2,4-DCP对若蚓期、成蚓期赤子爱胜蚓毒性效应研究.pdf

广泛使用的 2,4-二氯酚(2,4-DCP)是一种常见的难降解有机物,在土壤中有一定的残留。为研究其急性毒性效应,分别以生长阶段为若蚓期、成蚓期的赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)为受试生物,采用滤纸接触法和两室趋避试验探讨不同暴露剂?量 2,4-DCP 对蚯蚓的急性毒性响应。结果表明,滤纸法测得若蚓期蚯蚓 24 h、48 h 和 72 h-LC50分别为 80.71、76.20、73.64 g cm-2,而成蚓期蚯蚓的分别为 82.88、77.63、74.65 g cm-2,略高于若蚓期;蚯蚓的中毒现象表现为部分环节肿大并渗血、躯体颜色变透明、躯体萎缩与断节等。两室趋避试验表明,当土壤中2,4-DCP 浓度为10 mg kg-1时,清洁土壤中蚯蚓占比高于总数的 80%,即表现出明显的趋避行为。蚯蚓组织切片显微观察结果表明,70.74 g cm-2浓度暴露下蚯蚓表皮结构受损,黄色细胞破裂,而 88.42 g cm-2浓度暴露下蚯蚓表皮严重溃烂坏死,纵肌细胞间隙扩大,黄色细胞和肠上皮细胞发生破裂、变性并与肠壁分离;滤纸法暴露 24 h 时,蚯蚓体内蛋白质含量、SOD 活性和 CAT 活性随 2,4-DCP 暴露剂量呈现先上升后降低趋势,表现出较明显的低剂量刺激和高剂量抑制效应;低浓度 2,4-DCP 胁迫下,若蚓体内的蛋白质含量、SOD 活性和 CAT 活性显著高于成蚓;长时间高浓度暴露下的若蚓体内 SOD 活性、CAT 活性几乎均低于成蚓。蚯蚓在若蚓期、成蚓期这 2 个生长阶段对 2,4-DCP 表现出不同的应激效应,其耐受能力也存在差异。关键词:2,4-DCP;赤子爱胜蚓;急性毒性;酶活性;组织病理学文章编号:1673-5897(2023)4-486-13 中图分类号:X171.5 文献标识码:AToxic Effect of 2,4-DCP on Eisenia fetida at Growth Stage and AdultStageLi Zhe1,Yin Yong2,Xue Qi2,Wang Yuhan1,Su Xing1,Zhang Wenyi1,*1.School of Environmental Science and Engineering,Changzhou University,Changzhou 213164,China2.Jiangsu LongHuan Environmental Technology Co.Ltd,Changzhou 213031,ChinaReceived 3 August 2022 accepted 25 October 2022Abstract:The widely used 2,4-dichlorophenol(2,4-DCP)is a common refractory organic material and has someresiduals in the soil.To investigate its acute toxic effect,Eisenia fetida,which was at the growth and adult stages ofdevelopment,was taken as the test organism,and the acute toxic response of earthworms to 2,4-DCP at differentdoses of exposure was investigated by means of the filter paper contact method and the two-compartment avoid-ance test.The results showed that the LC50measured by filter paper method was 80.71,76.20,73.64 g cm-2re-第 4 期李哲等:2,4-DCP 对若蚓期、成蚓期赤子爱胜蚓毒性效应研究487 spectively at 24,48 and 72 h at growth stage,and 82.88,77.63,74.65 g cm-2respectively at adult stage,whichwas slightly higher than that at growth stage.In the earthworm poisoning phenomenon,some of the links are swol-len and bleeding,the color of the body becoming transparent,the body shrink,and the broken segments.In thetwo-compartment avoidance test,when the concentration of 2,4-DCP in the soil was 10 mgkg-1,the earthwormcomprised more than 80%of the total number in the clean soil that exhibited signifcant avoidance behavior.In70.74 g cm-2concentration group,earthworm epidermis structure damaged,chloragogenous tissue ruptured,whilein 88.42 g cm-2concentration group,earthworm epidermis was severely ulcerated and necrotic,the cellular lacu-nae widened in the longitudinal muscles,and the chloragogenous tissue and intestinal epithelial cells ruptured,de-generated,and separated from the intestinal walls.In earthworms,protein content,SOD activity,and CAT activityinitially increased and then decreased with 2,4-DCP exposure dose during 24 h exposure by the filter paper method,showing a significant low-dose stimulation and high-dose inhibition effect.The protein content,SOD activity,andCAT activity of growing earthworms under low-concentration 2,4-DCP stress were significantly greater than thoseof adults.Under long-term exposure to high concentrations,the activity of SOD and CAT in the growing-stageearthworm body is almost less than that of adult earthworms.Earthworms have been shown to have different re-sponse to stress of 2,4-DCP in the growth and adult stages,and their tolerance is also different.Keywords:2,4-DCP;Eisenia fetida;acute toxicity;enzymatic activity;histopathology 2,4-二氯酚(2,4-DCP)是典型的酚类污染物,被广泛运用于农药、印染、石油化工、炼油、医药、机械制造和有机合成等诸多行业1-2。作为农业用除草剂或由于工业生产过程中储存、处置不善,2,4-DCP会通过废水、泄漏、大气沉降等途径进入环境中3。2,4-DCP 具有很强的毒性,进入环境后会对动、植物造成不同强烈的毒害作用,由于其在水和土壤中半衰期长,难以被降解,易在机体中累积,直接或间接地影响人类健康4-5。蚯蚓作为一种生物量大的无脊椎动物,在自然净化中起关键因素6,其取食、排泄等生理活动对土壤中有机质的分解和矿化循环起重要作用,有“土壤生态工程师”的美誉7。蚯蚓是一种对外来污染物敏感的生物8-9,体内的抗氧化酶活性和蛋白质等指标可及时反映各种化学品(重金属、有机物)的毒性效应,故具有评价土壤污染生态毒理的作用10-11。有关重金属及有机物对蚯蚓的毒性效应已有很多研究12-13,但因蚯蚓大小、蚯蚓种类及测试方法不同,结果也存在差异。自然界中,由于生物处于不同年龄,其对污染物的敏感程度也不同。王勤等14调查了白纹伊蚊对常用杀虫剂的抗性,结果表明各地白纹伊蚊幼虫对杀虫剂很敏感,而白纹伊蚊成蚊则具有不同程度的抗药性;黄轶等15在研究生态毒性数据质量评估时提出,以鱼和虫为试验对象时,幼鱼和幼虫通常对环境更敏感,而这在对蚯蚓的相关研究中鲜有报道。本研究采用滤纸接触法和两室趋避试验,揭示 2,4-DCP 对赤子爱胜蚓(若蚓期、成蚓期)2 个生长阶段的毒性效应,可为深入研究 2,4-DCP对蚯蚓及其生物生态系统的影响提供理论依据。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 供试蚯蚓和试剂试验蚯蚓为赤子爱胜蚓(Eisenia fetida),购自河?南石家庄某蚯蚓养殖场,于温度(232)、空气湿度 70%、光暗比 12 h 12 h 的实验室条件预驯养 14d 后,挑选色泽红润、活力强的蚯蚓,以无明显生殖环的蚯蚓为若蚓组,体质量为 150 250 mg;有明显生殖环的蚯蚓为成蚓组,体质量 350 500 mg,分别代表蚯蚓生长过程的 2 个重要阶段(图 1)。2,4-DCP(CAS 号 120-83-2,纯度 99.5%)由润友化学有限公司图 1 赤子爱胜蚓若蚓组 150 250 mg(a)和成蚓组 350 500 mg(b)Fig.1Eisenia fetida150 250 mg in the growth stageearthworms group(a)and 350 500 mg in theadult stage earthworms group(b)488 生态毒理学报第 18 卷提供,为白色结晶性粉末,分子式 C6H4Cl2O。试验所用丙酮等试剂均为分析纯。1.2 供试土壤土壤采集于常州市滨江化工园区无污染的林地,去除石子树枝等杂物后自然风干,过 10 目筛备用。经测定,该土壤 pH 为 7.520.17,有机质含量(17.691.08)g kg-1,其中未检出 2,4-DCP。1.3 试验方法1.3.1 蚯蚓清肠将蚯蚓放于培养皿中,清水洗去表皮泥土及排泄物,纱布擦干多余水分。随后将蚯蚓置于经蒸馏水打湿的滤纸上,黑暗环境下清肠 1 d。1.3.2 滤纸法染毒及 2,4-DCP 浓度设计滤纸染毒参考 OECD No.207 方法16,称 0.5 g的 2,4-DCP 溶于 40 mL 丙酮中制成 12.5 gL-1的2,4-DCP 丙酮溶液,取若干直径 9 cm 培养皿,用移液枪吸取 4 mL 丙酮于各培养皿中,再分别吸取160、165、170、175、180、185、190、195、200、205 L的 2,4-DCP 丙酮溶液于各培养皿中,即得 70.74、72.95、75.16、77.37、79.58、81.79、84.00、86.21、88.42、90.63 g cm-2这 10 个浓度梯度(空白对照组不添加),放入裁剪好的滤纸使其刚好浸泡在培养皿底部。考虑 2,4-DCP 具有挥发性,待丙酮挥发完全后即在每个培养皿中滴加 4 mL 蒸馏水以保持滤纸完全湿润,随后于培养皿中投加 5 条若蚓期或成蚓期的蚯蚓,用带小孔的塑料薄膜封住,橡皮筋固定,放于温度(232)、空气湿度 70%、黑暗的培养箱中,每组试验 3 个平行,24、48 和 72 h 观察蚯蚓状态及死亡情况,若针头刺激蚯蚓头部和尾部均无反应则认定死亡。1.3.3 土壤染毒和两室趋避试验设计土壤染毒方法参考 OECD No.222 方法17:取600 g 风干后的土壤于若干带盖塑料盒中,分别吸取 96、240、480、720、960、1 200 L 浓度为 12.5 gL-1的 2,4-DCP 丙酮溶液于各塑料盒中土壤表面,待丙酮挥发后通过搅拌和盖上盖子摇晃的方式使土壤与 2,4-DCP 混合均匀,即得浓度为 2、5、10、15、20、25 mg kg-1的 2,4-DCP 污染土壤。两室趋避试验参考 ISO 17512-1 方法18:取长16.5 cm、宽 11.9 cm、高 6.2 cm 的带盖塑料盒,于塑料盒中间插入一厚度 0.5 cm 隔板,两侧分别放入清洁土壤和不同浓度 2,4-DCP 染毒土壤600 g,控制含水率为 35%后抽出隔板并投 12 条蚯蚓于原隔板处缝隙中,盖上盖子防止蚯蚓逃逸,在盖子上扎若干 2mm 左右孔洞以保持通风,48 h 后计算两侧的蚯蚓个数,处于原先隔板处的蚯蚓按半条计算,每组试验设 3 个平行。1.3.4 蚯蚓组织切片制备根据试验过程中所观察的蚯蚓形态学变化,采用苏木精-伊红染色制备蚯蚓组织切片以观察 70.74g cm-2和 88.42 gcm-2浓度下滤纸法暴露 24 h时蚯蚓表皮和肠道细胞变化。具体操作为:蚯蚓用0.86%(mV)NaCl 溶液冲洗后,放于培养皿中,加入?少量蒸馏水,滴入无水乙醇麻痹蚯蚓后,将蚯蚓拉直放于滤纸上,吸干表面水分用刀片于生殖环后 1 cm处切取 0.5 cm 放于 10%(VV)福尔马林溶液中固?定24 h。在自动脱水机中脱水后,石蜡包埋,切片机切成 5 m 左右切片,在 200 倍数光学显微镜(Axio-Vert.A1)下观察组织变化情况。1.3.5 蚯蚓体内蛋白质含量、SOD 活性、CAT 活性测定 通过计算得出半致死浓度(LC50)后,于亚致死浓度 13.26、26.52、39.79、53.05、66.32 gcm-2条件下,分别于 24、48 和 72 h 对蚯蚓进行蛋白质含量、SOD 活性和 CAT 活性测定,测定均采用南京建成提供的试剂盒。在生化分析之前,先用蒸馏水清洗蚯蚓表面。加入蚯蚓质量 9 倍体积的 0.86%(mV)?NaCl 溶液,于4 下搅碎。随后将匀浆液以4 000 r min-1离心 10 min。保留上清液以测定蛋白质含量、SOD 活性和 CAT 活性,酶活性单位为 Umg-1,以单位蛋白质量计。1.3.6 数据处理使用 SPSS 27.0 软件对实验数据进行统计分析。采用 Probit 概率单位回归法算出各浓度梯度及时间下 2,4-DCP 对蚯蚓的 LC50值和置信区间。数值以平均数标准差呈现,对同一时间不同浓度梯度暴露下蚯蚓各项生物指标进行单因素方差分析(ANOVA),若有显著差异则进行 LSD 多重比较来检验组间差异显著性,P0.05、P0.01 表示差异显著。?统计图均由 Origin 2022 软件绘制。2 结果(Results)2.1 2,4-DCP 对蚯蚓的急性毒性各浓度梯度下若蚓、成蚓死亡情况数据分别见表 1、表 2。将表 1、表 2 数据使用 SPSS 27.0 中 Probit 程序第 4 期李哲等:2,4-DCP 对若蚓期、成蚓期赤子爱胜蚓毒性效应研究489 进行回归性分析,结果如表 3 所示。当 2,4-DCP 浓度为 70.74 gcm-2时,24 h 内蚯蚓均无死亡现象,48 h 时发现若蚓期蚯蚓出现个别死亡现象。随着 2,4-DCP 浓度的升高,蚯蚓的死亡率逐渐上升,当浓度高于 88.42 gcm-2时,24 h 后几乎无存活蚯蚓。由 SPSS 软件算出,若蚓期蚯蚓 24 h、48 h、72 h的 LC50分别为 80.71、76.20、73.64 gcm-2,成蚓期蚯蚓 24 h、48 h、72 h 的 LC50分别为 82.88、77.63、74.65 gcm-2,略高于若蚓期,表明蚯蚓在不同生长阶段对 2,4-DCP 的耐受度略有差异。表 1 2,4-DCP 滤纸接触法若蚓死亡情况Table 1 Death of earthworms of growth stage by 2,4-DCP filter paper contact method浓度/(g cm-2)Concentration/(g cm-2)24 h 死亡数24 h death number48 h 死亡数48 h death number72 h 死亡数72 h death number123123123死亡率/%Mortality/%CK00000000000068.5300000000000070.7400001001006.676.6772.95000121133026.6746.6775.1611212334526.67408077.3721134344526.6766.6786.6779.582433445556073.3310081.793215535554086.6710084.002435555556010010086.213455555558010010088.42555555555100100100注:CK 为空白对照组,2,4-DCP 表示 2,4-二氯酚。Note:CK is the blank control group,and 2,4-DCP stands for 2,4-dichlorophenol.表 2 2,4-DCP 滤纸接触法成蚓死亡情况Table 2 Death of earthworms of adult stage by 2,4-DCP filter paper contact method浓度/(g cm-2)Concentration/(g cm-2)24 h 死亡数24 h death number48 h 死亡数48 h death number72 h 死亡数72 h death number123123123死亡率/%Mortality/%CK00000000000068.5300000000000070.74000000010006.6772.95000112132026.674075.1610122342513.3346.6773.3377.3721132235326.6746.6773.3379.5811223344426.6753.338081.7923335355553.3373.3310084.0023244555546.6786.6710086.2134454555573.3393.3310088.4232555555566.6710010090.6345455555586.6710010092.84555555555100100100注:CK 为空白对照组。Note:CK is the blank control group.490 生态毒理学报第 18 卷 如图 2 所示,随着 2,4-DCP 浓度升高,蚯蚓接触滤纸的反应产生显著变化。空白对照组(图 2(a)中,蚯蚓未发生中毒和死亡现象;2,4-DCP 暴露浓度为70.74 75.16 gcm-2时,虽蚯蚓无明显死亡现象,但滤纸周围出现可见的黄色液体,个别蚯蚓出现浮肿现象(图 2(b),且蚯蚓多出现在滤纸边缘和底部,具有明显逃避行为(图 2(c);当 2,4-DCP 浓度为77.37 79.58 gcm-2时,蚯蚓出现蜷缩现象(图 2(d),并且死亡数目明显增多;当浓度为 81.79 86.21 g cm-2时蚯蚓出现部分环节肿大、躯体颜色变透明、躯体萎缩、断节等现象并大幅度出现死亡(图 2(e)、图 2(f);当浓度达到 88.42 92.48 g cm-2时基本均出现生殖环等环节肿大并渗血现象且死亡时间显著缩短(图 2(g);试验还发现当 2,4-DCP 暴露浓度高于 92.84 g cm-2时,蚯蚓的反应为不停扭动并排出大量黄色液体后死亡(图 2(h)。2.2 蚯蚓对 2,4-DCP 污染土壤的趋避效应两室趋避性试验结果如图 3 所示,由图 3 可知,若蚓和成蚓对试验中各浓度 2,4-DCP 污染土壤的趋避性结果无明显差异。空白对照组中,两室均为清洁土壤,设定此时蚯蚓于两室土壤中分布均匀。随着污染土壤中 2,4-DCP 浓度升高,清洁土壤中蚯蚓表 3 滤纸接触法测得 2,4-DCP 对若蚓和成蚓的 LC50Table 3 LC50of 2,4-DCP on growth and adult stage earthworm measured by filter paper contact method阶段Stage接触时间/hContact time/h毒性回归方程Toxicity regression equations卡方值Chi-square显著性Sig.LC50(95%置信限)/(g cm-2)LC50(95%CL)/(g cm-2)若蚓Growth stageearthworms24Y=32.841x-62.6263.0620.80180.712(77.735 83.860)48Y=43.829x-82.4840.7090.99476.196(73.882 78.482)72Y=72.249x-134.8960.8800.92773.636(71.692 75.407)成蚓Adult stageearthworms24Y=29.619x-56.8221.9170.98382.881(79.926 85.929)48Y=33.204x-62.7571.6630.97677.630(74.593 80.195)72Y=48.936x-91.6592.1370.83074.650(72.316 76.759)图 2 2,4-DCP 滤纸接触法蚯蚓中毒现象照片注:(a)空白对照组(即正常的蚯蚓);(b),(c)70.74 75.16 g cm-2浓度组;(d)77.37 79.58 g cm-2浓度组;(e),(f)81.79 86.21 g cm-2浓度组;(g)88.42 92.84 g cm-2浓度组;(h)92.84 g cm-2以上浓度组。Fig.2 Photos of earthworm poisoning by 2,4-DCP filter paper contact methodNote:(a)CK;(b),(c)70.74 75.16 g cm-2concentration group;(d)77.37 79.58 g cm-2concentration group;(e),(f)81.79 86.21 g cm-2concentration group;(g)88.42 92.84 g cm-2concentration group;(h)92.84 g cm-2above concentration group.第 4 期李哲等:2,4-DCP 对若蚓期、成蚓期赤子爱胜蚓毒性效应研究491 图 3 若蚓(a)和成蚓(b)对不同浓度 2,4-DCP 污染土壤的趋避性Fig.3 The repellency of growth stage earthworms(a)and adult stage earthworms(b)from soilscontaminated by 2,4-DCP at different concentrations图 4 蚯蚓表皮和肠道细胞组织变化图注:(a),(d)空白对照组(即正常的蚯蚓体壁和肠道结构);(b),(e)70.74 g cm-2浓度暴露 24 h 蚯蚓表皮和肠道结构;(c),(f)88.42 g cm-2浓度暴露 24 h 蚯蚓表皮和肠道结构;EP 表示表皮,CM 表示环肌,LM 表示纵肌,IE 表示肠上皮细胞,CT 表示黄色细胞。Fig.4 Changes in the epidermis and intestinal cells of earthwormsNote:(a),(d)The body wall and intestinal structure of earthworm in CK;(b),(e)Epidermis and intestinal structure of earworms exposed to70.74 g cm-2for 24 h;(c),(f)Epidermis and intestinal structure of earworms exposed to 88.42 g cm-2for 24 h;EP means epidermis;CM means circular muscle;LM means longitudinal muscle;IE means intestinal epithelium;CT means chloragogenous tissue.的占比逐渐增大,蚯蚓的趋避性越明显。污染土壤中 2,4-DCP 浓度达到 10 mgkg-1时,处于清洁土壤中的蚯蚓数目达到投放总数的 80%。于 15 mgkg-1及以上浓度的 2,4-DCP 污染土壤中,也可观察到少数蚯蚓,其大多出现在原先隔板的缝隙处和污染土壤中靠近原先隔板处的土壤表面,并具有和滤纸法染毒相似的中毒症状。2.3 2,4-DCP 对蚯蚓细胞组织的影响暴露于 2,4-DCP 中的蚯蚓体壁和肠道组织细胞结构变化见图 4。如图 4(a)和图 4(d)所示,空白对照组中蚯蚓体壁和肠道组织细胞具有规则和完整的细胞结构。如图 4(b)和图 4(c)所示,暴露于 70.74 gcm-2和 88.42 g cm-2浓度下 24 h 蚯蚓体壁组织细胞结构,与空白对照组相比,蚯蚓表皮受损,结构完整性消失,部分环肌出现细胞形态和肌纤维组织的消失和坏死,细胞间隙扩大,在纵肌也观察到相同变化,但环肌和纵肌变化均不明显(图 4(b)。如图 4(c)所示,蚯蚓表皮出现严重的溃烂和坏死,部分部位的492 生态毒理学报第 18 卷上皮细胞近乎完全分解,与空白对照组比较,其表皮、纵肌的组织和染色特征均有显著变化,大面积坏死,横肌萎缩,纵肌出现大量空隙,结构完整性发生彻底变化。同时,如图 4(e)和图 4(f)所示,蚯蚓的黄色细胞和肠上皮组织也发生了组织病理学变化。在暴露于70.74 g cm-2和 88.42 g cm-2浓度下 24 h蚯蚓肠道组织细胞结构变化图中,可以观察到黄色细胞发生明显破损,细胞开始破裂并失去形状,但肠上皮细胞未受明显影响(图 4(e)。随着浓度的升高,黄色细胞和肠上皮细胞均出现坏死迹象,且与空白对照组相比,黄色细胞和肠上皮细胞彻底变性,肠上皮细胞几乎完全坏死,绒毛变疏松并与肠壁分离(图4(f)。2.4 2,4-DCP 对蚯蚓体内蛋白质含量的影响如图 5 所示,各浓度 2,4-DCP 暴露下,若蚓期和成蚓期蚯蚓接触滤纸 24 h 时,其体内的蛋白质含量均高于空白对照组,随浓度增加呈现先上升后降低的趋势,且均于 39.79 gcm-2浓度达到峰值,与空白对照组具有显著差异(P0.01);低浓度(13.26 g?cm-2、26.52 g cm-2)暴露下,若蚓体内蛋白质含量高于成蚓,可见在试验前 24 h 内若蚓比成蚓对低浓度 2,4-DCP 表现更敏感。48 h 和 72 h 蚯蚓体内的蛋白质含量随浓度增加无明显规律性,同一浓度下24、48 和72 h 之间差异随着浓度升高而增大,中、高浓度(39.79 gcm-2、53.05 gcm-2)暴露下其变化幅度明显高于低浓度。2.5 2,4-DCP 对蚯蚓体内 SOD 活性的影响试验期间蚯蚓体内 SOD 活性变化见图 6。如图 6(a)所示,3 个时间段若蚓体内 SOD 活性随浓度升高均呈现出先上升后下降的趋势。24 h 时,低浓度(13.26 g cm-2、26.52 g cm-2)暴露下,若蚓体内SOD 活性显著高于空白对照组(P0.05),而高浓度?(53.05 gcm-2、66.32 gcm-2)则显著低于空白对照组(P0.01),表现出明显的低剂量刺激和高剂量抑制效应。随着暴露时间的延长,各浓度下蚯蚓体内SOD 活性总体呈现下降趋势。成蚓体内 SOD 活性变化见图 6(b),其总体变化规律与若蚓相似,暴露于 13.26 gcm-2和 39.79 gcm-2浓度下 24 h时,若蚓体内 SOD 活性高于成蚓,而高浓度(53.05g cm-2、66.32 gcm-2)暴露下各时间段却均低于成蚓。2.6 2,4-DCP 对蚯蚓体内 CAT 活性的影响由图 7 可知,各浓度 2,4-DCP 暴露下,蚯蚓体内CAT 活性基本均高于空白对照组,表明 2,4-DCP 激发了蚯蚓体内的 CAT 活性。同浓度梯度下,48 h 时CAT 活性均高于 24 h,而 48 h 后大多有所下降。若蚓体内 CAT 活性变化如图 7(a)所示,试验的 3 个时间段若蚓体内 CAT 活性随浓度升高均呈现先上升后降低趋势,24 h 于53.05 g cm-2达到峰值,而48 h 和72 h 于 39.79 g cm-2处达到峰值,均与空白对照组具有显著差异(P0.01)。成蚓体内 CAT 活性变化如?图 7(b)所示,其各时间段变化趋势与若蚓相似,24 h成蚓体内 CAT 活性达到峰值处的 2,4-DCP 浓度与若蚓相同,但 48 h 和 72 h 达到峰值处浓度高于若蚓,为 53.05 g cm-2。图 5 若蚓(a)和成蚓(b)体内蛋白质含量的变化注:与对照组相比差异显著,*表示P0.05,*表示P0.01。Fig.5 Changes of protein content in growth stage earthworms(a)and adult stage earthworms(b)Note:Compare with the control,there is significant difference;*representsP0.05,and*representsP0.01.第 4 期李哲等:2,4-DCP 对若蚓期、成蚓期赤子爱胜蚓毒性效应研究493 图 6 若蚓(a)和成蚓(b)体内 SOD 活性变化注:与对照组相比差异显著,*表示P0.05,*表示P0.01。Fig.6 Changes of SOD content in growth stage earthworms(a)and adult stage earthworms(b)Note:Compare with the control,there is significant difference;*representsP0.05,and*representsP0.01.图 7 若蚓(a)和成蚓(b)体内 CAT 活性变化注:与对照组相比差异显著,*表示P0.05,*表示P0.01。Fig.7 Changes of CAT content in growth stage earthworms(a)and adult stage earthworms(b)Note:Compare with the control,there is significant difference;*representsP0.05,and*representsP0.01.3 讨论(Discussion)2,4-DCP 作为农药、除草剂和杀虫剂的主要合成原料之一,在我国被广泛使用,已普遍存在于农业土壤和自然水体中。Fan 等19和 Gao 等20对近几年来我国地表水 2,4-DCP 的污染状况进行了调查,其中 2,4-DCP 在黄河、淮河和海河等流域中被频繁发现,具有不容忽视的潜在健康风险。目前,已有较多文献报道了 2,4-DCP 对水生动物的毒性效应,Tsukazawa 等21的研究表明,斑马鱼幼鱼暴露于 2,4-DCP 浓度为 2.5 mgL-1的水体中 5 d 时,可观察到脂质积累和 ROS 诱导;Hu 等22发现,2,4-DCP 可通过干扰性激素合成来诱导鱼类雌性化。但目前关于2,4-DCP 对土壤环境中生物的影响却鲜有报道,蚯蚓作为评价土壤环境的指示生物,其表现出的毒性效应对 2,4-DCP 污染的早期预警和生态危险评估具有重要作用。本研究采用滤纸接触法和两室趋避试验观察了2,4-DCP 对若蚓期和成蚓期 2 个生长阶段赤子爱胜蚓的毒性效应。滤纸接触法可使蚯蚓与滤纸上的污染物直接接触,从而快速、准确地评估出毒物对细胞的毒性效应23。两室趋避试验则可以灵敏地反映出蚯蚓对污染物的趋避响应,已广泛用于各种土壤污494 生态毒理学报第 18 卷染评估中。蚯蚓的很多感官细胞对化学刺激非常敏感,在滤纸接触试验中,污染物附着在滤纸的表面,并经由蚯蚓的皮肤进入体腔,被输送至躯体的各个部位,从而引起中毒24。试验过程中,随着 2,4-DCP 浓度的增加,蚯蚓出现了浮肿、蜷缩、生殖环等部分环节肿大并渗血、躯体萎缩、断节、黄色液体渗出和躯体颜色变透明等现象。主要原因为 2,4-DCP 在与蚯蚓皮肤接触后,与体腔内的细胞发生交互作用,从而产生上述现象。蚯蚓流出的黄色液体和血水,很有可能是体腔液中的一种成分,受到污染物刺激后,从角质膜的小孔中排出,浮肿、蜷曲等反应都是蚯蚓对抗外来污染物的自身防御机制25。蚯蚓与潜在的致命和非致命源接触时,会产生巴普洛夫条件反射,从而避免污染,这就是所谓的“趋避”26。土壤生态风险评价中,蚯蚓对污染物的趋避效应较于急性毒性更为敏感,可快速诊断环境风险27。相关研究表明,趋避实验中,若清洁土壤中的蚯蚓数高于投加总数的 80%,即趋避行为明显,该污染浓度下不宜蚯蚓生存28。本次两室趋避实验中,当土壤中2,4-DCP 浓度达到10 mg kg-1时,清洁土壤中若蚓和成蚓的比例均高于 80%,即表现出明显的趋避行为;蚯蚓接触到各浓度 2,4-DCP 污染土壤的 48 h 内,做出了不同程度的趋避响应,土壤中2,4-D