6个香菇L135菌株主要性状的比较分析.pdf

Edible and medicinal mushrooms 2023，31（5）：332337 6 个香菇 L135 菌株主要性状的比较分析 刘 昆 蒋 俊 宋小亚 路新彦 曾凡清 应国华（丽水市农林科学研究院 浙江 丽水 323000）摘 要 以从丽水各地收集的表型差异明显的 6 个香菇 L135 菌株为材料，比较分析菌丝形态、菌丝生长速度、漆酶活性、抗高温能力、子实体形态、栽培产量等指标，以期筛选出性状优良与疑退化菌株，为后续菌种种性退化机理研究奠定材料基础。研究结果表明，6 个菌株中 L135-21 综合性状表现优良；L135-1 的菌丝形态、漆酶活性、抗高温能力表现较差，出菇期集中，子实体较小；L135-30 耐高温能力、产漆酶能力较强，但栽培产量与子实体形态均较差；L135-18、L135-19 所有性状指标均较差。综合评价，L135-1、L135-18、L135-19、L135-30为退化明显株系，并且可能代表 3 个不同的退化类型，可作为后续退化机理研究的代表菌株。关键词 香菇；L135；退化；性状 中图分类号：S646 文献标识码：A 文章编码：2095-0934（2023）05-332-06 Comparative analysis of main characters of six strains of Lentinula edodes variety L135 LIU Kun JIANG Jun SONG Xiaoya LU Xinyan ZENG Fanqing YING Guohua(Lishui Institute of Agriculture and Forestry Sciences,Lishui 323000,China)Abstract Six Lentinula edodes cultivated strains of variety L135 with obvious phenotypic differences collected from various locations in Lishui were used as experimental materials,the mycelial morphology,mycelial growth rate,laccase activity,high temperature resistance,cultivated yields,fruiting body morphology and other trait indicators were compared and analyzed,in order to screen out strains with good characters and obvious signs of degradation,which laid a material foundation for the subsequent research on the mechanism of strain degradation.The results showed that L135-21 combined excellent trait performance;L135-1 had poor performance in mycelial morphology,laccase activity,and high temperature resistance,with a concentrated fruiting period and smaller fruiting bodies.L135-30 has strong high temperature resistance and laccase activity,but the cultivated yields and fruiting body morphology are poor.L135-18 and L135-19 had poor performance in all trait indicators.Based on the comprehensive evaluation,L135-1,L135-18,L135-19,and L135-30 were identified as significantly degraded strains,which representing three different degradation types,and can be used as representative strains for subsequent research on the mechanism of degradation.Keywords Lentinula edodes;L135;degradation;agronomic characters 基金项目：丽水市科技局重点研发项目（2017ZDYF09）；国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-20）；浙江省农业（食用菌新品种选育）新品种选育重大科技专项（2021C02073-1-2）作者简介：刘昆（1984），男，硕士，助理研究员，主要从事食用菌菌种质量相关研究。E-mail：。刘 昆等：6 个香菇 L135 菌株主要性状的比较分析 333 香菇（Lentinula edodes）具有重要的食用和药用价值，在中国已经有 800 余年的栽培历史1-2。据中国食用菌协会统计，2021 年我国香菇鲜品总产量近 1 300 万吨，占所有食用菌总产量的 31.34%，是我国第一大菇种3。随着栽培规模与菌种使用年数的增加，主栽品种在历经数次传代、分离、保藏、繁育和运输后，出现了菌种退化现象，给香菇产业健康发展带来不良影响。香菇品种 L135（国品认菌 2007005）为福建省三明市真菌研究所于 2007 年筛选育成。为低温晚熟型品种，菌龄 160200 天，子实体柄短肉厚，菇形圆正，鳞片少，易形成花菇。其菌丝抗逆性较差，抗杂菌能力较弱，不耐高温，不易越夏，适宜32 以下区域或海拔较高、气温凉爽地区栽培。浙江省庆元县、景宁县等高海拔山区因夏季凉爽、冬季温差大，满足 L135 品种特性要求，因而 L135曾被菇农广泛栽培。近年来，L135 品种在生产中逐渐表现出烂棒率高，产量低，菇小、畸形等问题，给菇农带来了严重的经济损失4。为研究香菇 L135 品种退化的原因，探索香菇品种退化的内在机理，本文以 6 个不同来源的生产用 L135 菌株为实验材料，对其菌丝形态、漆酶活性、抗高温能力、栽培产量、子实体特征等进行比较分析，期望筛选出遗传稳定、性状较好与明显退化的菌株，为进一步研究香菇种性退化机理奠定基础，为香菇品种选育提供指导。1 材料与方法 1.1 供试菌株 从丽水各地收集不同来源且栽培中使用的香菇 L135 品种菌株，经初步筛选后获得 6 株表型差异明显的菌株，编号分别为：L135-1、L135-18、L135-19、L135-21、L135-29、L135-30。为了确定菌株的真实性，以上海农业科学院食用菌研究所提供的 L135 菌株为对照，按照国家农业标准 NYT 18452010食用菌菌种区别性鉴定拮抗反应、NY/T 17432009食用菌菌种真实性鉴定 RAPD法、NY/T 17302009食用菌菌种真实性鉴定 ISSR 法，对 6 个菌株进行了真实性鉴定，鉴定结果显示所有菌株均真实可靠。1.2 实验方法 1.2.1 培养基制作 马铃薯葡萄糖琼脂粉（PDA）培养基：购自荣研生物科技（中国）有限公司，按照说明书加热溶解，于 121 灭菌 20 min，待温度降至 60 左右时，分装于直径 90 mm 培养皿中，每皿 20 mL。木屑培养基：培养基配方为杂木屑 78%、麦麸20%、红糖 1%、石膏 1%，料水比为 11.2，pH自然。取木屑培养基 45 g 分装于 20 mm 300 mm试管中，使用木棒压平至固定高度，硅胶塞封口，121 灭菌 60 min，冷却至常温后备用。木屑琼脂培养基：培养基配方为杂木屑（粉碎机粉碎 2 min，10 目过筛）78 g、麦麸 20 g、石膏1 g、葡萄糖 1 g、琼脂粉 16 g，混合搅拌均匀后，称取 2.90 g 分装到 100 mL 三角瓶，加水 25 mL，于 121 灭菌 30 min，待温度降至 60 左右时，分装于直径 90 mm 培养皿中，每皿 20 mL。愈创木酚（POD）培养基：PDA 培养基中加入 0.04%愈创木酚，于 121 灭菌 20 min 灭菌后分装于 90 mm 培养皿中，每皿 20 mL5。漆酶活性定量试剂盒：购自北京索莱宝科技有限公司。1.2.2 菌株活化 将试验菌株从试管斜面中接种于 PDA 平板中心，于25 下活化培养7天，使用7 mm打孔器，在菌落边缘同步生长菌丝处取菌丝块，用于后续试验。1.2.3 菌株性状检测 菌丝形态观察。将活化菌丝块分别接种于PDA平板与木屑琼脂培养基中心，每个菌株 3 个重复，于 25 培养 30 天，观察菌丝形态生长变化情况。菌丝生长速度测定。将 3 块活化菌丝块接种于装有木屑培养基的试管中心，于 25 温度下直立334 2023 年 第 31 卷 第 5 期 培养，待菌丝生长 1 cm 时，划起始生长线，最快菌株菌丝生长至距试管底部 1 cm 时划终止生长线，测量生长距离，计算日均生长速度。漆酶活性定性测定。将活化菌丝块接种于POD平板上，每个菌株 3 个重复，25 培养 812 天，每天定时记录有无红棕色变色圈的产生及变色圈直径的大小，记录变色圈直径。根据变色圈的直径大小，检测漆酶产生能力。漆酶活性定量测定。将活化菌丝块分别接种于铺有半透膜的木屑培养基平板上，每个菌株 3 个重复，25 培养 15 天，收集菌丝体。于液氮中将菌丝体研磨成粉末状。按照漆酶活性检测试盒说明书进行漆酶定量测试。高温协迫检测。将 3 块活化菌丝块接种于装有木屑培养基的大试管中，25 培养 710 天后，划起始生长线。随后置于 42 高温处理 4 h 后，继续 25 培养，菌丝距试管底部 1 cm时，划终止生长线，测量生长距离，计算高温胁迫处理后菌丝生长速度。农艺性状检测。栽培地点位于浙江省丽水市景宁县包凤村，在高棚内采用常规层架式栽培出菇管理。栽培料配方为杂木屑 79，麦麸20，石膏1，含水量55%60%，pH 自然。栽培袋规格为 15 cm55 cm，每袋填装栽培料 1.8 kg，常压灭菌，开放式接种。每个菌株设 3 个小区重复，每重复 36 棒。子实体菌幕裂开但未完全消失时进行采摘，统计单棒产量。每个菌株随机挑取 100 个子实体，测量子实体单菇重，菌盖直径、厚度，以及菌柄直径和长度。1.2.4 数据分析 使用 R 软件进行统计分析。2 结果与分析 2.1 香菇 L135 不同菌株菌丝形态 分别接种到 PDA 培养基和木屑琼脂培养基的6 个 L135 菌株菌丝形态差异明显（图 1）。在 PDA培养基中，菌株 L135-1、L135-18、L135-19 菌丝较稀疏，无加厚隆起，无原基形成。在木屑琼脂培养基中，菌株 L135-1 菌丝明显稀疏，L135-18、L135-19 菌丝相对较浓，但无褐色斑点、子实体原基发生。菌株 L135-21、L135-29、L135-30 在两种培养基均出现菌丝局部加厚隆起、变色及出现子实体原基形态等现象，与大田栽培中正常菌棒转色前期菌丝隆起现象类似。2.2 香菇 L135 不同菌株菌丝生长速度 如表 1 所示，在木屑培养基中，6 个菌株菌丝生长速度差异明显，其中以 L135-29、L135-30 较快，分别为7.31 mm/d和7.24 mm/d；L135-21次之；L135-1、L138-18、L135-19 均低于 7.0 mm/d，L135-1最慢，仅 5.17 mm/d，显著低于其他菌株。2.3 香菇 L135 不同菌株菌丝漆酶活性定性分析 L135菌株漆酶活性测定结果表明（表2、图2），图 1 香菇 L135 不同菌株在 PDA培养基（上）和木屑琼脂培养基（下）的菌丝形态 刘 昆等：6 个香菇 L135 菌株主要性状的比较分析 335 不同菌株之间差异明显。L135-1 菌株在 POD 平板上的菌丝呈絮状，氧化圈颜色较浅；L135-18、L135-19 菌株在 POD 平板中的菌丝致密，氧化圈颜色最深；L135-21、L135-29、L135-30 菌株在 POD平板中菌丝量居中，氧化圈颜色较浅。综合得出 6个菌株漆酶活性从高到低依次为：L135-21、L135-30、L135-29、L135-1、L135-18、L135-19。2.4 香菇 L135 不同菌株菌丝漆酶活性定量分析 漆酶活性定量分析结果（表 2）表明，6 个菌株之间差异明显，不同菌株之间的漆酶活性变化趋势与定性测试结果相近。菌株 L135-30、L135-21、L135-29 漆酶活性仍较高，其余 3 个菌株漆酶活性表现较差，其中 L135-1 菌株漆酶活性仅为 31.37 U/g，远低于其他菌株。2.5 香菇 L135 不同菌株抗高温能力 6 个 L135 菌株经 42 处理 4 个小时后，菌丝长势与生长速度出现明显的差异（表 3、图 3）。在菌丝长势方面，以菌株 L135-21 菌丝表现浓密、洁白，其他 5 个菌株呈现出不同程度的菌丝淡化现象。在生长速度方面，菌株 L135-21、L135-29、L135-30 较快，3 个菌株间无显著差异，L135-18、L135-19 菌株次之，L135-1 最慢。表明抗高温能力菌株 L135-21 较强，其余菌株偏弱。2.6 香菇 L135 不同菌株子实体形态 在子实体形态方面（表 4），菌株 L135-29 的单菇重、菌盖直径和厚度、菌柄长度和直径均显著优于其他菌株，但其有 36%的子实体菌盖中心会向上明显伸长，呈典型的尖顶形状，商品性状反而较差；L135-21 单菇重等 5 个指标居次，而子实体尖表 1 香菇 L135 不同菌株菌丝生长速度 菌株 菌丝生长速度/(mm/d)菌丝长势 L135-1 5.17 0.12 e+L135-18 6.17 0.17 d+L135-19 6.42 0.18 c+L135-21 7.03 0.19 b+L135-29 7.31 0.17 ab+L135-30 7.24 0.17 a+注：同列数据无相同小写字母表示差异显著（P0.05）；“+”越多表示菌丝长势越好，下同。表 2 香菇 L135 不同菌株的漆酶活性 菌株 定性测试/(cm)定量测试/(U/g)菌丝特征 L135-1 4.25 0.25 c 31.37 3.78 f 絮状，氧化圈较浅 L135-18 3.84 0.15 d 329.05 35.44 e 致密，氧化圈较深 L135-19 3.75 0.04 d 459.60 31.08 d 致密，氧化圈较深 L135-21 5.78 0.12 a 628.88 21.56 b 一般，氧化圈较深 L135-29 5.08 0.43 b 533.47 27.16 c 一般，氧化圈较浅 L135-30 5.21 0.52 b 844.08 14.01 a 一般，氧化圈较深 表 3 香菇 L135 不同菌株高温胁迫后生长速度 菌株 菌丝生长速度/（mm/d）菌丝长势 L135-1 3.04 0.04 c+L135-18 3.80 0.78 b+L135-19 3.76 0.02 b+L135-21 4.01 0.03 a+L135-29 4.06 0.18 a+L135-30 4.10 0.11 a+图 3 香菇 L135 不同菌株高温胁迫后菌丝生长情况 图 2 香菇 L135 不同菌株在 POD 平板培养基上的生长表现 336 2023 年 第 31 卷 第 5 期 顶率较低，仅 0.94%；L135-1、L135-30 子实体整体均偏小，表现较差。L135-18、L135-19 在越夏过程中菌棒烂棒严重，子实体数量较少，未能进行有效统计分析。2.7 香菇 L135 不同菌株栽培产量 如表 5 所示，6 个菌株的子实体产量差异显著。L135-1、L135-21、L135-29 每棒平均产量均超过280 g，明显高于另外 3 个菌株，3 菌株之间产量差异不显著。菌棒转色速度，L135-1 明显慢于其他菌株，且出菇集中于前两潮，子实体较小，商品价值不高。菌株 L135-18、L135-19、L135-30 产量极低，不适合栽培生产。3 结论与讨论 同一品种不同菌株间遗传背景相近，从中筛选出性状优良与疑退化菌株，更容易以彼此为参照，探索香菇品种退化的内在机理。本研究以丽水当地生产中曾广泛栽培的 L135 品种为试验对象，共收集 30 余份不同来源的菌株，经前期栽培筛选，初步获得 6 株表型差异较显著的菌株。为了验证这些菌株的遗传稳定性与性状差异，为后续研究奠定材料基础，本文对 L135 品种 6 个不同表型菌株的菌丝形态、菌丝生长速度、产漆酶能力、抗高温能力、子实体形态、栽培产量等方面进行分析。菌株 L135-1 在菌丝形态、漆酶活性、抗高温能力等方面均表现较差，但栽培产量较高，与L135-21、L135-29 无显著差异，且出菇期集中在前2 潮，但子实体较小，栽培效益不高。L135-30 耐高温能力、产漆酶能力虽然较高，但产量与子实体形态均较差。L135-18 与 L135-19 在各个方面均表现较差，且在越夏过程中菌棒烂棒严重，产量极低。综合以上结果，L135-1、L135-18、L135-19、L135-30共 4 个菌株初步判定为退化明显株系，并且可能代表着 3 个不同的退化类型，可作为后续退化机理研究的代表菌株。菌株 L135-21 的菌丝体形态正常、漆酶活性高，抗高温、产量高、子实形态较好，性状良好，可作为后续分析的正常对照菌株。相比 L135-21，L135-29 各性状也较好，但其尖顶子实体占比较高，商品价值低，菌株整体性状一般。在前期预实验中发现，6 个 L135 菌株在 PDA培养基中的生长速度、耐高温能力与菌丝体形态、子实体形态、栽培产量等并没有较好的对应关系。为了获得各性状可相互对应的数据，本研究中菌丝体形态、菌丝生长速度、高温胁迫等实验均使用了 表 4 香菇 L135 不同菌株子实体形态特征数据 菌株 单菇重/g 菌盖直径/mm 菌盖厚度/mm 菌柄长度/mm 菌柄直径/mm 尖顶比例/%L135-1 8.37 3.88 d 38.88 8.00 c 11.84 2.55 d 27.32 8.12 d 10.01 2.58 d 0 L135-18 L135-19 L135-21 19.96 6.33 b 49.22 9.73 b 19.88 4.44 b 46.13 10.82 b 16.44 4.43 b 0.94 L135-29 21.17 6.76 a 53.92 10.00 a 23.81 3.53 a 57.78 13.25 a 18.80 4.59 a 36.00 L135-30 14.93 6.53 c 48.56 10.58 b 18.46 4.33 c 34.00 8.38 c 13.70 2.79 c 0 注：L135-18、L139-19 子实体数量极少不具统计学意义；L135-30 子实体数量较少，仅取样 30 个；其他菌株子实体取样 100 个。表 5 香菇 L135 不同菌株栽培产量 菌株 产量/（g/棒）转色速度 L135-1 308.16 66.29 a+L135-18 4.19 6.83 b+L135-19 15.72 19.05 b+L135-21 330.46 27.01 a+L135-29 282.07 38.67 a+L135-30 28.50 21.56 b+注：“+”越多表示菌棒转色速度越快。刘 昆等：6 个香菇 L135 菌株主要性状的比较分析 337 与栽培相近的木屑培养基，结果发现木屑培养基优于 PDA 培养基，更适合不同菌株之间的相互比较。但木屑琼脂培养基因颜色较深，对漆酶活性的定性测试有影响，未能在相应实验中使用。香菇属于白色木腐菌，在栽培过程对木屑中的木质素、纤维素、半纤维素具有明显的降解作用6。漆酶是分解木质素的重要酶，对其进行检测可反映香菇菌丝对栽培基质的利用能力。除了降解木质素作用外，漆酶在色素合成、子实体形成、脱毒等方面都扮演了重要的角色7。漆酶对香菇生长有着重要作用，本研究中部分菌株的菌丝产漆酶能力与菌丝形态、栽培产量、子实体形态、抗高温能力等指标也有一定的相关性。但香菇菌丝中的其他氧化酶可能也会对愈创木酚进行氧化7，造成定性测试与定量测试有一定的误差，后续还需要对漆酶定性试验进行改进，提升其准确性。参考文献 1 FINIMUNDY T C,DILLON A J,HENRIQUES J A P,et al.A review on general nutritional compounds and pharmacological properties of the Lentinula edodes mushroomJ.Food and Nutrition Sciences,2014,5(12):1095-1105.2 CHANG S T,MILES P G.Historical record of the early cultivation of Lentinus in ChinaJ.Mushroom Journal for the Tropics 1987,7.3 中国食用菌协会.2021 年度全国食用菌统计调查结果分析EB/OL.(2021-12-22)https:/ 练长勋,胡建平,朱星考,等.栽培香菇 L135 出现问题的原因分析及对策J.中国食用菌,2018,37(3):89-90.5 王宜磊,朱陶,邓振旭.愈创木酚法快速筛选漆酶产生菌J.生物技术,2007(2):40-42.6 于丹,宋福强,李冲伟,等.香菇栽培前后基质中纤维素结构的变化J.中国农学通报,2017,33(34):81-85.7 秦澎,辜运富,曾先富,等.香菇漆酶高产菌株筛选及漆酶基因的表达研究J.菌物学报,2017,36(9):1243-1250.银耳发源地通江县推动银耳段木栽培与木屑栽培共同发展 位于四川省巴中市的通江县是我国银耳栽培的发源地，其独特的自然禀赋造就了通江银耳肉厚、质嫩、易炖化的特质，历来被誉为“耳中极品”“菌中魁首”，作为国家地理标志保护产品，“通江银耳”是地方名贵土特产中的一张金名片。在近期举办的中国通江银耳产业发展大会上，全国脱贫攻坚楷模、中国工程院院士李玉对通江银耳给予高度评价：“通江是世界银耳栽培的发祥地，是中国银耳之乡，在我国以青冈木为主的特色食用菌发展带上，在脱贫攻坚、乡村振兴中，通江银耳谱写了最为绚丽的篇章。”上海市农业科学院副院长、国家食用菌产业技术体系首席科学家谭琦评价：“得益于出产高品质的银耳，通江银耳历经半个多世纪的科学发展，守正创新，坚持特色，已经在段木银耳这个细分领域成为世界闻名的单项冠军”。2023 年通江县全县接种青冈段木银耳菌种 40 万袋，预计全年产青冈段木银耳干品产量约 60 吨；银耳（含段木银耳、木屑银耳）总产量将达到 250 吨。近年来，通江县通过提出“段木银耳强品牌，木屑银耳深加工”的新思路，追求高质量发展，并加强对耳林资源保护和培育，推动银耳规模化、标准化生产。发布了地理标志产品 通江银耳标准、通江段木银耳生产技术规程与通江青冈木屑银耳生产技术规程，并与多家权威院所、知名高校深度合作，以“三产融合”为路径，坚持园区引领、全链发展、科技赋能、品牌提质，全力打造通江银耳百亿级产业集群，先后推出了食品饮料、医药保健、日用化妆和预制菜等百余种优质产品。2023 年通江银耳品牌价值超 60 亿元，预计年综合产值将突破 25 亿元。（食药用菌编辑部 周 礼）