Bay 60-7550对脊髓损伤大鼠机械痛阈及细胞极化的影响.pdf

731 中国疼痛医学杂志 Chinese Journal of Pain Medicine 2023,29(10)doi:10.3969/j.issn.1006-9852.2023.10.003Bay 60-7550 对脊髓损伤大鼠机械痛阈及细胞极化的影响*杨文洁1 孙 涛1 韩 杰1 杨 磊2 王珺楠1（1山东第一医科大学附属省立医院疼痛科，济南 250021；2山东大学威海市立医院疼痛科，威海 264200）摘 要 目的：探讨选择性磷酸二酯酶-2A(phosphodiesterase-2A,PDE2A)抑制剂 Bay 60-7550 对脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后神经病理性疼痛(neuropathic pain,NP)模型大鼠机械痛阈的影响及其可能机制。方法：雄性 SPF 级 SD 大鼠随机分为 4 组：假手术组（Sham 组）、模型组（SCI 组）、给药组（Bay 60-7550 组）和溶媒组（vehicle 组）。术前 1 天至术后 21 天采用von Frey 纤维丝间断测试大鼠后爪机械痛阈值。免疫组化和 Western blot 检测大鼠脊髓组织中 PDE2A 表达。流式细胞术检测 M1/M2 型小胶质细胞/巨噬细胞极化比例；qRT-PCR 检测小胶质细胞/巨噬细胞及其下游生物标志物(CD86、CD163、IL-6、IL-1、IL-10、TGF-)的表达。结果：鞘内注射Bay 60-7550可显著降低脊髓损伤大鼠的机械痛阈值。与 Sham 组相比，在 SCI 组观察到大鼠脊髓背角 PDE2A 表达增加，而 Bay 60-7550 组 PDE2A 的过表达被抑制。与 vehicle 组相比，Bay 60-7550 组脊髓促炎因子(IL-6、IL-1)表达降低、抗炎因子(IL-10、TGF-)mRNA 的表达增加。同时，还观察到鞘内注射 Bay 60-7550 可使 SCI 后小胶质细胞/巨噬细胞 M2 型比例增加，而 M1 型细胞比例降低。结论：抑制 PDE2A 的过表达能有效缓解大鼠脊髓损伤后神经病理性疼痛，其机制可能与其调节小胶质细胞/巨噬细胞的极化状态有关。关键词 磷酸二酯酶-2A；脊髓损伤；巨噬细胞；小胶质细胞；极化；神经病理性疼痛Effects of Bay 60-7550 on the mechanical pain threshold and cell polarization in rats after spinal cord injury*YANG Wenjie 1,SUN Tao 1,HAN Jie 1,YANG Lei 2,WANG Junnan 1(1 Department of Pain Medicine,Provincial Hospital Affiliated to Shandong First Medical University,Jinan 250021,China;2 Department of Pain Medicine,Weihai Municipal Hospital,Shandong University,Weihai 264200,China)Abstract Objective:To investigate the effects of Bay 60-7550,a selective phosphodiesterase-2A(PDE2A)in-hibitor,on mechanical pain threshold and its potential mechanism in the neuropathic pain(NP)using spinal cord injury(SCI)rat model.Methods:Male SD rats were randomly divided into four groups:the Sham group,SCI group,SCI+Bay 60-7550 group,and SCI+Vehicle group.The mechanical pain thresholds were evaluated by the von Frey test from the day before surgery until the 21th postoperative day.The expression level of PDE2A in the spinal cord was measured by immunohistochemistry and Western blot.The proportion of M1/M2 microglia/macrophages polarization was assessed by flow cytometry.The expression of microglia/macrophages and their downstream biomarkers(CD86,CD163,IL-6,IL-1,IL-10,TGF-)were measured by qRT-PCR.Results:In-trathecal administration of Bay 60-7550,significantly attenuated mechanical allodynia in SCI rats.Compared with the Sham group,PDE2A expression was elevated in the spinal dorsal horn of SCI rats,while the overex-pression of PDE2A was inhibited by the treatment of Bay 60-7550.Bay 60-7550 reduced pro-inflammatory factors(IL-6,IL-1)expression,increased anti-inflammatory factors(IL-10,TGF-)expression in the spinal cord com-论 著*基金项目：国家自然科学基金（81972145，81772443）；山东省自然科学基金面上项目（ZR2020MH283）；山东省中医药科技面上 项目（M-2022210）通信作者 王珺楠 junnan_2023疼痛10期内文11.indd 7312023疼痛10期内文11.indd 7312023/10/17 14:07:382023/10/17 14:07:38 732 中国疼痛医学杂志 Chinese Journal of Pain Medicine 2023,29(10)神经病理性疼痛(neuropathic pain,NP)是脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后常见且难以控制的并发症之一1。据统计，全球 SCI 发病率为 3040/（100万 年），我国各地综合发病率为 23.7/（100 万 年），其中有 53%80%的人会出现 NP 2。其临床表现复杂多样，疼痛剧烈、迁延难愈，严重影响了病人的生活质量，导致抑郁甚至自杀3。目前脊髓损伤后神经病理性疼痛(SCI-induced neuropathic pain,SCI-NP)的治疗主要有药物治疗和非药物治疗两种方案，其中药物治疗是 SCI-NP 最基础及最常用的方法，包括一线的抗惊厥药、三环抗抑郁药，二、三线的曲马多、阿片类镇痛药、非甾体抗炎药等，但长期应用药物导致的耐受性、依赖性及药物滥用等不良反应仍是临床治疗的挑战4。同时，由于 SCI-NP 具体机制复杂不明，不同病人间临床疗效个体差异较大，目前尚缺乏更有效的治疗方案。因此，积极探索 SCI-NP 的发病机制，寻找有效的药物及手术治疗靶点，是当前亟待解决的问题。SCI-NP 发病机制复杂，中枢敏化是 NP 发展和维持的基础。研究证明，SCI 后持续增加的炎症反应通过形成中枢敏化介导 NP，而损伤区小胶质细胞/巨噬细胞极化失衡在形成中枢敏化过程中发挥重要作用5。文献表明，小胶质细胞/巨噬细胞表型转换是一个动态重叠的过程6，改善抗炎微环境，逆转其极化失衡，可能是更具优势的 SCI-NP 治疗策略。环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)和环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophos-phate,cGMP)是细胞内重要的第二信使，已被证明对细胞免疫反应具有负性调节作用7。磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDEs)是细胞内唯一可调节cAMP 和/或 cGMP 水平的关键酶，包括 11 种同工酶(PDE1-PDE11)8。其中，磷酸二酯酶-2A(phospho-diesterase-2A,PDE2A)是一种被 cGMP 刺激可同时降解 cAMP 和 cGMP 的双底物酶，其广泛分布于人体的大脑等多种组织中；近年来，PDE2A 在治疗心力衰竭、改善学习及认知功能、改善抑郁焦虑样行为等方面成为重要的研究靶点9。Beshay 等10通过小鼠体内及 RAW-264.7 巨噬细胞系体外实验证明 PDE抑制剂可抑制巨噬细胞活化和一氧化氮生成，因此也是多种免疫过程的有效调节剂。最近一项研究表明，PDE2 抑制剂 Bay 60-7550 可缓解轻度睡眠不足模型小鼠的持续术后疼痛，但 Bay 60-7550 镇痛的具体机制尚不清楚11。此外，PDE2A 在大鼠脊髓背角和背根神经节的神经元细胞中含量较丰富，并推测其在伤害性信息的处理中发挥重要作用12。然而，目前国内外尚无 PDE2A-小胶质细胞/巨噬细胞极化在SCI-NP 模型中的研究。因此，本研究通过建立大鼠SCI-NP 模型，观察选择性 PDE2A 抑制剂对 SCI-NP的抗炎和镇痛效果，探究 PDE2A-小胶质细胞/巨噬细胞极化在 SCI-NP 形成中的作用及其可能机制。方 法1.实验动物SPF 级健康 SD 大鼠，雄性，67 周龄，体重210260 g，由济南朋悦实验繁育有限公司提供 许可证号：SCXK（鲁）20190003。所有实验大鼠饲养于室温 251、湿度 45%5%、昼夜周期为12 h的鼠房中，大鼠可自由地进食水。所有动物饲养和实验操作程序已通过山东大学附属省立医院实验动物伦理委员会批准（伦理批号：NSFC:NO.2019-202）。2.主要实验药物及试剂Bay 60-7550(CAS No.:439083-90-6)和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)购自美国 Med Chem Express 公司。免疫组化一抗 PDE2A 购于武汉三鹰生物技术有限公司，山羊抗兔二抗购于山东思科捷生物技术有限公司。PCR 引物：PDE2A、CD86(cluster of differentiation 86)、CD163(cluster of differenti-ation 163)、IL-6(interleukin 6)、IL-1(interleukin 1)、IL-10(interleukin 10)、TGF-(Transforming Growth Factor-)委托上海博尚生物公司合成，Trizol RNA提取试剂盒(AG21102)、Evo M-MLV 反转录试剂预混液(AG1172)、Pro Taq HS SYBR Green 预混 qPCR试剂盒(AG11701)均购自湖南艾科瑞生物公司。流式细胞术应用抗体Granulocyte-FITC(clone HIS48)，Major Histocompatibility Complex II-PerCP-eFluor 710(MHCII-PerCP-eFluor 710)(clone OX17)和 CD11b/c-eFluor 660(clone OX42)均购自美国 eBioscience 公pared with group vehicle.Consistently,Bay 60-7550 treatment promoted the proportion of M2-type microglia/macrophages,but decreased the proportion of M1-type microglia/macrophages in SCI rats.Conclusion:Inhib-iting the overexpression of PDE2A might attenuate the development of NP in rats with neuropathic pain,and the mechanism might be related to the polarization of microglia/macrophages polarization.Keywords phosphodiesterase-2A;spinal cord injury;macrophages;microglia;polarization;neuropathic pain2023疼痛10期内文11.indd 7322023疼痛10期内文11.indd 7322023/10/17 14:07:382023/10/17 14:07:38 733 中国疼痛医学杂志 Chinese Journal of Pain Medicine 2023,29(10)司，CD172a-PE(clone OX41)购自美国BioLegend公司。3.实验分组根据既往研究13，通过预实验探索鞘内注射Bay 60-7550 的有效浓度。预实验中将大鼠随机分为3组（每组3只）：溶媒组（vehicle组）、给药组（Bay 60-7550 0.1 mg/kg 组和 Bay 60-7550 1 mg/kg 组）。根据预实验结果，正式实验大鼠随机分为 4 组（每组共 24 只大鼠，每组取 35 只分别用于分子生物学及行为学检测）：假手术组（Sham 组）、模型组（SCI 组）、给药组（Bay 60-7550 组）和溶媒组（vehicle 组）。Sham 组：仅切除椎板、鞘内置管而不损伤脊髓；SCI 组：建立大鼠脊髓损伤模型并鞘内置管；vehicle 组：脊髓损伤大鼠鞘内注射 10 l 10%DMSO（溶解Bay 60-7550粉末的溶媒组对照）；Bay 60-7550 组：脊髓损伤大鼠按照 1 mg/kg 的浓度鞘内注射 10 l Bay 60-7550。4.建立脊髓损伤模型采用改良 Allen 法建立大鼠 SCI 模型14。腹腔注射 2%阿佛丁(10 ml/kg)麻醉大鼠，待大鼠无伤害刺激反应后俯卧位固定于手术板上。分别定位大鼠髋关节和最下肋骨，以定位点为中心向头尾两侧5 cm 范围备皮，消毒铺巾。首先，于大鼠背部以 L5椎体为中心沿后正中线做约 1 cm 纵行切口，应用聚乙烯套管(PE-10)经 L5椎体下缘椎间隙垂直穿刺，将导管沿头侧端置入脊髓蛛网膜下腔，深度约 0.5 cm，此时脑脊液可从鞘内导管流出。待大鼠麻醉恢复期，鞘内注射 2%利多卡因 10 l，若出现双后肢拖拽行为或无力表现，则证明鞘内给药在合适的位置。应用3-0缝线将导管牢牢地固定于皮下并分层缝合切口。然后，以 T10椎体为中心向头、尾两侧做约 3 cm纵行切口，分离肌腱和周边肌肉组织充分暴露T9T11椎板棘突和椎板，取出切除的 T10椎板及棘突，充分暴露相应节段的脊髓。将 10 g 铁棒沿玻璃管从 30 mm 高度垂直下落撞击脊髓，建立 SCI 模型，术后充分止血缝合。术后每日 1 次肌内注射青霉素 20104 U，连续 5 天预防感染。将大鼠放回干净温暖的笼内饲养恢复。此后每日人工排尿 2 次(6:008:30 和 16:3018:00)，直至损伤大鼠可连续3 天自行排尿。5.鞘内注射给药Bay 60-7550 溶液现用现配；给药前将 Bay 60-7550 固体粉末溶解于 10%DMSO 中，使溶液 pH 值调整为 7.4。预实验中，异氟醚麻醉下，Bay 60-7550 0.1 mg/kg 组经大鼠鞘内导管注射 10 l Bay 60-7550(0.1 mg/kg)；Bay 60-7550 1 mg/kg 组经鞘内导管注射 10 l Bay 60-7550(1.0 mg/kg)；vehicle 组鞘内注射相同剂量的 DMSO(10 l)。正式实验中，异氟醚麻醉下，分别给 Bay 60-7550 组及 vehicle 组大鼠经鞘内导管注射 Bay 60-7550(1.0 mg/kg,10 l)或 DMSO(10 l)。预实验和正式实验均于术后每日固定时间鞘内注射 Bay 60-7550 或 DMSO(10 l/d)1 次，持续 1 周。6.机械痛阈评估采用 Chaplan 等15报道的机械痛阈评估方法来测量大鼠 50%机械刺激缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)，每组随机分配5只大鼠。为避免主观误差，观察者隐瞒实验大鼠的分组情况。在正常光照和均匀噪声条件下，测量时间固定在上午 8 点至 12 点之间，同一观察者于术前、术后第 7、10、14、17、21 天测定大鼠双后爪 50%MWT，并取双后爪 50%MWT 平均值。具体测量方法如下：将大鼠放置于底部为金属网的透明玻璃箱内，使大鼠适应测试笼环境至少30 min，直至其探索活动消失。应用 8 根von Frey纤维丝（0.4 g、0.6 g、1.0g、2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g、15.0 g，美国 Stoelting 公司生产），按“Up-Down”的方法依序刺激大鼠后爪底部中央。首先，施加2.0 g 的纤维丝，持续刺激约 68 s，观察大鼠是否出现快速缩足、舔足或摇晃反应，若出现则认定为阳性反应。在阳性反应情况下，标记结果为“X”，按顺序换用小一号的纤维丝。在阴性反应下，结果标记为“0”，并换用大一号的纤维丝刺激。当出现第 1 次前后刺激反应变化后，继续测量 4 次，结果序列用于计算 50%MWT。50%MWT 的计算公式为：50%MWT=10(Xf+)（Xf 为最后一个von Frey纤维丝力度值的对数，为阳性/阴性反应序列的对应值，=0.224）。为避免大鼠出现机械性痛觉敏化，每次刺激至少间隔 2 min。7.免疫组织化学染色术后第 7 天，用 1.2%阿佛丁(10 ml/kg)麻醉大鼠，行升主动脉插管，依次用 0.9%氯化钠注射液 200 ml 和 4%多聚甲醛 250 ml 进行心脏灌注，解剖分离 T9T10脊髓组织（每组 3 只大鼠），置于 4%多聚甲醛固定24 h。免疫组化操作按照Stephenson等12文献中描述的步骤。用距正中(T9T10)尾侧 1 mm 处相对完整的脊髓组织制备石蜡切片，厚度约为 5 m。切片经脱蜡、复水、抗原修复固定、洗涤和封闭后，与抗兔PDE2A一抗(1:150,Cat.No.:55306-1-AP)在4孵育过夜，经磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗涤后，将组织与山羊抗兔二抗(1:200)在室温2023疼痛10期内文11.indd 7332023疼痛10期内文11.indd 7332023/10/17 14:07:382023/10/17 14:07:38 734 中国疼痛医学杂志 Chinese Journal of Pain Medicine 2023,29(10)下孵育 40 min，接着用 PBS 洗涤。使用 DAB 试剂盒（山东思科捷生物技术有限公司）进行染色，并用苏木精进行复染。最后，使用奥林巴斯 BX60 显微镜（奥林巴斯光学有限公司，日本东京）对染色的组织切片进行拍照。应用 Image J 图像分析软件，根据光密度(optical density,OD)值计算图像中PDE2A 的阳性表达水平。8.Western blot 检测术后第 7 天，麻醉灌注后分别取各组大鼠T9T11节段的脊髓组织，置于液氮保存。脊髓组织称重在冰上剪碎，置于 RIPA(radio-immunoprecipi-tation assay)裂解缓冲液中匀浆提取蛋白质。根据说明书通过 BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白质在 7.5%分离胶上进行 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)电泳分离，后将其转移至 PVDF(polyvinylidene fluoride)膜上置于 5%脱脂牛奶中封闭 2 h。封闭结束后将洗涤好的 PVDF 膜置于一抗 PDE2A 稀释液(1:1000,Cat.No.55306-1-AP)中，4 孵 育，摇 床 过 夜。TBST 洗涤后，置于抗兔 HRP(horseradish peroxi-dase)二抗(1:1000)室温孵育 1.5 h。经 TBST 洗涤 3次（每次 10 min）后，在膜上滴加 ECL 显影液，于成像分析仪上显像。使用Image J分析各条带灰度值，PDE2A 与-actin 灰度值的比值作为 PDE2A 的相对表达量，每组数据以 Sham 组作归一化处理。9.实时逆转录聚合酶链反应检测(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)术后第 7 天，分离大鼠 T9T11节段的脊髓组织，液氮保存。应用 RNAex Pro 试剂提取脊髓组织中的 RNA。参照试剂盒说明书要求，使用Evo M-MLV反转录预混型试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA，然后用 Pro Taq HS SYBR Green 预混 qPCR 试剂盒进行PCR 扩增。最后，将扩增的 PCR 应用瑞士 Roche 公司的Light Cycler480 II进行实时荧光定量PCR检测，分析 Real-time PCR 扩增及溶解曲线，以内参 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)为对照，采用 2-CT公式进行 mRNA 相对表达量分析。GAPDH、M1 型小胶质细胞/巨噬细胞表面标记物 CD86 及促炎因子：IL-6、IL-1 和 M2 型细胞表面标记物CD163及抗炎因子：IL-10、TGF-的引物（见表1）。10.流式细胞术术后第 7 天，大鼠在 1.2%阿佛丁深麻醉下，心脏灌注 PBS 后，分离 T9T11脊髓节段置于含 5%胎牛血清的培养基（Gibco，赛默飞世尔科技公司）中，转移至 4冰上进行后续操作；将脊髓组织剪成小碎块，加入与培养基等体积的 0.25%胰蛋白酶液（不含 EDTA，购自南京凯基生物科技发展有限公司）进行消化，15 min 后加入与胰蛋白酶溶液等体积的5%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)封闭，经 75 m 细胞滤器过滤制备单细胞悬液。密度梯度离心法分离单个核细胞16。离心后获得的单细胞悬液使用抗大鼠流式细胞术抗体：Granulocyte-FITC(0.25 g/100 l)、CD172a-PE(0.25 g/100 l)、MHCII-PerCP-eFluor 710(0.25 g/100 l)和 CD11b/c-efluor 660(0.125 g/100 l)染色 30 min。用 400 lPBS 重悬细胞，应用流式细胞仪(LSRFortessaTM,BD,Cat.No.649225)采集单细胞并分析。通过 Flow-Jo 10.4 软件(BD)进行数据分析。其中小胶质细胞/巨噬细胞被标记为 CD11b/c+Granulocyt、MHCII+CD172a(M1型)和CD172a+MHCII-(M2型)亚型17。11.统计学分析采用 SPSS 24.0 软件(IBM)进行数据分析。所有结果以均数 标准误(xSEM)表示。通过Kolmogorov-Smirnov 检验分析数据是否符合正态分布。在行为学实验中，多组间比较采用重复测量方差分析和 Turkeys post-hoc 分析。对于免疫组化、qRT-PCR 和流式细胞术比较，采用单因素方差分析，组间比较符合方差齐性时采用 Turkeys post-hoc分析；若不符合方差齐性，则采用 Tamhanes T2 post-hoc 分析。P 0.05 认为差异有统计学意义。表 1 引物序列Table 1 Sequences of primers基因 Gene 前引物 Forward primer 后引物 Reverse primerCD86CGAACACTATTTGGGCGCAGCAAGCCCGTGTCCTTGATCTIL-6TTTCTCTCCGCAAGAGACTTCCTGTGGGTGGTATCCTCTGTGAIL-1GGGATGATGACGACCTGCTAACAGCACGAGGCATTTTTGTIL-10TAACTGCACCCACTTCCCAGTGGCAACCCAAGTAACCCTTAAACD163TTGGCCGAGTTAATGCCAGTCCCCATTCCTGGTGCTTACATGF-TGACATGAACCGACCCTTCCTGTGGAGCTGAAGCAGTAGTGAPDHGGCACAGTCAAGGCTGAGAATGATGGTGGTGAAGACGCCAGTA2023疼痛10期内文11.indd 7342023疼痛10期内文11.indd 7342023/10/17 14:07:392023/10/17 14:07:39 735 中国疼痛医学杂志 Chinese Journal of Pain Medicine 2023,29(10)结 果1.Bay 60-7550可减轻SCI大鼠的机械性痛觉过敏与 Sham 组相比，SCI 组大鼠在术后 721 天出现机械性痛觉过敏(P 0.01)。同时，vehicle 组的50%MWT 显著低于 Sham 组(P 0.01)。预实验结果显示，与 vehicle 组相比，鞘内注射 10 l Bay 60-7550(0.1 mg/kg)对脊髓损伤大鼠的机械痛敏无明显缓解作用；而鞘内注射 10 l Bay 60-7550(1 mg/kg)后大鼠机械痛阈值较 vehicle 组明显提高（P 0.01，见图 1A）。因此，在正式实验中，鞘内注射 1 mg/kg的 Bay 60-7550 后，脊髓损伤大鼠的机械痛觉过敏在术后 721 天明显减轻（P 0.01，见图 1B）。2.Bay 60-7550 对 SCI 大鼠脊髓 PDE2A 表达的影响免疫组化染色和 Western blot 结果显示：术后第 7 天，SCI 组和 vehicle 组大鼠脊髓损伤区脊髓背角 PDE2A 阳性表达强度及蛋白表达均高于 Sham 组（P 0.01，见图 2A-K）。而 Bay 60-7550 组脊髓背角 PDE2A 表达低于 vehicle 组（P 0.05，见图2A-K）。3.Bay 60-7550 对大鼠脊髓损伤后巨噬细胞/小胶质细胞表型分化的影响流式细胞术检测小胶质细胞/巨噬细胞比例（见图 3A,3B）；与 Sham 组相比，SCI 组、vehicle 组大鼠脊髓组织中小胶质细胞/巨噬细胞 M1/M2 亚型即 MHCII+/CD172a-细胞的比例显著增加（P 0.05，P 0.01，见图 3B）。而 Bay 60-7550 组 M1/M2 小胶质细胞/巨噬细胞比例低于 SCI 组、vehicle 组（P 0.05，见图 3B）。4.Bay 60-7550 对 M1、M2 型细胞相应炎症因子表达的影响qRT-PCR 结果显示，与 Sham 组相比，SCI 组和 vehicle 组的 M1 型标志物 CD86 mRNA 表达显著增加(P 0.01)。与 vehicle 组相比，Bay 60-7550 组M1 型标志物 CD86 mRNA 表达显著降低（P 0.01，见图 4A）。而 M2 型标志物 CD163 mRNA 水平升高（P 0.01，见图 4B）。与 Sham 组相比，SCI 组和 vehicle 组大鼠脊髓组织中IL-6、IL-1 mRNA水平均显著增加(P 0.01，P 0.05)。与 vehicle 组相比，Bay 60-7550 组鞘内给药后促炎因子 IL-6、IL-1 mRNA 水平均显著减少（P 0.01，P 0.05)，vehicle 组 IL-10 mRNA水平增加(P 0.01)。与 vehicle 组相比，Bay 60-7550组大鼠脊髓组织中 IL-10 mRNA 水平显著性增加(P 0.05)。与 Sham 组相比，SCI 组和 vehicle 组大鼠脊髓组织中 M2 型抗炎细胞因子 TGF-mRNA 水平增加(P 0.01)。与 vehicle 组相比，Bay 60-7550组大鼠脊髓组织中 TGF-mRNA 水平显著性增加（P 0.05，见图 4E,4F）。图 1 Bay 60-7550 对 SCI 大鼠机械痛阈的影响(xSEM)P 0.01，与 SCI+DMSO 组相比；*P 0.01，与 Sham 组相比；#P 0.01,与 vehicle 组相比Fig.1 Effects of Bay 60-7550 on mechanical pain threshold in SCI rats(xSEM)P 0.01,compared with group SCI+DMSO;*P 0.01,compared with group Sham;#P 0.01,compared with group vehicle.SCI+Bay 60-7550 1 mg/kg(n=3)(n=5)vehicleBay 60-7550SCI+Bay 60-7550 0.1 mg/kgSCI50%MWT(g)50%MWT(g)Post-operation days(d)Post-operation days(d)5510102020151500-1-1771410171421172821SCI+DMSOShamAB2023疼痛10期内文11.indd 7352023疼痛10期内文11.indd 7352023/10/17 14:07:392023/10/17 14:07:39 736 中国疼痛医学杂志 Chinese Journal of Pain Medicine 2023,29(10)图 2 Bay 60-7550 抑制 SCI 大鼠 PDE2A 的过表达(A-I:n=3;J-K:n=4,xSEM)(A-H)各组大鼠脊髓背角 PDE2A 表达的免疫组化染色图；(I)各组大鼠脊髓背角免疫组化染色 PDE2A 的平均光密度值；(J)免疫印迹法检测各组大鼠脊髓背角 PDE2A 蛋白表达的代表性图像；(K)各组大鼠经-肌动蛋白标准化后的蛋白表达变化统计图 白色箭头标记为 PDE2A 阳性表达；DH:脊髓背角；AOD:平均光密度值；Relative density ratio:相对密度比*P 0.01，与 Sham 组相比；#P 0.05，与 vehicle 组相比Fig.2 Inhibition of PDE2A overexpression in SCI rats by Bay 60-7550(A-I:n=3;J-K:n=4,xSEM)(A-H)Immunohistochemical staining images of PDE2A expression in the dorsal horn of the spinal cord in various groups of rats;(I)Average optical density values of immunohistochemical staining of PDE2A in the dorsal horn of the spinal cord of each group of rats;(J)Representative images of PDE2A protein expression in the dorsal horn of rat spinal cord in each group detected by Western blot;(K)The analyzed data normalized by-actin in each group.White arrows show PDE2A positive expression;DH:spinal dorsal horn;AOD:average optical density*P 0.01,compared with group Sham;#P 0.05,compared with group vehicle.讨 论脊髓损伤后神经病理性疼痛(SCI-NP)严重影响病人的日常生活，也给社会带来了沉重的经济和医疗负担。SCI-NP 涉及复杂的病理生理过程，包括神经炎症的级联反应、脊髓去抑制、下行疼痛调控通路中断、中枢敏化及神经元兴奋性增强18。因此，SCI-NP 的治疗十分困难，临床中仍缺乏有效的治疗方案。PDE2A 是细胞内重要的信号调节因子，其广泛分布于外周和中枢神经系统9。Lakics 等19发现在多种哺乳动物的大脑和脊髓灰质中 PDE2A 含量丰富，其中 PDE2A 免疫染色密度最高的部位是脊髓背角神经元（尤其是 I-II 层）的细胞核。随后，Kallenborn-Gerhardt 等20进一步发现，在酵母多糖诱导的小鼠足底炎性疼痛模型中，脊髓背角 PDE2A表达上调，且 PDE2A 免疫荧光标记与脊髓背角浅层神经元的标记重叠。PDEs 被证明可参与慢性炎ABCDEFGHShamSCIDHDHDHDHvehicleBay 60-755020 m20 m20 m20 m50 m50 m50 m50 mIJKAODRelative density ratio(PDE2A)0.110.220.3300ShamShamShamSCISCISCIvehiclevehiclevehicleBay 60-7550Bay 60-7550Bay 60-7550PDE2A-actin106 KD43 KD2023疼痛10期内文11.indd 7362023疼痛10期内文11.indd 7362023/10/17 14:07:392023/10/17 14:07:39 737 中国疼痛医学杂志 Chinese Journal of Pain Medicine 2023,29(10)图 3 Bay 60-7550 可下调小胶质细胞/巨噬细胞 M1/M2 极化的比例(n=3,xSEM)(A)MG/M(CD11b/c+Granulocyte-)、M1 样表型(MHCII+CD172a-)和M2 样表型(CD172a+MHCII-)细胞的流式细胞图；(B)各组 MG/M 中MHCII+/CD172a+的百分比*P 0.05，*P 0.01，与 Sham 组相比；#P 0.05，与 vehicle 组相比Fig.3 The M1/M2 polarization of microglia/macrophages was down-regulated after Bay 60-7550 administration(n=3,xSEM)(A)Total MG/M(CD11b/c+Granulocyte-),M1-like phenotype(MHCII+CD172a-)and M2-like phenotype(CD172a+MHCII-)were shown in flow cytometric plots;(B)Percentage of MHCII+/CD172a+in MG/M of each groups.*P 0.05,*P 0.01,compared with grou