外泌体-未来的医学研究和应用新方向PPT课件.ppt

Exosomes：Ourfuturetarget！1.简介外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中细胞主动分泌的囊泡样小体大小较为均一，直径为40100纳米密度1.101.18g/ml2.3.4.5.细胞外泌体携带多种蛋白质、mRNA、miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程并有可能成为药物的天然载体，应用于临床治疗。ThryC是建立外泌体提取分离鉴定金标准的泰斗(Thryetal,2006)。在Cell发表了一篇综述，文中着重讨论了EV对癌症转移作用的最新发现，下面就是她的综述内容6.Exosomes还是EV?ThryC提出应该是exosomes“而不是”exosome”(Thry,etal.2014)因为Exosome还含有另一个含义：外切酶体复合物，具有RNase活性。分离的产物若没有进一步证明它的细胞内来源，应定义为混合的小EVExtracellularVesicles，即胞外囊泡。来自多泡内体或MVB的才是exosomes，可检测囊泡是否含内体标志蛋白证明，如CD63。Multivesicularbodies，MVB=MVEMultivesicularendosomes因此，这些exosomes的功能可能是广义EV的，也可能是真正的exosomes。下面ThryC的综述中使用广义的EV指没有专门鉴定过大小的囊泡，使用小EV指小于200nm的小囊泡。7.8.EV帮助癌细胞长出“腿”？1.肿瘤来源的EV对受体细胞有不同的作用。在原发性肿瘤位点，EV能稳定细胞突起，增强癌细胞运动能力。EV通过细胞外基质(ECM)局部沉积，促进定向的持续迁移，例如含有纤连蛋白(Fibronectin)的小EV。2.包含金属蛋白酶(Metalloproteinases)的EV也可以直接参与ECM重构(Remodeling)，使特化的细胞突起具有降解能力，也就是侵入性伪足(Invadopodia)。ECM重构帮助肿瘤细胞在组织之间迁移。9.10.3.EV可促进肿瘤基质细胞的分化或募集，如纤维母细胞(Fibroblasts)和骨髓来源细胞(Bonemarrow-derivedcells,BMDC)。反过来，周围纤维母细胞分泌的EV可以增强肿瘤细胞迁移能力及耐药性。4.小EV还能进入循环，从原发肿瘤到达远端位点。小EV的堆积可能增加血管通透性，EV可以进入远端组织，诱导ECM重构、募集BMDC以及后来的肿瘤细胞，制造转移前微环境(Pre-metastaticniche)。11.体内分析EV转移的方法将标签添加到分泌的EV里I.将荧光蛋白基因融合到棕榈酰化(Palmitoylation)序列，标记全细胞膜，通过mRNA的新荧光我们可以跟踪结合或内化了EV的细胞II.膜结合荧光素酶蛋白可以分析体内发光细胞，这样就能捕获结合EV的荧光素酶蛋白或荧光素酶mRNAIII.用CRE重组酶，检测EV内的mRNA12.13.EV帮助小RNA转运？miRNA分泌进小EV，运输进靶细胞并发挥功能，直接调控miRNA靶标。Pegteletal,2010，发现小EV转运EB病毒miRNA到邻近未感染的细胞，抑制靶基因。除了EV包裹的miRNA，miRNA起的作用也有可能是其他EV组分在靶细胞表达内源miRNA引起的。如何明确上述两种情况？转运的miRNA是外源基因组编码的，如病毒的(Pegteletal,2010)或寄生虫的(Bucketal,2014)，又或者受体细胞是小鼠的，并没有所研究的miRNA(Alexanderetal,2015)。14.EV与免疫最近报道发现肿瘤微环境中EV的RNA有着一段特殊的序列(Boelensetal,2014)：它带有5-triphosphate末端，通过RIG-I感应器被受体细胞基质识别，诱导干扰素应答，跟病毒感染类似。这种应答也参与癌症细胞对放疗或化疗的应答。小EV与包膜病毒有相似作用？何种表面分子协助受体细胞膜融合RNA或小分子内含物到细胞质呢？这个问题有待探索。15.外泌体分离和检测16.1.分离到目前为止，仍没有一种提取方法能同时保证外泌体的含量、纯度以及生物活性。17.1.1离心法最常用的方法。收集细胞培养液以后依次在300g、2000g、10000g离心去除细胞碎片和大分子蛋白质，最后100000g离心得到外泌体。得到外泌体量多，纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块，由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的是微泡不是外泌体。18.1.2过滤离心过滤离心是利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜离心分离外泌体。截留相对分子质量是指能自由通过某种有孔材料的分子中最大分子的相对分子质量。外泌体是一个囊状小体，相对分子质量大于一般蛋白质，因此选择不同大小的MWCO膜可使外泌体与其他大分子物质分离。这种操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性，但同样存在纯度不足的问题。19.1.3密度梯度离心法分为连续和不连续梯度离心法。用于密度梯度离心法的介质要求对细胞无毒，在高浓度时粘度不高且易将pH调至中性。实验中常用蔗糖密度梯度离心法，在离心法的基础上，预先将两种浓度蔗糖溶液(如2.5M和0.25M)配成连续梯度体系置于超速离心管中，样本铺在蔗糖溶液上，100000g离心16h，外泌体会沉降到等密度区(1.101.18g/ml)。用此种方法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，量少。20.1.4免疫磁珠法泌体相关抗原的抗体(如CD9、CD63、Alix)与外泌体共同孵育，蒸馏水冲洗后，重悬于PBS缓冲液中。这种方法可以保证外泌体形态的完整，特异性高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备,但是非中性pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，不便进行下一步的实验。21.1.5色谱法色谱法是利用根据凝胶孔隙的孔径大小与样品分子尺寸的相对关系而对溶质进行分离的分析的方法。样品中大分子不能进入凝胶孔，只能沿多孔凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，首先被流动相洗脱出来；小分子可进入凝胶中绝大部分孔洞，在柱中受到更强地滞留，更慢地被洗脱出。分离到的外泌体在电镜下大小均一，但是需要特殊的设备，应用不广泛。22.2.外泌体测量各种方法的比较23.2.1电子显微镜扫描电子显微镜(SEM)能够直接观察到样品中外泌体的形态。并且SEM具有很高的分辨率，能够鉴别不同大小的外泌体。但SEM对样品的预处理和制备上面要求较高，样品的准备阶段比较复杂，不适合对外泌体进行大量快速的测量。而且由于外泌体经过了预处理和制备过程，无法准确的进行外泌体浓度的测量。24.2.2动态光散射技术动态光散射是收集溶液中做布朗运动的颗粒散射光强度起伏的变化，通过相关仪器将光强的波动转化为相关曲线，从而得到光强波动的速度，计算出粒子的扩散速度信息和粒子的粒径。小颗粒样品的布朗运动速度快，光强波动较快，相关曲线衰减较快，大颗粒反之。在外泌体研究中，动态光散射测量敏感度较高，测量下限为10纳米。相对于SEM技术来说，样品制备简单，只需要简单的过滤，测量速度较快。但由于动态光散射技术是测量光强的波动数据，所以大颗粒的光强波动信号会掩盖较小颗粒的光强波动信号，所以动态光散射不适合大小不一的复杂外泌体样本的测量，只适合通过色谱法制备的大小均一的外泌体的尺寸测量，并且无法测量样品中外泌体的浓度。25.26.2.3纳米微粒追踪分析术纳米微粒追踪分析术(以下简称NTA)是一种比较新颖的研究纳米颗粒的方法，可以直接和实时的观测纳米颗粒。NTA通过光学显微镜收集纳米颗粒的散射光信号，拍摄一段纳米颗粒在溶液中做布朗运动的影像，对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，从而计算出纳米颗粒的流体力学半径和浓度。NTA系统的工作原理是将一束能量集中的激光穿过玻璃棱镜对样品(悬浮颗粒的溶液)进行照射(光路图见下图)27.28.激光光束从较小角度入射进入样品溶液，照亮溶液中的颗粒。配备相机的光学显微镜，被放置在特定的位置上，收集视野中被照亮的纳米颗粒发射出的光散射信号。样品池有大约500微米的深度，采样点激光照亮宽度为20微米，这个数值和光学显微镜的聚焦的视野深度相匹配。相机会进行60秒的影像拍摄，每秒30个采样画面。颗粒的运动过程被NTA软件进行分析。NTA软件在每幅被记录的画面中鉴别和追踪做布朗运动的纳米颗粒。29.由于直接追踪样品中每一个纳米颗粒，因此NTA技术对复杂的样品具有极高的分辨率。为了证明NTA对于复杂样品的分辨能力，我们将100纳米和300纳米两种不同大小的聚苯乙烯颗粒按照5:1的数量混合，使用NTA进行测量(图3A)。尽管其分布图形有一定的重叠，但两种不同大小的纳米颗粒的峰清楚的区分开来。这种对复杂样品的分辨能力对于外泌体这样的研究对象来说是非常重要的。NTA也能对样品浓度进行直接测量。对一系列浓度为1108-8108的100纳米单分散样品进行测量，可以看到NTA测量浓度结果和实际浓度存在着很好的线性相关(图3B)。对于多分散体系，测量结果的准确取决于仪器参数的设定(照相机快门速度和光圈)，恰当的参数设定可以保证不同大小颗粒都能被NTA软件追踪和计算。30.31.由于外泌体表面有标志物CD9、CD63等跨膜分子的存在，在复杂的背景环境下(如血清中)，可以用荧光抗体标记外泌体，再用NTA的荧光测量功能实现在复杂背景下对外泌体的测量。相比较于流式细胞仪的荧光功能，NTA分辨率较高，且测量荧光颗粒的下限可以达到30-40纳米，而流式细胞仪的测量下限为400纳米。即使对于最新一代的数码流式细胞仪，其测量下限已经达到100纳米，但由于它仍然建立在监测光信号的基础上，所以测量和准确性和分辨率仍然不可靠。所以在外泌体荧光功能测量上，NTA具有独特的优势。32.结语对外泌体作为生物标志物的研究目前仍处于起步阶段，但其在临床应用领域已显示出良好的前景。在临床诊断中，若想在复杂的生物背景下(如血浆，尿液)简单快速地测量外泌体浓度，需具备外泌体的大小和表征数据。但目前存在的方法都无法完美的解决这一问题。作为一个相对新的测量技术，NTA具有较高的分辨率，提供实时观测以及准确的浓度测量和荧光测量，对外泌体大小和浓度研究提供了新的思路。33.