CCNO基因在宫颈癌中的表达及其对宫颈腺癌Hela细胞增殖、凋亡的影响.pdf

中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 5 CCNO基因在宫颈癌中的表达及其对宫颈腺癌Hela细胞增殖、凋亡的影响 陈升才1 潘红霞2 向玲媛2 吴南昌1 王 静1（通讯作者）1.右江民族医学院附属医妇科，广西 百色 533000 2.右江民族医学院，广西 百色 533000 摘要：摘要：目的 阐明 Cyclin O（CCNO）基因在宫颈癌中的表达情况，研究 CCNO 基因表达下调对宫颈腺癌 Hela 细胞增殖、细胞周期分布和凋亡的影响，揭示在人类宫颈癌发生发展过程中该基因所起的作用，从而为宫颈癌的靶向治疗提供新的靶点。方法 应用免疫荧光技术检测 CCNO 在人宫颈癌（n=35）及其癌旁组织（n=35）中的表达情况；设计靶向于 CCNO 的小干扰 RNA（CCNO-siRNA）并转入 HeLa 细胞中，通过 Western blot 检测 siRNA 干扰 CCNO 表达的效率；采用 CCK-8 实验和流式细胞术，检测干扰 CCNO 基因表达在 HeLa 细胞增殖、细胞周期分布和凋亡中的作用。结果 免疫荧光结果显示 CCNO 基因在宫颈癌组织中的表达显著高于癌旁组织（p0.001），差异具有统计学意义；Western blot 结果显示，转染 CCNO-siRNA 可以有效下调 HeLa 细胞中 CCNO 蛋白的表达；CCK-8 实验及流式细胞术检测结果显示：干扰 CCNO 表达显著抑制细胞增殖，G0/G1 期细胞比例上升，而 S 期细胞所占比例下降，并且细胞凋亡比例明显上升（p0.05）。结论 CCNO 在宫颈癌组织中高表达，通过转染 siRNA 靶向干扰 HeLa 细胞中 CCNO 基因的表达，可有效地抑制细胞增殖，引起细胞周期阻滞和促进细胞凋亡。关键词：关键词：宫颈癌；CCNO 基因；小干扰 RNA；细胞增殖；细胞周期；细胞凋亡 中图分类号：中图分类号：R737 Expression of CCNO gene in cervical cancer and effect of CCNO silencing on the proliferation and apoptosis in human cervical cancer HeLa cells CHEN Shengcai1 PAN Hongxia 2 XIANG Lingyuan2 WU Changchang1 WANG Jing1(Corresponding author)1.Department of Gynecology,Youjiang Medical College for Nationalities,Guangxi Baise 533000 2.Youjiang Medical College for Nationalities,Guangxi Baise 533000 Abstract:Objective To clarify the expression of Cyclin O(CCNO)in cervical cancer and investigate the effects of CCNO gene silencing on the proliferation,cell cycle distribution and apoptosis in human cervical cancer HeLa cells in vitro.And to further reveal the role of CCNO gene in the genesis and development of human cervical cancer,and provide a novel target for cervical cancer treating.Methods The expressions of CCNO in cervical cancer(n=35)and adjacent normal tissues(n=35)were detected by immunofluorescence.The efficacy of CCNO gene silencing mediated by small interfering RNA(CCNO-siRNA)in HeLa was tested by western blot.And using the CCK-8 assay and flow cytometry,the impacts of CCNO gene knockdown on proliferation,cell cycle distribution,and apoptosis were examined.Results The results of immunofluorescence showed that CCNO expression in human cervical cancer was significantly higher than in adjacent normal tissues(p0.001).And CCNO-siRNA used in this study effectively inhibited the expression of CCNO in HeLa cells.Consequently,CCNO gene silencing resulted in the significant inhibition of proliferation,increase 中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 6 of cells in G0/G1 phase but decrease of cells in S phase and enhanced apoptosis(p0.05).Conclusion CCNO gene was overexpressed in cervical cancer,and siRNA mediated CCNO gene silencing can efficiently inhibit proliferation of HeLa cells as well as cause cell cycle arrest and enhance apoptosis in HeLa cells.Key words:Cervical cancer;CCNO gene;small interfering RNA;Cell proliferation;Cell cycle;Apoptosis 0 引言 宫颈癌是常见女性恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率高居女性恶性肿瘤第 4 位，且其发病趋势呈现年轻化1。由于缺少重大治疗进展，从 1970 年代中期开始，宫颈癌的总体存活率没有明显提高2。因此，对于宫颈癌的预防和治疗仍面临较大挑战。除人类乳头状瘤病毒（HPV）感染外3，在宫颈癌发生发展的过程中，多种基因的异常表达是其重要原因。CCNO 基因位于染色体 5qll.2 上，编码细胞周期蛋白 Cyclin O4。Cyclin O 被证明参与调控基因修复和细胞周期，同时通过与CDK2 结合参与调控内源性凋亡信号通路5。更重要的是，运用 RNA 测序（RNA-Seq）技术，研究发现，宫颈癌组织中 Cyclin O 的表达水平明显高于癌旁组织，说明 CCNO 基因与宫颈癌的发生、发展可能密切相关6。通过免疫荧光技术，本研究揭示了 CCNO基因在宫颈癌中的表达情况。并且设计了小干扰 RNA(siRNA)靶向干扰 CCNO 基因的表达，观察将 CCNO 下调后，人类宫颈癌 HeLa 细胞增殖、细胞周期以及凋亡所受到的影响，同时探讨了其可能的分子机制。本研究将揭示CCNO基因在人类宫颈癌发生发展过程中的作用，为靶向及个性化治疗宫颈癌提供新靶点新思路。1 材料与方法 1.1 主要材料和试剂 组织标本选自本院妇科 2017 年 5 月至 2019 年 4月收治的宫颈腺癌患者，剔除术前接受过放射治疗、化学治疗及未能获取满意效果而存档石蜡组织标本者。实验组癌灶组织 35 份，对照组癌旁组织 35 份；人宫颈腺癌 HeLa 细胞株购自上海细胞库（TCHU187，中国上海细胞典藏委员会）；Gibco 公司提供 DMEM 培养基、胎牛血清和胰酶；Invitrogen公司提供Lipofectamine 2000 转染试剂和 Opti-MEM 培养基；细胞周期检测试剂盒、Annexin V-FITC、Propidium Iodide 以及 Binding Buffer 购自 BD 生物科技有限公司；CCK-8 试剂购自Dojingdo 分子技术公司；CCNO 单抗和-actin 抗体购自 Santa cruz 公司；免疫荧光二抗购自 Dako 公司；ECL 化学发光液购自南京凯基生物公司。阴性对照 siRNA（Control-siRNA）和 CCNO siRNA（CCNO-siRNA）序列由苏州吉玛基因股份有限公司合成。1.2 实验方法 1.2.1 组织免疫荧光染色 石蜡切片脱蜡、经梯度酒精脱水，进行抗原修复。1TBST 漂洗，在 37用羊血清封闭 30 min，随后以CCNO 一抗（1:200）在室温下震荡孵育 1 h。而后 1TBST 漂洗，滴加荧光二抗室温下避光孵育 45 min。再次 1TBST 漂洗，然后 TSA 染色和 DAPI 染核后封片，倒置荧光显微镜下拍照分析。1.2.2 组织免疫荧光评分 根据综合考虑阳性细胞率与染色强度，对样本进行全面评估。每个组织样品随机选取 5 个不同视野，计算 CCNO 阳性细胞率（绿色荧光细胞数/蓝色荧光细胞数100%）并评分，阳性细胞率1%，计0分；2%-25%，计 1 分；26%-50%，计 2 分；，51%-75%，计 3 分；75%，计 4 分。染色强度评分：无染色，计 0 分；弱，计 1分；中等，计 2 分；强，计 3 分。免疫荧光评分阳性细胞率染色强度。1.2.3 细胞培养及 siRNA 转染 HeLa 细胞加入含 10%小牛血清、100 g/mL 青霉素和 100 g/mL 链霉素的 DMEM 培养基，置于 37、5CO2的培养箱中孵育。siRNA 序列如下：CCNO-siRNA 正义链 5-GUACUUCCUUGACUCACAUTT-3，反义链 5-AUGUGAGUC AAGGAAGUACTT-3；Control-siRNA 正义链 5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，反义链 5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3。在 6 孔板接种 HeLa 细胞，待转染前细胞汇合度达 70-80%，用 Lipofectamine 2000 将 20 nmol siRNA 转入到每孔对应细胞中。转染操作参照 Lipofectamine 2000 说明书执行。1.2.4 Western blot 检测蛋白表达水平 转染 siRNA 48 h 后，加入 RIPA 裂解液裂解细胞，中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 7 提取总蛋白。采用 BCA 法测定样品蛋白浓度。将蛋白样品与 5loading buffer混合后，于 95变性 7 min。采用 SDS-PAGE 胶（10分离胶+5浓缩胶）进行蛋白分离，每次上样 40 g。电泳结束后转膜，转移蛋白至 PVDF 膜上，条件为 300 mA 90 min。结束转膜后，将 PVDF 膜置于 TBST 配制的 5脱脂奶粉中，室温下封闭 1 h。之后加入 CCNO 抗体（1:1000）和-actin 抗体（1:1000），于 4冰箱中孵育过夜。洗去未结合的一抗后，加入 HRP 标记的山羊抗兔二抗(1:2000)，于室温下孵育 1 h，然后洗去未结合的二抗。滴加 ECL化学发光液，于暗室中曝光并摄取图片。利用 Image J 软件分析蛋白条带灰度值。1.2.5 CCK-8 法检测细胞增殖 转染 siRNA 24 h 后，相应细胞经胰酶消化后再接种于 96 孔板中（5000 个细胞/孔），各组细胞均设 3个复孔，另将无细胞培养液孔设置为空白对照。细胞接种 24、48、72 和 96 h 后分别加入 CCK-8 溶液（每100 L 培养基中加 10 L CCK-8 溶液）检测吸光值。37孵育 1 h，而后用酶标仪检测 450 nm 处的 OD 值。1.2.6 流式细胞术检测细胞周期 siRNA 转染 48 h 后，用胰酶消化细胞（保留上清）并离心收集细胞。用预冷的 PBS 清洗细胞，再加入 1 mL70%预冷乙醇，-20固定 24 h。再用预冷的 PBS清洗固定后的细胞，然后用新配置的染色液（500 L染色缓冲液+25 L 20PI 染色液+10 L 50RNase A）室温下染色 30 min。完成染色后，用流式细胞仪检测细胞，并用 FlowJo 软件（10.5.4 版本）拟合分析各群细胞的比例。1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡 siRNA 转染 72 h 后，用不含 EDTA 的胰酶消化细胞，注意需保留上清。室温下 2000 rpm 离心 5 min 收集细胞。用预冷的PBS重悬细胞，再次2000 rpm离心5 min，沉淀细胞。添加 100 L 1Binding Buffer 重悬细胞后，再分别添加5 L Annexin V-FITC 和5 L PI，冰上避光孵育 15 min，补加 400 L 1Binding Buffer，用流式细胞仪检测凋亡细胞。1.3 统计学分析 用 SPSS（17.0）统计分析数据，采用xs 表示数值，采用双尾 t 检验和 K-W 检验进行统计学差异分析，设置 p0.05）；但当细胞接种 48 h 时，CCNO-siRNA 组细胞OD值低于对照组，且差异具有统计学意义（p0.05）；随着检测时间的延长（72 和 96 h），两者间的差异更加明显。表明干扰 CCNO 表达抑制 HeLa 细胞增殖，且呈现时间依赖性。2.4 下调 CCNO 表达引起 HeLa 细胞周期阻滞 转染 CCNO-siRNA 48 h 后，CCNO 表达水平下降对HeLa 细胞周期的影响如图 4 所示。Control-siRNA 组处于 G0/G1、S 和 G2/M 期的细胞比例分别为 53.002.33%、32.602.53%和 14.403.77%，而 CCNO-siRNA组则是63.643.32%、23.832.78%和12.530.85%。中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 8 CCNO-siRNA 组处于 G0/G1 期的细胞比 Control-siRNA组多约 10.64%（p0.05），而处于 S 期的细胞则减少约 8.77%（p0.05），处于 G2/M 期的细胞则在两组间无显著性差异。结果表明，下调 CCNO 表达造成 HeLa细胞处于 G0/G1 期的细胞显著增多，细胞周期发生阻滞。注：*p0.05 vs Control-siRNA 组，*p0.01 vs Control-siRNA 组 图 3 转染 CCNO-siRNA 对 HeLa 细胞增殖的影响 2.5 下调 CCNO 表达促进 HeLa 细胞凋亡 转染 CCNO-siRNA 72 h 后，CCNO 表达下调对 HeLa细胞凋亡的影响如图 4 所示。Control-siRNA 组发生凋亡的细胞比例为 7.750.69%，而 CCNO-siRNA 组发生凋亡的细胞比例为 15.412.11%。下调 CCNO 表达使得凋亡细胞比例增加约 7.66%（p0.05）。结果表明下调CCNO 表达促进 HeLa 细胞发生凋亡。图 4 转染 CCNO-siRNA 对 HeLa 细胞凋亡的影响 3 讨论 宫颈癌的发生发展是一个十分复杂的过程，其形成需要经历多个不同的病理阶段，涉及多种分子机制，除了 HPV 感染，还包括多种基因的异常表达7。与细胞周期调控、细胞凋亡和 DNA 修复功能相关的 p538、Bax9、p2110等基因被证明参与了对宫颈癌发生发展的调控。筛查与宫颈癌相关的新基因，将为宫颈癌的诊断和治疗提供新的策略。RNA-Seq 利用深度测序技术，对细胞或组织进行转录组测序11。相比传统测序技术，RNA-Seq，在测定新基因，以及筛查差异表达基因方面具有明显优势。向阳课题组运用 RNA-Seq 技术，分析宫颈癌组织和癌旁组织之间的差异表达基因，结果证实 CCNO 基因的表达在宫颈癌组织中高于癌旁组织6。本研究利用免疫荧光技术，测定了 35 例宫颈癌患者 CCNO 基因在癌组织和癌旁组织中的表达情况。结果与向阳课题组的发现一致，CCNO 基因在宫颈癌组织中高表达，提示 CCNO 基因可能与宫颈癌的发生发展密切相关。为明确 CCNO 基因在宫颈癌发生发展中的作用，我们检测了人宫颈腺癌 HeLa 细胞中 CCNO 基因表达被抑制后，其细胞增殖的变化。利用设计的 siRNA，实现了在HeLa细胞中对CCNO基因的有效沉默，结果发现HeLa细胞增殖受到显著抑制。结果表明，CCNO 基因具有促进 HeLa 细胞增殖的作用。CCNO 基因的编码蛋白产物是 Cyclin O。近期研究表明，Cyclin O 含有个周期蛋白特有的折叠域，并且和 Cyclin A 的氨基酸序列具有较高的同源性，因而Cyclin O 被认为是一种细胞周期蛋白12。在本研究中，CCNO 基因的下调引起 G0/G1 期的细胞增加约 10.64%，S 期的细胞则下降约 8.77%，结果显示干扰 CCNO 基因表达引起 HeLa 细胞周期发生阻滞。因此，CCNO 基因对于维持正常的细胞周期具有重要的作用。凋亡是一种程序性细胞死亡方式，凋亡失控是肿瘤发生的重要原因之一。通过与 CDK2 结合，CCNO 参与诱导淋巴细胞内源性的细胞凋亡信号通路13。我们的研究发现，转染 CCNO-siRNA 有效干扰 CCNO 基因表达后，HeLa 细胞的凋亡发生率上升约一倍（CCNO-siRNA组：15.412.11%；Control-siRNA 组：7.750.69%）。由此可知，CCNO 基因具有抑制 HeLa 细胞凋亡的作用。综上所述，我们的研究证实了 CCNO 基因在宫颈癌组织中异常高表达，且发挥了维持宫颈癌细胞周期转化、抑制细胞凋亡和促进细胞增殖的重要作用。本研究为将CCNO基因作为潜在的宫颈癌诊断和预后评价的分子标志物，以及作为宫颈癌治疗的可能靶标提供了理论支持。参考文献 1Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,Siegel RL,Torre LA,Jemal A.Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries J.CA:中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 9 A Cancer Journal for Clinicians,2018,68(6):394-424.2Jemal 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