l，总体积50 l）加入耗材上层储液管备用。此步骤避光。使用V2型掌上型快速荧光检测仪一体机进行检测。扩增遵循程序：95/180 s；95/10 s、58/20 s，25次循环；25/2 s。反应程序为：37/1 min，30次循环，每1 min采集一次荧光。反应全部结束后，统计分析检测反应（37）内反应前后荧光值的变化情况（即相对荧光值）。根据阴性阈值判断待测待测样本DNA中是否存在待检突变基因。1.4 HE染色与直接测序方法 所有冰冻组织样本进行HE染色评估样本质量。直接测序采用一步法多重PCR扩增联合下一代测序进行IDH位点突变检测（包 括 R132H，R132C，R132S，R132G，R132L，R172K，R172M，R172W，R172G，R172S）。委托北京泛生子基因科技有限公司完成。表1 本文纳入11例IDH2突变胶质瘤病人的临床资料病例病例1病例2病例3病例4病例5病例6病例7病例8病例9病例10病例11性别女男男男女男男男女男男年龄（岁）4831293824405327343449部位右额颞岛叶左额颞叶右颞叶左额叶右额岛叶左额颞岛叶左额颞顶叶左额顶叶、丘脑右额岛叶、胼胝体右颞岛叶右额叶组织学类型少突胶质细胞瘤少突-星型细胞瘤星形细胞瘤少突-星形细胞瘤少突胶质细胞瘤少突胶质细胞瘤星形细胞瘤少突-星型细胞瘤少突胶质细胞瘤星形细胞瘤少突胶质细胞瘤WHO分级3级2级2级3级2级3级4级2级2级3级2级IDH2突变位点R172KR172KR172KR172KR172KR172KR172KR132H、R172KR172KR172MR172SCrispr-Cas12a检测的相对荧光值（针对IDH2-R172K）第一次1 8008501 3002 9006001 6002202 3001 700280330第二次2 4009001 5001 9009001 8007502 1001 900170350第三次1 7001 1001 5501 7508002 2006001 4001 250400140-518中国临床神经外科杂志2023年8月第28卷第8期 Chin J Clin Neurosurg,August 2023,Vol.28,No.81.5 统计学分析 应用SPSS 22.0软件分析；以直接测序为金标准，评价Crispr-Cas12a方法的诊断效能；依据相对荧光值绘出Crispr-Cas12a方法的受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，求得IDH2-R172K突变型和野生型样本相对荧光值的最佳截止值，计算灵敏度、特异性和一致性，利用曲线下面积（area under curve，AUC）评估检测水平，其中AUC0.9为优秀，0.70.9为一般，0.75为一致性很好，0.40.75为一致性较好，0.4为一致性较差；P0.05认为差异有统计学意义。2 结 果2.1 Crispr-Cas12a 检测体系的验证结果 IDH2-R172K目的基因片段扩增片段长度为308 bp。对8个样本（4个IDH2-R172K野生型、4个IDH2-R172K突变型）在目的基因扩增后进行电泳，均显示出清晰的条带（图1）。利用不同比例的IDH2-R172K突变型与野生型非扩增模板混合进行梯度拷贝检测，模拟体内肿瘤细胞不同频率的IDH2-R172K突变，结果显示相对荧光值与IDH突变频率呈正相关，理论上可检测频率低至1%的IDH2-R172K突变（图2）。考虑到阴性对照组（IDH2-R172K突变型非扩增模板0 ng+IDH2-R172K野生型非扩增模板100 ng）的荧光值变化程度约为500单位，因此预估IDH突变型与野生型样本的相对荧光值截止值为500。2.2 Crispr-Cas12a方法检测结果及与直接测序的一致性 利用Crispr-Cas12a方法检测显示，9例IDH2-R172K样本中，26例次相对荧光值600，1例次相对荧光值为220。ROC曲线分析显示，AUC为0.967（图3），约登指数为0.892，最佳相对荧光值为590，与预实验截止值（500）相近。以590作为IDH2-R172K突变型和野生型样本的阈值，Crispr-Cas12a 法的灵敏度为96.3%（95%CI 81.7%99.3%），特 异 性 为 92.9%（95%CI 89.5%95.3%），一致性为 93.2%（95%CI89.9%95.4%）。Crispr-Cas12a法与直接测序法一致性检验Kappa值为0.658，一致性较好（表3）。3 讨 论IDH基因状态是成人弥漫性胶质瘤分子分型的重要依据之一，对指导手术治疗具有重要意义1。不检测目标IDH2-R172K crDNAIDH2-R172K上游IDH2-R172K下游IDH2-R172K野生型IDH2-R172K突变型序列5-GTCGCCATGGGCGTGATTGCATCTACAAGAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC-35-CGGTCTGCCACAAAGTCTGT-35-GTGGGACCACTATTATCTCTGTCC-35-CCTGGTCGCCATGGGCGTGCCTGCCAATGGTGATGGGCTTGGTCCAGCCAGGGA-35-CCTGGTCGCCATGGGCGTGCTTGCCAATGGTGATGGGCTTGGTCCAGCCAGGGA-3表2 crDNA、上下游引物及IDH2-R172K野生型、突变型靶点序列图1 脑胶质瘤样本IDH2-R172K基因扩增产物电泳鉴定图2 Fncas12a荧光体系验证组 1.100%IDH2-R172K 突变型模板+0%IDH2-R172K 野生型模板；组2.50%IDH2-R172K突变型模板+50%IDH2-R172K野生型模板；组3.10%IDH2R172K突变型模板+90%IDH2-R172K野生型模板；组4.1%IDH2-R172K突变型模板+99%IDH2-R172K野生型模板；组5.0%IDH2-R172K突变型模板+100%IDH2-R172K野生型模板；*P0.01-519中国临床神经外科杂志2023年8月第28卷第8期 Chin J Clin Neurosurg,August 2023,Vol.28,No.8同亚型成人弥漫性胶质瘤的手术切除范围不同。少突胶质细胞瘤的切除应以保护神经功能为主，可以接受少量肿瘤组织残留10；星形细胞瘤则需要达到影像学范围尽可能完全切除11。IDH野生型低级别弥漫性胶质瘤的切除范围往往需要超出影像学所示范围12。而对胶质母细胞瘤，65岁以下的病人需要切除MRI增强范围病变和非增强范围病变，65岁以上的病人则建议仅切除增强病变13。因此，结合术前影像学特征，术中明确IDH状态有助于成人弥漫性胶质瘤病人的精准个体化手术。此外，与胶质瘤相比，一些非肿瘤性改变（梗死、坏死、脑脓肿、辐射改变）以及颅内转移瘤的影像学表现可能与成人弥漫性胶质瘤相似，导致术前诊断不明确，而这些病变并不具有IDH突变的特征14。本研究Crispr-Cas12a方法检测IDH突变耗时约50 min，可作为术中快速检测方法，不仅可以指导手术，也有助于鉴别诊断。此外，本文11例IDH2突变的样本中，8例组织含有少突胶质细胞瘤的成分，提示IDH1野生型除了具有少突胶质细胞瘤病理学特征外，应注意是否存在IDH2突变3，15。目前，IDH2突变的主要检测手段依赖术后直接测序16。但是直接测序不能用于术中快速检测，无法指导手术。免疫组化法不能检测IDH2突变，使IDH2突变容易被忽视。Crispr检测作为新一代检测技术17，18，具有反应速度快、灵敏度高、易操作等优势，适用于体外核酸快速检测19，已应用于多种疾病的诊断，例如SARS-CoV-220，21、人偏肺病毒等22。Crispr-Cas12a识别特异性靶分子的能力很强，能够对粗扩增后的样本进行检测18。本实验检测体系的检测能力达到1%频率的突变，可以满足临床需要。另外，Crispr-Cas12a方法检测IDH2-R172K的灵敏度较高，但特异性较低。由于IDH2-R172K基因为点突变，野生型与突变型仅存在一个碱基对差异，crRNA在反应中可能不可避免地与野生型片段发生错配，出现假阳性结果。ROC 曲线显示，Crispr-Cas12a 方法的 AUC 达0.967，灵敏度与特异性均在90%以上，表明本方法对IDH2-R172K野生型与突变型的区分能力较强，具有相当高的检验效能。另外，Crispr-Cas12a方法具有检测速度快，成本低的优势，可以弥补直接测序的速度偏慢、较昂贵的不足。本实验首次将Crispr-Cas12a工具引入成人弥漫性胶质瘤的分子检测，具备一定的创新性。该方法具有一些优势：首先，检测耗时约50 min，基本满足术中快速检测需求。由于快速荧光检测仪一体机可以实时展现相对荧光值，因此有进一步缩短检测用时间的可能；其次，该实验所需的仪器少，对检测环境要求较低，试剂成本低，可以在手术室中展开检测，有利于普及应用；另外，单次检测所需的样本量很少，一粒小米粒大小的肿瘤组织（约0.1 ml）即满足检测需求。若有条件，多孔快速荧光检测仪可以同时在床旁进行多次检测，以进一步提高检测结果的准确性。此外，考虑到样本来源于标本库，并非全部检测者亲自采集，因此对样本进行HE染色并评估样本质量是有必要的。本实验有以下几点不足：首先，IDH2-R172K突变型样本数量较少，这是与其较低的突变频率有关，作为弥补，我们设置了相对较大数量的阴性对照；其次，我们忽视了其它罕见位点的突变，如 R172M、R172W、R172G、R172S等，这些突变发生频率很低，虽然理论上将这些位点纳入检测完全可行，但是没有足够的突变型样本验证针对这些位点的检测体系是否有效；最后，我们只进行了冰冻样本的检测，尽管冰冻样本与新鲜样本的DNA含量没有显著差别23，但在应用于临床前，需要完善对新鲜样本的检测。总之，本研究初步探索了Crispr-Cas12a方法快速检测成人弥漫性胶质瘤冰冻样本IDH2-R172K突图3 ROC 曲线分析Crispr-Cas12a法检测脑胶质瘤IDH2-R172K基因突变的效能表3 Crispr-cas12a法与直接测序法检测脑胶质瘤IDH2-R172K基因突变的一致性分析（例次）Crispr-Cas12a方法阳性阴性NGS测序阳性261阴性22287-520中国临床神经外科杂志2023年8月第28卷第8期 Chin J Clin Neurosurg,August 2023,Vol.28,No.8变，该方法灵敏度、特异度高，与直接测序一致性良好，基本完成快速定性检测，具有潜在的临床应用价值。【参考文献】1LOUIS 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