FLK-1+胎肝细胞移植治疗急性肝损伤.doc

www.CRTER.org李娜，等. FLK-1+胎肝细胞移植治疗急性肝损伤FLK-1+胎肝细胞移植治疗急性肝损伤*李 娜1，丁伟荣2，伍柏青3，刘婷婷2，程洪波2，金成豪2 (1南昌大学医学院，江西省南昌市 330006；江西省人民医院，2血液科， 3检验科，江西省南昌市 330006)文章亮点：文章的特点为表明了胎肝FLK-1+细胞具有分化肝细胞的潜能，未经诱导的FLK-1+细胞不表达白蛋白，而经肝细胞生长因子诱导后高表达白蛋白，并证明FLK-1+细胞的Oct-3/4和Rex-1表达随着干细胞分化明显下降或消失，提示分化后FLK-1+细胞失去干细胞特性。关键词：器官移植；细胞移植；肝功能损伤；FLK-1+细胞；细胞移植；肝细胞生长因子；表皮生长因子；谷草转氨酶；谷丙转氨酶；国家自然科学基金主题词：肝细胞生长因子；表皮生长因子；天冬氨酸氨基转移酶类；丙氨酸转氨酶基金资助：国家自然科学基金项目(30860115)*；江西省自然科学基金项目(2008GZY0084)资助*摘要背景：作者先期研究表明，在鼠胚第17-19天胎肝存在一类FLK-1+细胞，表达胚胎干细胞的特征性标志，并具有多向分化功能。目的：验证胎肝FLK-1+细胞治疗小鼠急性肝损伤的修复作用。方法：免疫磁珠提取及流式细胞仪检测胎肝FLK-1+细胞；RT-PCR检测FLK-1+细胞Oct-3/4、Rex-1基因；肝细胞生长因子和表皮生长因子诱导FLK-1+细胞向肝细胞分化。腹腔注射四氯化碳建立小鼠急性肝损伤模型并随机分为2组：对照组模型小鼠仅输入生理盐水，实验组模型小鼠尾静脉输注诱导分化FLK-1+细胞(1106细胞)，16 h后两组取血测定肝功能，观察64 h小鼠死亡率。结果与结论：胎鼠肝脏FLK-1+细胞高表达Oct-3/4、Rex-1，白蛋白表达的FLK-1+细胞阳性率为0.6%。经肝细胞生长因子诱导3 d后FLK-1不表达，Oct-3/4和Rex-1表达显著下降或消失。经肝细胞生长因子和表皮生长因子诱导后96.38%的FLK-1+细胞表达白蛋白。诱导3d的FLK-1+细胞移植后16 h小鼠血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶显著低于对照组(P 0.05)，血清白蛋白显著高于对照组(P 0.05)；移植组64 h死亡率为61.5%与对照组(80%)差异无显著性意义(P 0.05)。说明胎鼠肝脏肝细胞生长因子和表皮生长因子诱导3 d的FLK-1+细胞移植可较好地改善急性肝损伤的肝细胞功能。Transplantation of fetal liver FLK-1+ cells in treatment of acute liver injuryLi Na1, Ding Wei-rong2, Wu Bo-qing3, Liu Ting-ting2, Cheng Hong-bo2, Jin Cheng-hao2 (1Medical College of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China; 2Department of Hematology, 3Department of Clinical Laboratories, Jiangxi Provincial Peoples Hospital, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China)李娜，女，1978年生，江西省抚州市人，汉族，2012年南昌大学毕业，硕士，医师，主要从事干细胞生物学研究。634624912. 并列第一作者：丁伟荣，男，1975年生，江西省高安市人，汉族，2004年浙江大学毕业，博士，副主任医师，主要从事干细胞定向分化及机制研究。dingwr97通讯作者：金成豪，博士，主任医师，硕士生导师，江西省人民医院血液科，江西省南昌市 330006 jinch227 中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2013)53-09139-06修回日期：2013-09-19(201307004/WY)Li Na, Master, Physician, Medical College of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China634624912Ding Wei-rong, M.D., Associate chief physician, Department of Hematology, Jiangxi Provincial Peoples Hospital, Nanchang 330006, Jiangxi Province, Chinadingwr97Li Na and Ding Wei-rong contributed equally to this work.Corresponding author: Jin Cheng-hao, Ph.D., Chief physician, Masters supervisor, Department of Hematology, Jiangxi Provincial Peoples Hospital, Nangchang 330006, Jiangxi Province, Chinainch227 Accepted: 2013-09-19AbstractBACKGROUND: Previous studies of our research group have shown that FLK-1+ cells existed in the mouse fetal liver at embryonic 17-19 days, and they expressed embryonic stem cells and presented multi-differentiation potentials.OBJECTIVE: To evaluate the therapeutic effect of the transplantation of FLK-1+ cells derived from mouse fetal liver on acute liver injury in mice.METHODS: The FLK-1+ fraction were enriched from the fetal liver with immunomagnetic beads method and detected by flow cytometry. The Oct-3/4 and Rex-1 genes in FLK-1+ cells were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction. The FLK-1+ cells were induced to differentiate into liver cells by hepatocyte growth factor and epidermal growth factor. The model of acute liver injury in mice was established by intraperitoneally injecting carbon tetrachloride 4, and was randomly divided into two groups. In the control group, mouse models with acute liver injury were infused normal saline via tail vein; in the experimental group, mouse models with acute liver injury were infused induced FLK-1+ cells (1106) via tail vein. The blood was collected at 16 hours and liver functions were detected. The mortality of mice was observed at 64 hours. 3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083RESULTS AND CONCLUSION: The fetal liver FLK-1+ cells highly expressed Oct-3/4 and Rex-1 mRNA, and albumin expressing rate in FLK-1+ cells was 0.6%. After induced by hepatocyte growth factor for 3 days, FLK-1 did not express. After induced by hepatocyte growth factor and epidermal growth factor for 3 days, Oct-3/4 and Rex-1 mRNA expression was significantly reduced or disappeared in FLK-1+ cells, and 96.38% FLK-1+ cells expressed albumin. After FLK-1+ cells induced for 3 days were transplanted to mouse models with acute liver injury for 16 hours, the serum glutamic-oxalacetic transaminease and glutamic-pyruvic transaminase were significantly lower (P 0.05), but serum albumin was significantly higher than the control group (P 0.05). The mortality rate in the control group was 80% and the mortality rate in the experimental group was 61.5% at 64 hours, with no significant difference between two groups (P 0.05). Experimental findings indicate that, transplanting fetal liver FLK-1+ cells induced by hepatocyte growth factor and epidermal growth factor for 3 days can improve liver cells function in mice with acute liver damage. Subject headings: hepatocyte growth factor; epidermal growth factor; aspartate aminotransferase; alanine aminotransferaseFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 30860115*; the Natural Science Foundation of Jiangxi Province in China, No. 2008GZY0084*Li N, Ding WR, Wu BQ, Liu TT, Cheng HB, Jin CH. Transplantation of fetal liver FLK-1+ cells in treatment of acute liver injury. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(53):9139-9144.9143ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction随着干细胞的研究和应用的深入，应用干细胞移植治疗急性肝功能衰竭获得了明显的进展，其在急性肝损伤治疗上将发挥重要作用1-3。作者先期研究表明，在鼠胚第17-19天胎肝存在一类FLK-1+细胞，其表达胚胎干细胞的特征性标志，如STAT-3、Oct-3/4、Rex-1、SSEA-1，并具有多向分化功能，可分化为血管内皮细胞、平滑肌细胞、肝细胞和胆管细胞4。文章建立小鼠急性肝损伤的模型评价胎肝FLK-1+细胞移植治疗急性肝损伤的效果。1 材料和方法 Materials and methods 设计：随机对照动物实验。时间及地点：实验于2010年1月至2012年1月在江西省人民医院中心实验室完成。材料：FLK-1+胎肝细胞移植治疗急性肝损伤实验用主要试剂及仪器：试剂及设备来源美国Sigma公司美国GIBCO公司山东鲁花集团有限公司德国 Bergisch Gladbach公司日本日立公司抗FLK-1抗体、免疫磁珠、胶原酶、胶原、 表皮生长因子、肝细胞生长因子、四氯化碳(CCl4，纯度99.95%)低糖DMEM、胎牛血清 鲁花牌5S压榨I级花生油 免疫磁珠泵(MINIMACS、Miltenyi-BiotecGmbH) 全自动生化仪(日立7600-020) 实验动物：孕17-19 d的昆明种小鼠50只用于FLK-1+细胞分离及提取；昆明种小鼠46只，体质量(22.050.52) g，用于动物实验。实验动物均购自江西中医学院。实验方法：FLK-1+细胞分离及提取：健康孕17-19 d昆明种小鼠乙醚麻醉，体积分数75%乙醇浸泡20 min消毒，无菌取胎肝，PBS漂洗并剪碎，加4 mL 2.0 g/L浓度的胶原酶反复吹打5 min，加5 mL PBS洗涤，离心(1 500 r/min) 5 min，PBS重悬浮细胞，加入抗FLK-1(10-20 L)孵育20 min，PBS洗涤，离心去上清，在沉淀中加入磁珠(10-20 L)孵育20 min，加PBS洗涤后获得FLK-1+细胞备用。体外诱导FLK-1+向肝细胞分化：FLK-1+细胞置于60%低糖DMEM 40% MCDB-201、胰岛素/转铁蛋白/硒(ITS)、4.7 mg/L亚油酸、1 g/L BSA、10-9 mol/L 地塞米松、10-4 mol/L抗坏血酸-磷酸盐、100 U/L青霉素和 100 U/L链霉素的完全培养基中，调整细胞浓度至 1104 L-1，将FLK-1+细胞接种在用胶原IV处理过的培养板中，实验组加入50 g/L肝细胞生长因子和/或20 g/L 表皮生长因子，对照组细胞不加任何诱导剂，37 ，体积分数5%CO2条件下培养3 d后，采用流式细胞术和免疫组织化学法检测细胞抗原，RT-PCR检测基因表达变化，或进行移植实验。流式细胞仪检测FLK-1+细胞诱导前后抗原表达：按常规方法操作。细胞表面抗原：将悬浮吹散的肝细胞与FLK-1抗体孵育。兔抗鼠IgM异硫氰酸荧光素(FITC) 标记的抗体作为二抗。采用同形匹配的IgM作为对照。胞内抗原：按照Cytofix/Cytoperm胞内抗原检测试剂盒操作说明书，用流式细胞术检测FLK+细胞胞内抗原白蛋白。同形匹配的非免疫免疫球蛋白为对照。半定量RT-PCR方法检测FLK-1+细胞诱导前后目的基因mRNA表达情况：用Isogen系统裂解细胞后，采用酚-氯仿提取总核苷酸。采用半定量PCR检测目的基因表达，用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照，引物序列见表1。表1 RT-PCR采用的各种基因的引物序列Table 1 Sequence of gene primers for RT-PCR 基因产物大小(bp)引物序列FLK-1641正向引物：5-TCA TCT GTT ACA GCT TCC AAG T-3反向引物：5-CTG CTG TGT TGT CAT AAT GGA A-3Oct-3/4200正向引物：5-TGT GGA CCT CAG GTT GGA CT-3反向引物：5-CTT CTG CAG GGC TTT CAT GT-3Rex-1301正向引物：5-CGA GGT GAG TTT CCG AAC CCA TTC-3反向引物：5-TTC TTG CAC CCG CCT TGA GGA CAC-3GAPDH190正向引物：5-GAA CGA CCC CTT CAT TGA CCT C-3反向引物：5-TCC ACG ACA TAC TCA GCA C-3动物实验：将99.9%四氯化碳用花生油释成40%的工作浓度，每只小鼠分别腹腔注射入毎10 L/g工作液体制作小鼠肝损伤急性模型。实验组：26只昆明种小鼠，采用5号针将体外诱导3 d的FLK-1+细胞悬液(1106 L-1)注射入模型小鼠尾静脉；对照组：20只小鼠尾静脉输入等量生理盐水。指标测定：细胞移植后16 h两组小鼠自眼眶取血0.5-1.0 mL，用柠檬酸抗凝，离心2 000 r/min，取血清，用试剂盒和全自动生化仪测定血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶、白蛋白、总胆红素、纤维蛋白原。记录64 h各组小鼠死亡率。主要观察指标：小鼠血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶、白蛋白、总胆红素、纤维蛋白原。细胞移植后 64 h小鼠死亡率。统计学分析：应用SPSS 19.0统计分析软件包，计量资料实验数据以x(_)s表示。进行方差齐性检验、正态性检验，单变量两组资料之间的比较采用配对t 检验，Kaplan-Meier分析用来分析各组间OS差异。Log-Rank检验是目前最常用的检验方法，但对观察近期生存率有影响，更适合应用Breslow检验5，因此实验采用以上两种检验方法对生存期进行统计学检验，必要时参考Tarone-Ware检验的结果。以P 0.05为差异有显著性意义。 2 结果 Results2.1 实验动物数量分析 实验选用小鼠46只，分为2组，全部进入结果分析。2.2 小鼠胎肝FLK-1+细胞的表型特征 从怀孕第17-19天小鼠中提取胎鼠的单个肝细胞悬液浮经锥虫蓝拒染法显示细胞活力均超过95%。采用免疫磁珠方法分离的胎肝FLK-1+细胞经流式细胞分析仪检测显示胎肝FLK-1+细胞纯度超过98%，见图1。未经诱导的胎鼠肝脏FLK-1+细胞极少数表达白蛋白(0.6%)，经肝细胞生长因子和表皮生长因子诱导后96.38%的FLK-1+细胞表达白蛋白，获得了肝细胞的表型特征(P 0.05)，见图2。1001011021030.098.3FLK-10.01.7100 101 102 103100101102103lsotype0.01.00.698.4FLK-1100 101 102 103ALB注：分离的胎肝FLK-1+细胞纯度超过98%。图1 昆明小鼠胎肝FLK-1+细胞诱导前白蛋白的表达情况Figure 1 Expression of albumin in mouse fetal liver FLK-1+ cells before induction2.3 半定量RT-PCR方法检测FLK-1+细胞诱导前后目的基因mRNA表达情况 未经诱导的FLK-1+细胞表达Oct-3/4 mRNA的相对表达量为4.950.70，经肝细胞生长因子、表皮生长因子、肝细胞生长因子+表皮生长因子等诱导后FLK-1+细胞Oct.3/4表达明显下降或消失，其相对表达量分别为：肝细胞生长因子组0.890.20、肝细胞生长因子+表皮生长因子组0.340.26和表皮生长因子组0.560.34，与未诱导细胞比差异有显著性意义(P均 0.05)，见图3。未经诱导的FLK-1+细胞表达Rex-l基因mRNA相对表达量为5.480.22，经肝细胞生长因子、表皮生长因子、肝细胞生长因子+表皮生长因子等诱导后，FLK-1+细胞Rex-1表达明显下降或消失，其相对表达量分别为：肝细胞生长因子组0.870.06、肝细胞生长因子+表皮生长因子组0.260.04和表皮生长因子组0.520.07，与未诱导细胞比差异均有显著性意义(P 0.05)，见图3。图2 昆明小鼠胎肝FLK-1+细胞诱导3 d后白蛋白的表达情况Figure 2 Expression of albumin in mouse fetal liver FLK-1+ cells after 3-d induction表皮生长因子注：未经诱导的胎鼠肝脏FLK-1+细胞极少数表达白蛋白，经肝细胞生长因子和表皮生长因子诱导后96.38%的FLK-1+细胞表达白蛋白，获得了肝细胞的表型特征。 0.08%isotype肝细胞生长因子94.01%96.38%注：分离的胎肝FLK-1+细胞纯度超过98%。肝细胞生长因子+表皮生长因子图3 RT-PCR检测昆明小鼠胎肝细胞诱导前后的FLK-1、Oct-3/4、Rex-1等基因表达变化Figure 3 FLK-1, Oct-3/4, Rex-1 expression before and after induction of the mouse feta liver cells by RT-PCR0 HGF HGF+EGF EGFFLK-1注：经肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子+表皮生长因子(HGF+EGF)诱导后FLK-1+细胞Oct-3/4、Rex-1、FLK-1基因表达明显下降或消失。OCT-3/4Rex-1未经诱导的FLK-1+细胞表达FLK-1基因mRNA相对表达量为3.440.3，经肝细胞生长因子、表皮生长因子、肝细胞生长因子+表皮生长因子等诱导后，FLK-1+表达明显下降或消失，其相对表达量分别为：肝细胞生长因子组0.000.00、肝细胞生长因子+表皮生长因子组0.180.01和表皮生长因子组0.220.01，与未诱导细胞比差异有均显著性意义(P 0.05)，见图3。2.4 FLK-1+细胞静脉输注对急性药物性小鼠肝损伤模型组的生化指标的影响 见图4，图5。对照组实验组P = 0.003P =0.0436 0005 0004 0003 0002 0001 0000U/L ALTASD注：细胞移植后16 h对照组小鼠血清谷草转氨酶(ASD)和谷丙转氨酶(ALT)均显著高于移植FLK-1+胎肝细胞的实验组 图4 FLK-1+细胞移植对急性药物性小鼠肝损伤模型血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶的影响Figure 4 Effect of FLK-1+ cells transplantation on serum alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase in mice with acute liver injury对照组实验组P 0.00135302520151050g/L 纤维蛋白原白蛋白总胆红素 注：对照组小鼠血清白蛋白明显低于移植FLK-1+胎肝细胞的实验组；两组小鼠血清总胆红素和纤维蛋白原的差异均无显著性意义。图5 FLK-1+细胞移植对急性药物性小鼠肝损伤模型血清白蛋白、总胆红素和纤维蛋白原的影响Figure 5 Effect of FLK-1+ cells transplantation on serum albumin, total bilirubin and fibrinogen in mice with acute liver injury经尾静脉输注1106个FLK-1+细胞后16 h，实验组和对照组每只小鼠分别抽静脉血测定生化指标，移植后16 h对照组小鼠血清谷草转氨酶(4 0951 240) U/L和谷丙转氨酶(3 0851 200) U/L均明显高于实验组谷草转氨酶 (1 614814) U/L，谷丙转氨酶(1 714990) U/L，而对照组小鼠血清白蛋白(18.61.4) g/L明显低于实验组(27.03.2) g/L，差异均有显著性意义(P 0.05)。2.5 FLK-1+细胞静脉输注对急性药物性小鼠肝损伤模型组死亡率的影响 小鼠肝损伤的急性模型对照组共20只：8 h死亡4只，16 h死亡4只，24 h死亡8只，64 h总死亡率达80%；实验组26只：8 h内死亡6只，16 h死亡2只，24 h死亡4只，24 h后死亡4只，64 h总死亡率达61.5%；但两组间生存曲线差异无显著性意义(P 0.05)，见图6。0 20 40 60P=0.248累计生存函数治疗组生存时间（h）图6 实验组和对照组急性肝损伤小鼠生存曲线Figure 6 Survival curves of acute liver injury mice in two groups累计生存函数对照组治疗组生存时间(h)注：对照组小鼠64 h总死亡率达80%；移植FLK-1+胎肝细胞的实验组小鼠64 h总死亡率达61.5%；两组间生存曲线差异无显著性意义。（h）3 讨论 Discussion急性肝损伤即急性肝衰竭主要指在短期时间内由于各种诱发因素出现的各种转氨酶的极剧升高，白蛋白下降，球蛋白升高，A/G比值降低，可导致肝脏不可逆的损伤，病理类型有大量的肝细胞变性坏死，使网状细胞支架塌陷，甚至导致个体死亡。目前急性肝功能衰竭发生率较高，随着工业的迅速发展，有逐渐增多的趋势，其中以化工原料导致急性肝损害有增多趋势，严重急性肝损害将导致急性肝衰竭，治疗以原位肝脏移植为首选，但由于其费用高，供肝紧缺等问题原位肝移植尚未能广泛应用。近年来随着医学的深入发展，干细胞移植治疗对于修复肝损伤，修复肝损伤的程度有明显的疗效，其在急性肝损伤治疗上将发挥重要作用1-3。小鼠是研究肝脏再生和肝脏干细胞理想的动物模型，胚胎干细胞有增殖能力强，数量多，多分化能力强，移植能力强，分离、培养较容易等一系列优点。作者前期研究发现正常孕小鼠中胚胎肝脏内存在的FLK-1+干细胞。FLK-1+作为血管内皮细胞生长因子的酪氨酸激酶受体，广泛应用于识别造血干细胞、血管内皮祖细胞等6-7；Yamashita等8证明起源于胚胎干细胞的FLK-1+细胞可分化为内皮细胞和平滑肌细胞。实验结果表明，胎肝FLK-1+细胞具有分化肝细胞的潜能，未经诱导的FLK-1+细胞不表达白蛋白，而经肝细胞生长因子诱导后高表达白蛋白，并证明FLK-1+细胞的Oct-3/4和Rex-1表达随着干细胞分化明显下降或消失。而Oct-3/4和Rex-1对于维持胚胎干细胞处于未分化状态十分重要9-10，提示分化后FLK-1+细胞失去干细胞特性。CCl4是一种强烈的能够引起肝细胞坏死的化合物，其可在动物体内部分重现人类肝病模式，故一直被研究者作为诱发各种肝损伤模型的造模剂，以期阐明肝脏毒性的发生机制和药物的药理机制11。实验以CCl4药物性肝损伤模型小鼠为实验对象进行体内试验，结果表明FLK-1+细胞移植的小鼠血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶明显降低，血清BSA明显升高，提示FLK-1+细胞移植对CCl4药物性肝损伤模型小鼠肝脏功能的改善有一定的作用。其机制可能是：经过诱导后FLK-1+细胞已经进入了自调控生长，移植入损伤肝脏后在微环境影响下向成熟肝细胞分化，并表达和分泌白蛋白，从而提高肝细胞的合成功能。肝损伤时肝内汇管区星形细胞扩增促使肝细胞生长因子、转化生长因子、表皮生长因子产生和释放12，刺激FLK-1+细胞向肝系细胞分化，发挥合成白蛋白功能，提高血清白蛋白。但是实验组小鼠血清纤维蛋白原水平未见提高，提示FLK-1+细胞移植对CCl4药物性肝损伤模型小鼠肝功能的改善是不全面的。另外，实验组死亡率较对照组略有下降，但两组的生存曲线差异无统计学意义。其原因可能是多方面的：CCl4对多种重要脏器均有毒性作用，其接触浓度与频度可影响其作用部位及毒性。高浓度时，首先是中枢神经系统受累，随后累及肝、肾，且可增加心肌对肾上腺素的敏感性，引起严重心律失常。因而单纯改善肝功能不一定能降低其死亡率。急性肝损伤死亡率部分可能与凝血功能未纠正有关，而FLK-1+细胞移植并不能有效提高血清纤维蛋白原水平和改善其凝血功能。综上所述，胎鼠肝脏FLK-1+细胞移植能有效的改善急性肝损伤模型小鼠的肝功能，增加白蛋白的合成，降低血清转氨酶水平，提示胎肝FLK-1+细胞移植在肝再生过程中具有重要的作用，具有广阔的临床应用价值。作者贡献：设计、实施、评估为本文作者，均受过专业培训。利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。学术术语：受体酪氨酸激酶-是最大的一类酶联受体，它既是受体，又是酶，能够同配体结合，并将靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化。作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。4 参考文献 References1 Yu Y, Yao AH, Chen N, et al.Mesenchymalstem cells over-expressing hepatocyte growth factorimprove small-for-size liver grafts regeneration.Mol Ther.2007;15(7): 1382- 1389.2 Pai M, Zacharoulis D，Milicevic MN,et al.Autologous infusion of expanded mobilized adult bone marrow - derived CD34+ cells into patientswith alcoholic liver cirrhosis.Am J Gastroenterol. 2008;30(7): 30-33.3 Terai S, Ishikawa T,Omori K, et al.Improved liver function in patientswith liver cirrhosis after autologous bone marrow cell infusion therapy. 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