NY∕T 2466-2013 大麦品种鉴定技术规程 SSR分子标记法(农业).pdf

ICS 65.020.20 B 05 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 2466一2013大麦品种鉴定技术规程SSR.分子标记法Identification of barley varieties-SSR marker method 2013-12-13发布2014一04-01实施中华人民共和国农业部发布NYjT 2466-2013 目次前言.H1 范围.2 规范性引用文件.1 3 原理4 仪器设备及试剂5 溶液配制6 引物.7 参照品种及其使用. 1 8 操作程序19 等位变异数据采集.310 判定标准.4 附录A(规范性附录)仪器设备及试剂.附录B(规范性附录)溶液配制.附录C(规范性附录)核心引物.附录D(资料性附录)参照品种名单.I NY/T 2466-2013 E 前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由农业部种子管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC277)归口。本标准起草单位:江苏省农业科学院、农业部科技发展中心。本标准主要起草人:王艳平、沈奇、堵苑苑、张继红、李华勇、王显生、吴燕、戴剑。NY/T 2466一2013大麦品种鉴定技术规程SSR分子标记法1 范围本标准规定了利用简单重复序列(Simple吕equencerepeats.SSR)分子标记进行大麦(Hordeum vulgl1re L. )品种鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准。本标准适用于大麦DNA分子数据的采集和品种鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件.仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 3543.2农作物种子检验规程杆样GB/T 19557.1 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则NY/T 2224-2012 植物新品种特异性、致性和稳定性测试指南大麦3 原理SSR广泛分布于大麦基因组中.不同品种间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。由于每个SSR位点两侧的序列是高度保守和单拷贝的，因而可根据其两侧的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对两条引物间的DNA序列进行扩增。在电泳过程中.主要由于SSR位点重复单位的数量不同引起的不同长度的PCR扩增片段在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定大麦品种。4 仪器设备及试剂仪器设备及试剂见附录A。5 溶液配制溶液配制方法见附录Bo6 引物引物相关信息见附录c7 参照品种及其使用参照品种的名称见附录C，参照品种的来源参见附录D。在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品种的PCR扩增产物。注1:多个品种在某二SSR位，点上可能都具有相同的等位变异。在确认这些品种该位点等位变异大小与参照品种相同后.这些品种也可以代替附录D中的参照品种使用。注2.同一名称不同来源的参照品种的某一位点上的等位变异可能不相同.在使用其他来糠的参照品种时.应与原参照品种核对.确认无误后使用。注3.对于附录C中未包括的等位变异.应按本标准方法.确定其大小和对应参照品种。8 操作程序8. 1 样晶准备NY/T 2466-2013 8. 1. 1 分析和保存种子样品的分样和保存，应符合GB/T3543.2的规定。8. 1.2 分析每份样品检测10个个体(种子、叶片或其他器官组织)，混合分析。对一致性差的样品每个个体单独分析。8.2 DNA提取取大麦的幼苗或叶片0.5g，剪碎，放入2mL离心管中。往离心管中加入液氮，放入研磨仪，磨成粉状后立即加人预热的DNA提取液800L左右，剧烈摇动混匀，并在650C水浴中保温30mn50 mn, 其间可摇动几次。冷却至室温加入等体积三氯甲烧一异戊醇(24: 1)，颠倒氓匀，室温下静置5mn10 mln，使水相和有机相分层。12000g离心10mino移取上清液至另一个2mL离JL管中，加入约1.5倍体积的预冷乙醇，轻缓颠倒漉匀，经12000g离心3min至分相，弃上清液。用70%乙醇溶液洗涤2遍，自然条件下干燥后，加入50L1XTE缓冲液熔解沉淀。用紫外分光光度计检测DNA浓度，将DNA稀释到20ng/L。置于一200C保存备用。注:其他所获DNA质量能够满足PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本标准。8.3 PCR 扩增8. 3. 1 反应体系25L的反应体积(或12.5L)，含dNTPs2.5 mmol/ L，正向引物10mol/L，反向引物10mol/L.Taq DNA聚合酶1.0单位，10XPCRBuHer(含Mg2可，样品DNA20吨。利用毛细管电泳荧光检测时使用荧光标记的引物。引物的荧光染料种类见附录C。注:反应体系的体积可以根据具体情况进行调整。8.3.2 反应程序940C预变性5min;940C变性30s，470C620C(可根据附录C推荐的引物退火温度设定)退火30s, 720C延伸1min，共35个循环;720C延伸5min，40C保存。8.4 PCR产物检测8.4. 1 变性聚丙烯酷股凝胶电泳与银染检测8. 4. 1. 1 清洗玻璃板将玻璃板清洗干净，用去离子水冲洗后晾干。用元水乙醇擦洗两遍，吸水纸擦干。在长板上涂O.5 mL亲和硅院工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烧工作液。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。8.4. 1. 2 组装玻璃板玻璃板彻底干燥后，将其组装成电泳胶板，用水平仪调平。垫片厚度为0.4mm。8.4. 1.3 制胶在100mL 6. O%PAGE胶中分别加入TEMED50L和新配制的10%过硫酸镀溶液500L，迅速氓匀后灌胶。待胶液充满玻璃板夹层，将0.4mm厚重鱼齿梳子平齐端向里轻轻插入胶液约0.4cm。灌胶过程中防止出现气泡。使胶液聚合至少lh以上。胶聚合后，清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拔出梳子，用水清洗干净备用。8.4. 1.4 预电泳将胶板安装于电泳槽上，向上槽中加人800mL预热至650C的0.25XTBE缓冲液，使其超过凝胶顶部约3cm，向下槽中加人800mL 1XTBE缓冲液。在60W恒功率下，预电泳10min 20 mino 8. 4. 1. 5 样晶制备在25LC或12.5L)PCR样品中加人10L(或5L)上样缓冲液，混匀。在水浴锅或PCR仪上950C变性5min.取出，迅速置于碎冰上。NY/T 2466一20138.4. 1.6 电泳用注射器吸取缓冲液冲洗凝胶顶端几次，清除气泡和聚丙烯眈胶碎片。将重鱼齿梳子梳齿端插入凝胶1mm2 mmo每一个加样孔点人3L5L样品(加样量取决于梳齿的宽窄)。除待测样品外，还应同时加人参照品种扩增产物。在50W80 W恒功率下电泳，使凝胶温度保持在约500C0电泳1. 5 h 2. 5 h(电泳时间取决于扩增片段的大小范围)。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，取下凝胶附着的长玻璃板准备固定。注:具体功率大小根据电泳槽的规格型号和实验室室温设定。8.4. 1.7 银染a) 固定:将凝胶附着的长玻璃板置于塑料盆中，加入固定液，使固定液没过凝胶，在摇床上轻轻晃动20min30 min; b) 漂洗:取出玻璃板，在去离子水中漂洗1次，时间不超过10S; c) 染色:将玻璃板置放于染色液中，使染色液没过凝胶，在摇床上轻轻晃动30min; d) 漂洗:在去离子水中快速漂洗，时间不超过10S; e) 显影:将玻璃板在预冷的显影液中轻轻晃动至出现清晰带纹;f) 定影:将凝胶在固定液中定影5min; g) 漂洗:在去离子水中漂洗1min。8.4.2 毛细管电泳荧光检测8.4.2. 1 PCR产物样晶准备将6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述4种稀释后悔液混合，从混合液中吸取1L加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加入O.1L Liz 500分子量内标和8.9L去离子甲酷股。将样品在PCR仪上950C变性5mi丑，取出，立即置于碎冰上，冷却10min以上。瞬时离心10S后置放到DNA分析仪上。除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括2个3个参照品种的扩增产物。注:不同荧光标记的扩增产物的最适稀释倍数最好通过毛细管电泳荧光检测预试验确定。8. 4. 2. 2 开机准备打开DNA分析仪，检查仪器工作状态。更换缓冲液，灌胶。将装有样品的深孔板置放于样品架基座上。打开数据收集软件。8.4.2.3 编板按照仪器操作程序创建电泳板，输人电泳板名称。选择适合的程序和电泳板类型，输入样品编号或名称。8.4.2.4 运行程序DNA分析仪自动将毛细管电泳数据、运行参数等存放在仪器中。9 等位变异数据采集9. 1 数据表示样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段大小的形式表示。9.2 变性聚丙烯凝胶电泳与银染检测将某一位点待测样品和相应的参照品种扩增片段的带型和移动位置进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位，点的等位变异大小。9.3 毛细管电泳荧光检测使用DNA分析仪的片段分析软件，读出每个位点每个样品的等位变异大小数据o比较参照品种NYjT 2466-2013 的等位变异大小数据与附录C中参照品种相应的数据，两者之间的差值为系统误差。从待测样品的等位变异数据中去除该系统误差，得到的数据即为待测样品该位点的等位变异大小。示iJiJ1: 参照品种新民大麦、上虞早大麦在Bmac0209位点上的等位变异大小分别为178bp和182 bp.附录C中新民大麦、上虞早大麦相应的数据分别为177bp和181忡，系统误差为1bp。一个待测样品的等位变异大小原始数据为178 bp则待测样品在该位点上的等位变异数据应为177bpo 示锣IJ2: 参照品种哈铁系l号、S-096在Scssr02748位点上的等位变异大小分别为143bp和146bp.附录C中哈铁系l号、S-096相应的数据分别为143bp和146bp.系统误差为obp。一个待测样品的等位变异大小原始数据为113hp. 则待测样品在该位点上的等位变异数据应为143bp. 9. 4 结果记录纯合位点的等位变异大小数据记录为XjX，其中X为该位点等位变异的大小:杂合位点的等位变异数据记录为x/y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异，小片段在前，大片段在后。无效等位变异的大小记录为0/0。示例1: 一个品种在Scssr02748位点上有l个等位变异，大小为143峙，则该品种在该位点上的等位变异数据记录为113/1130 示例2.一个品种在sc阳r02748位点上有2个等位变异，大小分别为143坤、J.l6bp.则该品种在该位点上的等位变异数据记录为143/146010 判定标准10. 1 直接比较待测品种和对照同时进行检测C直接比较)时.先用附录C中的14个位点的基本核心引物检测，获得待测品种和对照在这些引物位点的等位变异数据，利用这些数据进行品种问比较，品种间差异位点数大于等于3，判定为不同品种;品种间差异位点数小于2，继续用14个位点的扩展核心引物进检测.利用全部位点的等位变异数据进行品种间比较:a) 品种间差异位点数大于等于3，判定为不同品种;b) 品种间差异位点数为0-3.判定为近似品种;c) 品种间差异位点数等于O.判定为疑同品种。对于10.1b)和10.1 c)的情况，按照NY/ T 2224-2012的规定进行田间鉴定.或按照GB/T19557.1的规定进行田间鉴定。10.2 数据库比较对待测品种利用附录C中的核心引物检测，将检测数据和数据库中品种的数据进行比较C数据库比较): 的品种间差异位点数大于等于3，判定为不同品种;b) 品种间差异位点数小于3，判定为近似品种。对10.2 b)的情况，按照NY/T2224一2012的规定进行田间鉴定，或按照GB/T 19557. 1的规定进行田间鉴定。4 A.1 主要仪器设备A. 1. 1 PCR扩增仪。A. 1.2 高压电泳仪。A. 1.3 电泳槽及配套的制胶附件。A. 1.4 水平电泳槽及配套的制胶附件。附录A(规范性附录)仪器设备及试剂NY/T 2466-2013 A. 1.5 DNA分析仪:基于毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨最少l个核昔酸的差异。A. 1.6 高速离心机。A. 1.7 水平摇床。A. 1.8 胶片观察灯。A. 1.9 电子天平。A. 1. 10 微量移液器。A. 1. 11 紫外分光光度计。A. 1. 12 高压灭菌锅。A. 1. 13 酸度计。A. 1. 14 水浴锅或金属浴。A. 1. 15 制冰机。A. 1. 16 凝胶成像系统或紫外透射仪。A. 1. 17 植物组织研磨仪。A.2试剂除非另有说明.在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。A. 2.1 十二皖基磺酸铀。A. 2. 2 二氯甲:皖。A. 2. 3 异戊醇。A. 2. 4 乙二胶四乙酸二纳。A. 2. 5 =起甲基氨基甲皖。A. 2. 6 浓盐酸。A. 2. 7 氢氧化锅。A. 2. 8 氯化饷。A. 2. 9 Taq DNA聚合酶。A. 2. 10 10 X PCR Buffer(含Mg2-)。D NY/T 2466一2013A. 2.11 4种脱氧核糖核昔酸。A. 2.12 SSR引物。A. 2.13 矿物油。A. 2.14 琼脂糖。A. 2.15 去离子甲酌肢。A. 2.16 澳盼蓝。A. 2.17 二甲苯青。A. 2.18 甲叉双丙烯酷肢。A. 2.19 丙烯酷肢。A. 2. 20 棚酸。A.2.21 尿素。A. 2. 22 亲和硅烧。A. 2. 23 剥离硅烧。A. 2. 24 元水乙醇。A. 2. 25 四甲基乙二肢。A. 2. 26 过硫酸绩。A. 2. 27 冰醋酸。A. 2. 28 乙酸钱。A. 2. 29 硝酸银。A. 2. 30 甲醒。A. 2.31 DNA分析仪用聚丙烯眈胶胶液。A. 2. 32 DNA分析仪用分子量内标:最大分子量500坤，Liz标记。A. 2. 33 DNA分析仪用光谱校准基质:包括6-FAM、TAMRA、HEX和ROX4种荧光染料标记的DNA片段。A. 2. 34 DNA分析仪用电泳缓冲液。6 NY/T 2466-2013 B. 1 DNA提取溶液的配制B. 1. 1 1 moI/ L氢氧化铀溶液附录B(规范性附录)溶液配制称取40.0g氢氧化铀，溶于800mL去离子水中，冷却至室温，定容至1000mL。B. 1.2 0.5 moI/L盐酸溶液量取25mL36%38%浓盐酸，加去离子水定容至500mLo B. 1. 3 O. 5 moI/L Z二股四乙酸二铀盐CpH8.0)溶液称取186.1g乙二胶四乙酸二铀盐，加入800ml去离子水，再加入20g氢氧化铀，搅拌。待乙二胶四乙酸二锅盐完全溶解后，冷却至室温。再用氢氧化纳溶液CB.1.D准确调pH至8.0，定容至1000mL。在103.4kPa(1210C)条件下灭菌20mino B. 1.4 1 moI/L三握甲基氨基甲院盐酸CpH8.0)溶液称取60.55g三起甲基氨基甲烧，溶于400mL去离子水中，用盐酸溶液也.1. 2)调pH至8.0，定容至500mL.在103.4 kPa(1210C)条件下灭菌20mino B. 1.5 5 moI/L氯化纳溶液称取292.2g氧化锅，溶于750mL去离子水中，定容至1000mL，在103.4kPa灭菌20mino B. 1.6 DNA提取液称取15.0g十二皖基磺酸纳，分别加人40mL乙二胶四乙酸二铀盐溶液CpH8.0) CB. 1. 3)、100mL1 mol/L三起甲基氨基甲皖盐酸溶液(pH8.0) CB. 1. 4)和100ml 5 mol/ L氯化锅溶液CB.1.5)，搅拌，待溶解后定容至1000mL。在103.4kPa(1210C)条件下灭菌20mino于40C保存。B. 1.7 三氯甲皖+异戊醇混合液VC三氯甲皖)+VC异戊醇)=24+1B. 1. 8 TE缓冲液分别量取5mL三起甲基氨基甲皖盐酸溶液CpH8.0) CB. 1. 4)和1mL乙二胶四乙酸二铀盐溶液CpH8. 0) CB. 1. 3)，定容至500mL.在103.4kPa(1210C)条件下灭菌20min。于40C下保存。B. 2 PCR扩增溶液的配制B.2.1 dNTP溶液用超纯水分别配制dATP、dTTP，dGTP、dCTP四种脱氧核糖核昔酸终浓度为100mmol/L的储存液。分别量取4种储存液20L混合，用120L超纯水定容，配制成每种核昔酸终浓度为10mmol/L 的工作液。在103.4kPa(1210C)条件下灭菌20min，于一200C保存。注:也可使用满足试验要求的商品dNTP溶液。B. 2. 2 SSR 51物溶液用TE缓冲液或超纯水分别配制正向引物和反向引物浓度为10p.mol/L的工作液。B.3 变性聚丙烯酷腰凝胶电泳溶液的配制B. 3. 1 10 X TBE缓冲液7 NY/T 2466-2013 分别称取108.0g三起甲基氨基甲烧和55.0g棚酸，溶于800mL去离子水中，加入37mL乙二胶四乙酸二铀盐溶液CpH8.O)(B. 1. 3).定容至1000mL。B.3. 2 40%丙烯酷膜溶灌分别称取190.0g丙烯酷股和10.0g甲叉双丙烯酷肢，海于400mL去离子水中-定容至500mLB. 3. 3 6%变性聚丙烯酷肢溶液称取420.0g尿素，用去离子水熔解，分别加人100mL 10XTBE缓冲液CB. 3. 1)和150ml 40%丙烯眈胶溶液也.3. 2) .定容至1000mL。B. 3. 4 亲和硅皖缓冲液分别量取49.75mL无水乙醇和250L冰醋酸.用去离子水定容至50mLB. 3. 5 亲和硅皖工作液分别量取5L亲和硅镜和1mL亲和硅皖缓冲液，混匀。B. 3. 6 剥离硅皖工作班分别量取98mL三氯甲:烧溶液和2mL二甲基二氯硅惋悔液，混匀。B. 3. 7 10%过硫酸锥需液称取1.0g过硫酸钱，榕于10mL去离子水中，氓匀。于-4.C保存。B. 3. 8 1 X TBE缓冲溜量取500mL10XTBE缓冲液也.3. 1) .用去离子水定容至5000mL. B. 3. 9 6 X加样缓冲液分别称取0.25g i臭酣蓝和0.25g二甲苯青，分别加入98mL去离子甲酷股和1mL乙二服四乙酸二铀盐搭液(pH8.0)，搅拌榕解。B.4 银染溶液的配制B.4.1 固定液量取100mL冰醋酸.加人1000mL去离子718 185 S-096 187 草麦190 苏农68195 鄂91049132 乌金一号136 新民大麦;).J 138 哈铁系l号146 蝶县209160 蝶县209166 长芒六棱露仁J;l 178 新民大麦182 早熟3号191 草麦172 哈铁系l号178 新民大麦60 182 上虞早大麦184 S-096 186 蝶县209189 秀麦3号142 红日l号146 鄂910491.50 山乘县209153 上虞早大麦;);) 155 哈铁系l号163 玉环洋大麦165 临海光头大麦166 大中88-91187 拜泉皮4号110 革麦125 长芒六棱露仁127 紫皮大麦55 136 甫大麦4号141 哈铁系号143 新民大麦149 京裸II9 NY/T 2466-2013 表C.1 (续)位点染色体引物序列(5-3)荧光退火温度等位变异参照品种a。Cbp 80 草麦94 玉环洋大麦F: TGCTGCGATGATGAGAACT 96 紫皮大麦EBmac0635 4H 5ROX 60 106 秀9560R:TAGGGTAGATCCGTCCCTATG 109 哈铁系1号111 威24117 京裸1189 威2491 8-096 93 玉环洋大麦F:ACTAGTACCCACTATGCACGA 5HEX 94 四棱大麦Bmag0353 4H R:ACGTTCA1寸AAAATCACAACTG55 甘木二条115 117 秀9560123 草麦125 哈铁系l号178 甫大麦4号188 威24Scssr10148 5H F:AAGCAGCAAAGCAAAGTACC 5ROX 60 195 哈铁系1号R:TCATCAGCATCTGATCATCC 199 草麦201 紫皮大麦212 长芒六棱露仁112 冬青15号114 早熟3号116 紫皮大麦Scssr03907 5H F:CTCCCATCACACCATCTGTC 5TAMRA 128 蕾大麦4号60 R:GACATGGT寸CCCTTCTTCTTC137 哈铁系1号139 革麦141 大中88-91145 宾县皮4号167 冬青15号171 d嗓县209BmagO009 6日F:AAGTGAAGCAAGCAAACAAACA 5TAMRA 173 哈铁系1号60 R: ATCCTTCCATATITGA TTAGGCA 175 草麦177 鄂91049179 大中88-91126 革麦F:CCCCACACTGACCTACAG 128 米麦114Bmag0867 6H R:TTACATCTGCTAGATCGAAGC 5ROX 55 130 紫皮大麦132 玉环洋大麦138 威24F:GCCTCGG1fGGACATATAAAG 128 哈铁系1号HVCMA 7H 56-FAM 62 130 浙农大3号R: GTAAAGCAAATG寸GAGCAACG秀麦3号136 132 宾县皮4号F:ACCGAAACTAAATGAACTACTTCG 145 口合铁系1号EBmac0603 7H R:TGCAAACTGTGCTATTAAGGG 56-FAM 58 149 甫大麦4号161 甘啤2号169 革麦a 参照品种来源参见附录D。10 C.2 扩展核心引物见表c.z。表C.2扩展核心引物NY/T 2466-2013 位点|染色体引物序列(53) 荧光退火温度|等位变异oc bp 参照品种RScssr02748 HVM54 Scssr07759 F:GGTGCA1寸寸GGAAGTCTAGG1H I R:ATAGCAAGTGCCAAGTGAGC 56-FAM 47 -00 62 nUA丛&nhuminu-A9。，-l 143 哈铁系1号boo-nyqdni口J1iA结4-A哇FDFUFaRU-4-111ATi-1i S-096 草麦长芒六棱露冬青15号青大麦4号哈铁系1号草麦南大麦4号上虞早大麦威242H F:AACCCAGTAACACCTGTCCTG R:AG1寸CCCTGACCCGATGTCSHEX HvXan HVM27 HVM60 HVM40 Bmac0181 Scssr07106 Bmag0387 丑WAMN 口时削TIV AA :G 刀孔叹口邮AC AtA 巳AGC FR H 9 S6-FAM 58 58 58 107 112 114 116 118 119 143 145 151 154 162 156 172 174 175 179 167 169 172 132 135 138 188 191 193 195 紫皮大麦哈铁系1号鄂91049新民大麦西海皮44号紫皮大麦扬饲麦1号紫皮大麦京裸11单60大中88-91鄂91049草麦F:CAGCCACCTCCATAGTACTT 2H I =-. R:CTGCTCTAGGCTCGTGTT 56-FAM 60 55 60 58 107 109 111 113 119 121 S-096 草麦早熟3号义乌二棱大麦甫大麦4号鄂91049米麦114l脑海光头大麦d嗓县209新民大麦长芒六棱露草麦蕾大麦4号蝶县209哈铁系1号浙农大3号紫皮大麦乌金一号甘啤2号F:GGTCGGTTCCCGGTAGTG 3H I R:TCCTGATCCAGAGCCACC SHEX F: CAA TGATGCGGTGAACTrTG 3H I R:CCTCATCTATGGGTCCTT 5TAMRA F: CGA TTCCCCT寸rCCCAC4H I R:AT寸CTCCGCCGTCCACTC5TAMRA F:ATAGATCACCAAGTGAACCAC 4H I R:GG1寸ATCACTGAGGCAAATACS6-FAM 5H F:GCGCTGTCTCTTCTATGTGC R:AGGTGCTCCTAATCTGATGG STAMRA 5H F:CGATGACCATrGTAT寸GAAGR:CTCATGTTGATGTGTGG寸AGS6-FAM 11 NY / T 246620 13 表C.2 (续)位点染色体引物序列(53) 荧光退火温度等位变异参照品种画。Cbp 129 甫大麦4号6H F:GTCCTTTACGCATGAACCGT 56-FAM 131 长芒六棱露仁Bmac0018 62 哈铁系l号R:ACATACGCCAGACTCGTGTG 133 135 蝶县209169 临海光头大麦F: AGAGCGCAAGTT ACCAAGC 5TAMRA 172 蝶县209Scssr09398 6H 47 R: GTGCACCTCAGCGAAAGG 181 哈铁系1号192 威24144 草麦Bmac0064 7H F:CTGCAG.刀寸TCAGGAAGG5ROX 157 紫皮大麦47 R:AGATGCCCGCAAAGAGl寸161 S-096 171 沪麦4号F:GCATAAA;GGTGTAAGAGC 170 蝶县209Scssrl5864 7H 5ROX 55 181 米麦114R:CATCCAG丁寸CAGAGGATAGAGC184 临海光头大麦参照品种来源参见附录Do12 参照品种名单见表D.L序号名利:长芒六棱露仁2 哈铁系l号3 甫大麦4号4 义乌二棱大麦U 浙农大3号6 秀麦3号7 d碟县2098 米麦1149 临海光头大麦10 上虞早大麦11 玉环洋大麦12 威2413 紫皮大麦14 草麦15 S-096 16 早熟3号17 秀956018 新民大麦附录D(资料性附录)参照晶种名单表D.l参照晶种名单编号序号19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 NY/T 2466-2013 名称编号廿木二条冬青15号红日1号;封、农684鄂91049大中88-91 单60京裸11四棱大左宾县皮4号关东二条22号拜泉皮4号西海皮44号沪袤4号甘晦2号乌金一号扬饲友l号13