KRAS和EGFR检测与临床应用.ppt

KRAS和和EGFR检测与与临床床应用用汇报内容汇报内容KRAS和和EGFR的简介及临床意义的简介及临床意义ARMS-PCR的基本原理和技术特点的基本原理和技术特点等位特异性引物设计等位特异性引物设计KRAS试剂盒开发简介试剂盒开发简介KRAS和和EGFR的简介及临床意义的简介及临床意义KRAS背景背景KRAS是一种原癌基因，长约是一种原癌基因，长约35kb，位于，位于12号染色体，是号染色体，是RAS基因家基因家族成员之一，编码的蛋白主要参与族成员之一，编码的蛋白主要参与PI3K、PTEN、AKT和和RAF、MEK、ERK信号通路的调控；信号通路的调控；EGFR在通路中位于在通路中位于KRAS上游，配体与之结合后可以激发其酪氨酸上游，配体与之结合后可以激发其酪氨酸激酶活性，导致激酶活性，导致KRAS的活化和通路中信号传导；的活化和通路中信号传导；KRAS是许多恶性肿瘤的常见突变基因：胰腺癌（是许多恶性肿瘤的常见突变基因：胰腺癌（65%-90%）、结直）、结直肠癌（肠癌（40%）、肺癌（）、肺癌（20%）、卵巢癌（）、卵巢癌（15%）。）。KRAS基因突变影响结直肠癌药物疗效基因突变影响结直肠癌药物疗效KRAS基因野生型的转移性结直肠癌患者能从基因野生型的转移性结直肠癌患者能从EGF抗体（抗体（西妥昔单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗帕尼单抗）治疗中获益，而基因突变的患者治疗效果很差；）治疗中获益，而基因突变的患者治疗效果很差；KRAS突变型患者对西妥昔单抗无应答，其总体生存期明显低于突变型患者对西妥昔单抗无应答，其总体生存期明显低于KRAS野生型患者野生型患者Karapetis CS,2008,N Eng J Med结直肠癌患者检测结直肠癌患者检测KRAS突变相关指南突变相关指南欧洲药品评估局（欧洲药品评估局（EMEA，2008）指出：）指出：KRAS野生型的进展期结直肠癌患者可能从帕野生型的进展期结直肠癌患者可能从帕尼单抗中受益，而突变型患者受益较少。尼单抗中受益，而突变型患者受益较少。美国临床肿瘤学会（美国临床肿瘤学会（ASCO，2009）推荐：）推荐：转移性结直肠癌患者应检测转移性结直肠癌患者应检测KRAS突变，如突变，如有有KRAS12、13位突变，则不应进行位突变，则不应进行EGFR单克隆抗体治疗；单克隆抗体治疗；美国美国FDA指南推荐：在使用靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结肠直肠癌前指南推荐：在使用靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结肠直肠癌前必须检测必须检测KRAS基因的基因型；基因的基因型；2012年年7月月6日批准第一个用于结直肠癌的基因检测日批准第一个用于结直肠癌的基因检测（Qiagen），以判断西妥昔单抗是否有效；，以判断西妥昔单抗是否有效；美国国立综合癌症网络（美国国立综合癌症网络（NCCN，2014）指南说：）指南说：转移性结直肠癌患者均应进行转移性结直肠癌患者均应进行RAS突突变检测（变检测（KRAS和和NRAS），至少应检测），至少应检测KRAS第二外显子的突变情况第二外显子的突变情况。KRAS或或NRAS突变型的病人不应采取西妥昔单抗或帕尼单抗治疗。突变型的病人不应采取西妥昔单抗或帕尼单抗治疗。中国卫生部于中国卫生部于2010年年10月月14日发表了结直肠癌诊疗规范（日发表了结直肠癌诊疗规范（2010版）版）。明确指出在。明确指出在患者确定为复发或转移性结直肠癌接受患者确定为复发或转移性结直肠癌接受西妥昔单抗西妥昔单抗、帕尼单抗时，必须检测肿瘤组织、帕尼单抗时，必须检测肿瘤组织的的K-ras基因状态。在晚期基因状态。在晚期/转移性结直肠癌化疗中，在治疗前检测肿瘤转移性结直肠癌化疗中，在治疗前检测肿瘤 K-ras 基因状态，基因状态，EGFR不推荐作为常规检查项目。不推荐作为常规检查项目。KRAS基因突变影响非小细胞肺癌药基因突变影响非小细胞肺癌药物疗效物疗效KRAS基因野生型的非小细胞肺癌患者能从小分子酪氨酸激酶抑制剂（基因野生型的非小细胞肺癌患者能从小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI，如，如吉吉非替尼、厄洛替尼非替尼、厄洛替尼）治疗中获益，而基因突变的患者易发生抵抗；）治疗中获益，而基因突变的患者易发生抵抗；KRASKRAS突变型患者使用厄洛替尼联合化疗后，其无症状生存期和总生存期明显低于野生型患者（图中突变型患者使用厄洛替尼联合化疗后，其无症状生存期和总生存期明显低于野生型患者（图中红线所示）红线所示）Anderson SM,2011,Expert Rev.Mol.Diagn Eberhard DA,2005,J Clin Oncol 非小细胞肺癌患者检测非小细胞肺癌患者检测KRAS突变相突变相关指南关指南美国国立综合癌症网络（美国国立综合癌症网络（NCCN，2009）指出，）指出，KRAS突变与非小细突变与非小细胞肺癌患者胞肺癌患者TKI抵抗有关，抵抗有关，KRAS基因测序有助于确定哪些病人适合基因测序有助于确定哪些病人适合TKI治疗。治疗。当当KRAS基因发生了突变，则不建议病人使用厄洛替尼进基因发生了突变，则不建议病人使用厄洛替尼进行分子靶向治疗。行分子靶向治疗。KRAS主要突变位点主要突变位点在结直肠癌中，在结直肠癌中，KRAS突变主要发生于突变主要发生于codon12(80%)、codon13(15-20%)、codon61和和146(C6239G719S182155GA6252G719C182155GT6253E746-A750del(1)192235-2249del156223E746-A750del(2)192236-2250del156225L747-P753S192240-2257del1812370E746-A750I192235-2252AAT(complex)13551E746-A750del192235-2253del1812728E746-A750A192237-2251 del1512678E746-S752A192237-2254 del1812367E746-S752V192237-2250 T(complex)12384E746-S752D192238-2255 del186220L747-A750P192238-2248 GC(complex)12422L747-T751Q192238-2252 GCA(complex)12419L747-E749del192239-2247del96218L747-T751del192239-2253del156254L747-S752del192239-2256del186255L747-A750P192239-2248TTAAGAGAAG C12382L747-P753Q192239-2258CA(complex)12387L747-T751S192240-2251del126210L747-T751del192240-2254del1512369L747-T751P192239-2251 C(complex)12383T790M202369C T6240S768I202303GT6241V769-D770insASV202307-2308 ins GCCAGCGTG12376H773-V774insH202319-2320 ins CAC12377D770-N771insG202310-2311 ins GGT12378L858R212573TG6224L861Q212582TA6213EGFR突变与突变与EGFR-TKI药物疗效关药物疗效关系系所在外显子所在外显子突变类型突变类型与与EGFR-TKI疗效关系疗效关系18G719A(S/C)3种点突变种点突变药敏突变药敏突变1919种缺失突变种缺失突变药敏突变药敏突变20点突变点突变S768I药敏突变药敏突变20点突变点突变T790M耐药突变耐药突变*203种插入突变种插入突变耐药突变耐药突变*21点突变点突变L858R药敏突变药敏突变21点突变点突变L861Q药敏突变药敏突变ADx EGFR试剂盒突变结果检测试剂盒突变结果检测组别组别突变类型突变类型所占比例所占比例对吉非替尼对吉非替尼敏感性敏感性证据证据 1Exon 19 deletions;L858R 90%充分充分2T790M/deletion;T790M/L858R;G719X;L861Q;S768I 7%有限有限3T790M alone;Exon 20 insertions;other mutations 3%无无ARMS-PCR的基本原理和技术特点的基本原理和技术特点ARMS-PCR原理原理ARMS是是Amplification Refractory Mutation System(扩增阻碍突变系扩增阻碍突变系统统)的缩写。的缩写。根据根据 PCR过程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现对突变位点过程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现对突变位点的检测的检测,当引物当引物 3 末端出现错配时末端出现错配时,产物将不能延伸。产物将不能延伸。因此设计两条上游（或下游）引物，因此设计两条上游（或下游）引物，使其使其3末端分别与突变位点碱基末端分别与突变位点碱基匹配和错配匹配和错配，共用下游（或上游）引物，分别扩增野生型和突变型目，共用下游（或上游）引物，分别扩增野生型和突变型目的片断。的片断。ARMS-PCR原理原理Two Allele-Specific(AS)primers,one for each allele of a SNP are designed.The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3 end.Two sets of primers,either forward or reverse primers can be designed.If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction,the reaction is called allele-specific PCR(AS-PCR).You F.M.2008,BMC BioinformaticsPCR产物检测产物检测-Real time PCR每个每个PCR循环循环检测荧光信号检测荧光信号，不同不同PCR产物，不同荧光信号产物，不同荧光信号相比凝胶电泳：更快，可定量，无相比凝胶电泳：更快，可定量，无PCR产物污染产物污染信号产生方法：信号产生方法：Scorpion(Qiagen)，双环探针，双环探针(厦门艾德厦门艾德)，Taqman，Molecular beacons，Sybr green，Yo-proFigure 2 The sensitivity of QuanTAS-PCR for quantifying JAK2 mutant alleles.Zapparoli G.V.2013,BMC Cancer应用于用于Real time-PCR的的ARMS-PCRGCATGAAGG alleleA allele55553333AS primerAS primerMismatchMismatchReverse primerReverse primerFAM-53-BHQ1FAM-53-BHQ1ProbeProbeARMS技术特点技术特点优点：优点：灵敏度高灵敏度高（0.1-1%）操作简便操作简便周期短周期短不产生不产生PCR产物污染产物污染适用样本类型多适用样本类型多（如（如FFPE）精确突变类型精确突变类型缺点：缺点：方法建立需时较长方法建立需时较长仅能检测已知突变仅能检测已知突变测序法与测序法与ARMS法相比较法相比较Sanger测序法测序法焦磷酸测序焦磷酸测序ARMS敏感度敏感度10-20%5-10%1%FFPE标本成功率标本成功率 低低较高较高高高商用试剂盒商用试剂盒无无有有有有流程与速度流程与速度1-2天天2-3天天AGTGly13SerGGCAGCGly12ArgGGTCGTGly13ArgGGCCGCGly12CysGGTTGTGly13CysGGCTGCGly12AspGGTGATGly13AspGGCGACGly12AlaGGTGCTGly13AlaGGCGCCGly12ValGGTGTTGly13ValGGCGTC三引物设计原理三引物设计原理You F.M.2008,BMC Bioinformatics三引物设计三引物设计ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG野生型引物（野生型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 19nt，51突变型引物（突变型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-319nt，49下游引物（下游引物（R）5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-325nt，54三引物设计三引物设计下游引物设计下游引物设计ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG选择序列选择序列：5-GACGAATATGATCCAACAATAGAGG-3互补链：互补链：3-CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC-5下游引物：下游引物：5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-33端增加错配端增加错配如果如果3端是弱错配（端是弱错配（C/A或或G/T）则需要引入强的错配（）则需要引入强的错配（A/G或或C/T）才可阻断才可阻断3端的扩增；端的扩增；如果如果3端是强错配（端是强错配（A/G或或C/T）则需要引入弱的错配（）则需要引入弱的错配（C/A或或G/T）或不需引入错配即可阻断或不需引入错配即可阻断3端的扩增；端的扩增；当当3端是中度错配（端是中度错配（A/A，C/C，G/G 或或T/T）则需要引入中度的错配。）则需要引入中度的错配。野生型引物（野生型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 突变型引物（突变型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCCT-3下游引物（下游引物（R）5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3四引物设计四引物设计四引物设计四引物设计ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG内引物（内引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 内引物（内引物（R）5-ACTCTTGCCTACGCCACC-3外引物（外引物（F）5-ATGACTGAATATAAACT-3外引物（外引物（R）5-CTCTTGACCTGCTGTGTCG-3KRAS试剂盒开发简介试剂盒开发简介KRAS突变探针和引物设计突变探针和引物设计KRAS序列：序列：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG1.5-CTT GTG GTA GTT GGA GCT TA-3 12GGT GAT 2.5-AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCG GT-3 12GGT GTT3.5-AA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GC-3 12GGT GCT4.5-ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT A-3 12GGT AGT5.5-AA CTT GTG GTA GTT GGA GCG T-3 12GGT TGT6.5-ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GCC C-3 12GGT CGT7.5-GTG GTA GTT GGA GCT GGT AA-3 13GGC GAC8.参照引物：参照引物：5-CT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT-39.下游引物：下游引物：5-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3 TaqMan探针：探针：5-FAM-TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-BHQ1-3锁核酸阻滞探针锁核酸阻滞探针(野生型野生型)：5-T GGA GCT GGT GGC GTA GGC-P04-3浙江大学，浙江大学，CN 102367478 B反应体系反应体系引物终浓度：引物终浓度：0.3 MTaqman探针终浓度：探针终浓度：0.1 MLNA阻滞探针终浓度：阻滞探针终浓度：0.9 MGoldstarbest Taq酶终浓度：酶终浓度：0.05 U/l 模板模板DNA终浓度：终浓度：10-300 ng/ldNTPs终浓度：终浓度：0.2 mMMgCl2 终浓度：终浓度：3.5 mM Real time-PCR循环循环:95C预变性预变性10分钟分钟95C 15秒秒60C 40秒秒扩增反应扩增反应40循环，循环，60C 40秒秒ARMS-qPCR在在ABI7500或或LC480检测仪上进行。每个样本进行检测仪上进行。每个样本进行8管反应，每管反应加入共同的管反应，每管反应加入共同的qPCR混合液，混合液，LNA阻滞探针及阻滞探针及模板模板DNA，所不同的只有参照引物或者，所不同的只有参照引物或者ARMS引物。引物。拟开发产品拟开发产品特异性引物：特异性引物：7条条 （检验特异性检验特异性）参照引物：参照引物：1条条（检验特异性检验特异性）下游引物：下游引物：1条条（检验特异性检验特异性）Taqman探针：探针：1条条锁核酸阻滞探针：锁核酸阻滞探针：1条条阳性对照：包含阳性对照：包含7种突变的质粒种突变的质粒DNA模板模板（测序）（测序）Taq酶，最好为酶，最好为Taq Gold（hot start enzyme)qPCR混合反应液混合反应液结果判读结果判读参照引物管扩增曲线阳性，各种参照引物管扩增曲线阳性，各种ARMS引物管均无扩增曲线或者其与引物管均无扩增曲线或者其与参照引物管的扩增曲线参照引物管的扩增曲线Ct差值差值 10，该样本结果判断为野生型；，该样本结果判断为野生型；参照引物管扩增曲线阳性，相应参照引物管扩增曲线阳性，相应ARMS引物管扩增曲线阳性，且其与引物管扩增曲线阳性，且其与参照引物管的扩增曲线参照引物管的扩增曲线Ct差值差值 7，该样本结果判读为可疑突变型；，该样本结果判读为可疑突变型；如重复检测如重复检测3次均显示扩增曲线阳性，该样本结果判读为突变型；次均显示扩增曲线阳性，该样本结果判读为突变型；参照引物管扩增曲线阴性，提示该样本提取失败，需要重新提取。参照引物管扩增曲线阴性，提示该样本提取失败，需要重新提取。