SN∕T 2574-2019 出口蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的测定 液相色谱-质谱∕质谱法(出入境检验检疫).pdf

以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准中华人民共和国海关总署发 布ICS 65.050C 532019-12-27 发布2020-07-01 实施出口蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留 量的测定液相色谱 - 质谱 / 质谱法Determination of amitraz and metabolites residues in royal-jelly for import and export LC-MS/MS method SN/T 25742019代替 SN/T 25742010以正式出版文本为准以正式出版文本为准ISN/T 25742019前 言本标准依据按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准代替 SN/T 25742010进出口蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量检测方法 气相色谱 -质谱法 。本标准与 SN/T 25742010 相比，主要技术变化如下：将标准名称改为出口蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的测定 液相色谱 - 质谱 / 质谱法 ，相应英文名称改为Determination of amitraz and metabolites residues in royal-jelly for exportLC-MS/MS method 。将第一法 气相色谱 - 质谱法删除。增加液相色谱 - 质谱 / 质谱法请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：浙江省检验检疫科学技术研究院。本标准主要起草人：侯建波、谢文、洪灯、张文华、盛涛、毛壬熠、汪鹏、颜颖鹏。本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T 25742010。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 25742019出口蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的测定 液相色谱-质谱 / 质谱法1范围本标准规定了蜂王浆中双甲脒及其代谢产物单甲脒，2, 4- 二甲基苯基甲酰胺和 2, 4- 二甲基苯胺残留量的液相色谱 - 质谱 / 质谱法测定方法。本标准适用于蜂王浆中双甲脒及其代谢产物单甲脒，2, 4- 二甲基苯基甲酰胺和 2, 4- 二甲基苯胺残留量的测定和确证。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和实验方法。3方法提要试样加氨水溶液稀释后用氨水乙腈溶液沉淀蛋白并提取，通过中性氧化铝固相萃取柱对提取液进行净化，采用液相色谱-质谱 / 质谱仪检测，双甲脒、单甲脒和 2, 4- 二甲基苯胺采用内标法定量，2, 4- 二甲基苯基甲酰胺采用外标法定量。4试剂和材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。4.1乙腈：色谱纯。4.2甲酸：色谱纯。4.3氨水：含量 25%28%，分析纯。4.45% 氨水溶液：量取 95 mL 水和 5 mL 氨水（4.3） ，混匀。4.55% 氨水乙腈溶液：量取 95 mL 乙腈（4.1）和 5 mL 氨水（4.3） ，混匀。4.60.15% 甲酸溶液：量取 900 mL 水和 1.5 mL 的甲酸（4.2） ，混匀，定容至 1 000 mL。4.7双甲脒标准品（C19H23N3，CAS 号： 33089-61-1） ：纯度大于 99.0。4.82, 4- 二甲基苯胺标准品（C8H11N，CAS 号： 95-68-1） ：纯度大于 99.0。4.9单甲脒标准品（C10H14N2，CAS 号： 33089-74-6） ：纯度大于 99.0。4.102, 4- 二甲基苯基甲酰胺标准品（C9H11NO，CAS 号： 60397-77-5 ：纯度大于 99.0。4.11双甲脒 -D6同位素内标标准品（C19H17D6N3） ：纯度大于 99.0。4.122, 4- 二甲基苯胺 -D6同位素内标标准品（C8H5D6N） ：纯度大于 99.0。4.13双甲脒标准储备液：准确称取 10 mg（精确到 0.1 mg）双甲脒标准品（4.7）于 100 mL 容量瓶中，用乙腈（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为 100 g/mL 的标准储备液，于 0 4冰箱内储存，有效期 4 周。以正式出版文本为准2SN/T 257420194.142, 4- 二甲基苯胺标准储备液：准确称取 10 mg（精确到 0.1 mg）2, 4- 二甲基苯胺标准品（4.8）于100 mL 容量瓶中，用乙腈（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为 100 g/mL 的标准储备液，于 0 4冰箱内储存，有效期 4 周。4.15单甲脒标准储备液：准确称取 10 mg（精确到 0.1 mg）单甲脒标准品（4.9）于 100 mL 容量瓶中，用乙腈（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为 100 g/mL 的标准储备液，于 0 4冰箱内储存，有效期 4 周。4.162, 4- 二甲基苯基甲酰胺标准储备液：准确称取 10 mg（精确到 0.1 mg）2, 4- 二甲基苯基甲酰胺标准品（4.10）于 100 mL 容量瓶中，用乙腈（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为 100 g/mL 的标准储备液，于 0 4冰箱内储存，有效期 1 周。4.17双甲脒 -D6同位素内标标准储备液：准确称取 10 mg（精确到 0.1 mg）双甲脒 -D6同位素内标标准品（4.11）于 100 mL 容量瓶中，用乙腈（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为 100 g/mL 的标准储备液，于 0 4冰箱内储存。4.182, 4-二甲基苯胺-D6同位素内标标准储备液：准确称取10 mg （精确到0.1 mg） 2, 4-二甲基苯胺-D6同位素内标标准品（4.12）于 100 mL 容量瓶中，用乙腈（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为 100 g/mL 的标准储备液，于 0 4冰箱内储存。4.19标准工作溶液：根据需要用乙腈（4.1） 将标准储备液稀释至合适浓度的标准工作溶液，现用 现配。4.20中性氧化铝固相萃取柱：1 g，3mL（3 mL 乙腈和 3 mL 5% 氨水乙腈溶液依次活化） ，或相当者。4.210.22 m 微孔滤膜，有机相。5仪器和设备5.1液相色谱 - 质谱 / 质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI） 。5.2旋涡混合器。5.3离心机：转速大于 10 000 r/min。5.4电子天平：感量为 0.01 g 和 0.1 mg。5.5氮吹仪。5.6具塞离心管：15 mL 和 50 mL。6试样制备与保存取代表性样品约 500 g，将其用力搅拌均匀，将试样均分成两份装入洁净容器内，密封，并标明标记。一份作为试验样，另一份在 -18 以下保存。在制样过程中，应防止样品受到污染或发生所测物残留量的变化。7测定步骤7.1提取称取约 2 g 试样（精确至 0.01 g） 于 50 mL 聚塞离心管中，加入同位素内标（200 L，100 ng/mL） ， 加 8 mL 5% 氨水溶液（4.4） ，2 000 r/min，涡旋混合 1 min，静置 5 min，加 10 mL 5% 氨水乙腈溶液（4.5） ，2 000 r/min，涡旋混匀1 min，静置5 min，加5%氨水乙腈溶液 （4.5） 定容至20 mL，涡旋混匀，8 500 r/min 离心 5 min，移取上清液 2.0 mL，加 2 mL 5% 氨水乙腈溶液（4.5） ，涡旋混匀，8 500 r/min离心 5 min，取上清液待净化。以正式出版文本为准3SN/T 257420197.2净化将提取溶液转移至中性氧化铝固相萃取柱（4.20） ，接收流出液，加 2 mL 5% 氨水乙腈溶液（4.5）洗涤中性氧化铝固相萃取柱，接收全部流出液，40 下氮气吹至 0.5 mL 以下，加乙腈（4.1）至 2 mL，再加 2 mL 水，涡旋混匀，过 0.22 m 微孔滤膜（4.21） ，待 LC-MS/MS 测定。7.3测定7.3.1液相色谱参考条件7.3.1.1液相色谱柱：C18色谱柱，150 mm 4.6 mm （内径） ，5 m，或相当者。7.3.1.2进样量：10 L。7.3.1.3柱温：25。7.3.1.4流动相：0.15% 甲酸溶液（4.6）和乙腈（4.1）梯度洗脱，见表 1。表 1液相色谱梯度洗脱程序时间 /min流速 /mL/min0.15% 甲酸溶液 /%乙腈 /%0.000.460.040.08.000.435.065.09.000.75.095.014.000.75.095.015.000.760.040.016.000.460.040.019.000.460.040.07.3.2质谱/质谱参考条件7.3.2.1电离方式：电喷雾电离，正离子。7.3.2.2扫描模式：多反应监测（MRM） 。7.3.2.3鞘气、碰撞气等均为高纯氮气；使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求，参考条件及监测离子对（m/z）见附录 A。7.4标准曲线的绘制取空白样品按照 7.1 和 7.2 处理。用所得的样品溶液将标准工作溶液稀释得到浓度为 0.00 ng/mL、0.25 ng/mL、0.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL 的标准工作曲线溶液，按浓度由低到高的顺序进样检测，外标法以定量离子峰面积浓度作图，内标法以定量离子峰面积与内标物峰面积比值浓度作图，得到标准曲线。7.5定性按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致（变化范围在 2.5% 之内） ；样品中目标化合物的定性离子的相对丰度与浓度相当的标准溶液一致，相对丰度偏差不超过表 2 的规定，则可判断样品中存在待测化合物。以正式出版文本为准4SN/T 25742019表 2测定相对离子丰度最大容许偏差相对离子丰度（基峰）/%5020501020 10容许的相对误差 /%202530507.6定量待测样液中化合物的响应值应在标准曲线线性响应范围内。如果待测样液中化合物的响应值超过线性范围则应稀释后再进样分析。 在上述色谱条件下双甲脒、单甲脒、2, 4-二甲基苯基甲酰胺和2, 4-二甲基苯胺的参考保留时间分别约为 14.2 min，3.3 min，7.1 min 和 3.5 min，标准溶液的总离子流图和选择性离子流图参见图 B.1 和图 B.2。8空白试验除不加试样外，均按“7”测定步骤进行。9结果计算和表述试样中待测化合物的含量由色谱数据处理软件或按式（1）计算获得，计算结果需扣除空白值： 10001000=mAVcAXsii （1）式中：Xi 试样中待测化合物的含量，单位为毫克每千克（mg/kg） ；A 样液中待测化合物峰面积与内标的峰面积比值（外标法为待测化合物峰面积） ；Ci 空白基质加标标准溶液中待测化合物的浓度，单位为微克每毫升（g/mL） ；V 样液最终定容体积，单位为毫升（mL） ；As 空白基质加标标准溶液中待测化合物峰面积与内标的峰面积比值（外标法为待测化合物峰面积） ；m 试样的质量，单位为克（g） 。10定量限、回收率10.1定量限本方法定量限为 0.005 mg/kg。10.2回收率蜂王浆中双甲脒、单甲脒、2, 4- 二甲基苯基甲酰胺和 2, 4- 二甲基苯胺添加情况及回收率范围见表 3。以正式出版文本为准5SN/T 25742019表 3液相色谱 - 质谱 / 质谱法测定蜂王浆中双甲脒、单甲脒、 2, 4- 二甲基苯基甲酰胺和 2, 4- 二甲基苯胺添加情况及回收率范围化合物添加浓度 /（mg/kg）回收率 /% 双甲脒0.00592.01100.0184.097.00.191.81080.2107110单甲脒0.00569.477.80.0171.080.80.168.981.10.273.279.12, 4- 二甲基苯基甲酰胺0.00580.01000.0194.01020.11011070.297.71052, 4- 二甲基苯胺0.00580.094.00.0189.01060.187.21090.2108110以正式出版文本为准6SN/T 25742019附录A（规范性附录）6495 LC-MS/MS 系统电喷雾离子源参考条件1）A.1电离方式：电喷雾电离。A.2扫描模式：正离子。A.3监测模式：多反应监测（MRM） 。A.4离子源温度：130 （Gas Temp） 。A.5气体流速：16 L/min（Gas Flow） 。A.6鞘气温度：250 （Sheath Gas Temp） 。A.7鞘气流速：11 L/min（Sheath Gas Flow） 。A.8毛细管电压：2 500 V（Capillary） 。A.9定量离子对、定性离子时、碰撞气能量见表 A.1表 A.1定量离子对、定性离子对、碰撞气能量编号化合物离子对 /m/z碰撞气能量（CE）/V内标物1双甲脒294.2/163.2a294.2/122.21433双甲脒 -D62单甲脒163.2/122.2a163.2/107.217302, 4- 二甲基苯胺 -D632, 4- 二甲基苯基甲酰胺150.1/107.1a150.1/132.1150.1/122.124141642, 4- 二甲基苯胺122.1/107.1a122.1/77.117342, 4- 二甲基苯胺 -D65双甲脒 -D6300.2/166.11562, 4- 二甲基苯胺 -D6128.1/110.019 a 为定量离子对。1） 非商业性声明：表 A.1 所列参数是在 Agilent 6495 型液相色谱 - 质谱 / 质谱仪完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家和型号的仪器。以正式出版文本为准7SN/T 25742019附录B（资料性附录）标准溶液色谱图图 B.1双甲脒、双甲脒 -D6、单甲脒、2, 4- 二甲基苯基甲酰胺、2, 4- 二甲基苯胺和 2, 4- 二甲基苯胺 -D6标准溶液液相色谱 - 质谱 / 质谱法总离子流图（浓度 0.5 ng/mL） a）b）c）a） b） c）d）e）f）d） e） f）图 B.2双甲脒、双甲脒 -D6、单甲脒、2, 4- 二甲基苯基甲酰胺、2, 4- 二甲基苯胺和 2, 4- 二甲基苯胺 -D6标准溶液液相色谱 - 质谱 / 质谱法选择性离子流图（浓度 0.5 ng/mL）以正式出版文本为准8SN/T 25742019Foreword1）This standard was drafted in accordance with GB/T 1.12009 “.This standard replaces SN/T 25742010 Determination of amitraz and its metabolites residues in royal-jelly for import and export GC-MS.Compared with SN/T 25742010, the main technical changes are as follows:The topic of standards was changed to “Determination of amitraz and metabolites residues in royal-jelly for export-LC-MS/MS method”.Delete the first method: GC-MS method.Increase the method: LC-MS/MS method.Please note that some of the elements of this standard may involve patents, but the standards organization does not assume responsibility for identifying these patents.This standard was proposed by and is under the charged of General Administration of Customs, of the People s Republic of China.This standard was drafted by Zhejiang Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine.The main drafters of this standard are Hou Jianbo, Xie Wen, Hong Deng, Zhang Wenhua, Sheng Tao, Mao Renyi, Wang Peng, Yan Yingpeng.This standard replaces the previous standard version: SN/T 25742010.1） Note: This english version, a translation from the chinese text, is solely for guidance.以正式出版文本为准9SN/T 25742019Determination of amitraz and its metabolites residues in royal-jelly for export LC-MS/MS method1ScopeThis standard specifies the method for determination of amitraz, N-2, 4-dimethylphenyl-N-methylformamidine, N- (2, 4-dimethylphenyl) formamide and 2, 4-dimethyl aniline residues in royal jelly by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).This standard is applicable to determination and confirmation of amitraz, N-2, 4-dimethyl phenyl-N-methylformamidine, N- (2, 4-dimethylphenyl) formamide and 2, 4-dimethyl aniline residues in royal jelly.2Normative referencesFollowing documents are necessary for this standard. For dated references, only dated editions shall apply to this standard. For undated references, the latest edition of the normative document referred to applies.GB/T 6682Water for analysis Laboratory usrSpe cification and test methods3SummaryThe residues are extracted with ammonia acetonitrile from royal jelly sample, then the extract is cleaned up by N-Al2O3 solid phase extraction column. The residues are determined by LC-MS/MS and quantified by internal standard method amitraz, N-2, 4-dimethyl phenyl-N-methylformamidine and 2, 4-dimethyl aniline and external standard method N-(2, 4-dimethylphenyl)formamide.4Reagents and MaterialsUnless otherwise specified, all reagents used should be analytical reagent grade. “Water” is firstgrade water prescribed by GB/T 6682.4.1Acetonitrile: HPLC grade.4.2Formic acid: HPLC grade.4.3Ammonia ：25%28%, analytical grade。4.45% ammonia solution ：dilute 5 mL ammonia (4.3) to 100 mL with water.4.55% ammonia of acetonitrile solution ：dilute 5 mL ammonia (4.3) to 100 mL with acetonitrile(4.1).4.60.15% formic acid solution ：dilute 1.5 mL formic acid (4.2) to 1 000 mL with water.4.7Amitraz: C19H23N3, CAS No. 33089-61-1, purity 99.0%.4.82, 4-dimethyl aniline ( C8H11N，CAS No: 95-68-1) purity 99.0%.4.9N-2, 4-dimethyl phenyl-N-methylformamidine(DMPF) (C10H14N2, CAS No: 33089-74-6): purity 99.0%.4.10N-(2, 4-DiMethylphenyl) formamide (DMF) (C9H11NO, CAS No: 60397-77-5) purity 99.0%.4.11Amitraz-D6 (C19H17D6N3) purity 99.0%.4.122, 4-dimethylaniline-D6 （C8H5D6N）: purity 99.0%.以正式出版文本为准10SN/T 257420194.13Standard stock solution of amitraz: accurately weigh lomg amitraz (4.7) and dissolve with acetonitrile(4.1) to prepare standard stock solutions of 100 g/mL. It should be stored in brown volumtric flask at 0 4 for 4 weeks.4.14Standard stock solution of 2, 4-dimethyl aniline: accurately weigh /omg 2, 4-Dimethyl aniline standards(4.8) and dissolve with acetonitrile(4.1) to prepare standard stock solutions of 100 g/mL. It should be stored in brown volumtric flask at 0 4 for 4 weeks.4.15Standard stock solution of DMPF: accurately weigh /omg DMPF (4.9) and dissolve with acetonitrile(4.1) to prepare standard stock solutions of 100 g/mL. It should be stored in brown volumtric flask at 0 4 for 4 weeks.4.16Standard stock solution of DMF: accurately weigh DMF /omg and dissolve with acetonitrile(4.1) to prepare standard stock solutions of 100 g/mL. It should be stored in brown volumtric flask at 0 4 for 1 weeks.4.17Standard stock solution of Amitraz-D6: accurately weigh /omg of Amitraz-D6 (4.11) and dissolve with acetonitrile(4.1) to prepare standard stock solutions of 100 g/mL. It should be stored in brown volumtric flask at 0 4 .4.18Standard stock solution of 2, 4-dimethylaniline-D6: accurately weigh /omg of 2, 4-dimethylaniline-D6 standards(4.12) and dissolve with acetonitrile(4.1) to prepare standard stock solutions of 100 g/mL. It should be stored in brown volumtric flask at 0 4 .4.19Intermediate working solution: according to the concentration required, pipette appropriate volume of the above standard stock solutions and dilute to proposed working solution with acetonitrile (4.1)4.20N-Al2O3 solid-phase extraction (SPE) column: 1 g, 3 mL or equivalent, It should be conditioned with 3 mL acetonitrile followed by 3 mL 5% ammonia of acetonitrile solution(4.5).4.21Membrane filter: 0.22 m, organic type.5Apparatus and equipment5.1Liquid chromatography-tandem mass spectrometry: equipped with electrospray ionization source (ESI).5.2Vortex mixer.5.3Centrifuge: 10 000 r/min.5.4Analytical balances: accuracy 0.01 g and 0.1 mg.5.5Nitrogen blowing instrument.5.6Stoppered centrifuge tube: 15 mL and 50 mL.6Sample preparation and storageTake appropriately 500 g of representative sample, mixed thoroughly. Then the homogenized sample is placed in a clean container as the test sample, which is sealed and labeled. Keep the prepared sample into two sample bottles, seal and label. The rest sample is stored at -18 in refrigerator. In the course of sample preparation, precautions should be taken to avoid contamination or any factors which may cause the change of residue content.7Analysis procedure7.1ExtractionWeigh 2 g test sample (accurate to 0.01g) into a 50 mL centrifuge tube. Add internal standard solution (200 L, 100 ng/mL). Add 8 mL 5% ammonia solution(4.4), vortex for 1 min under 2 000 r/min, wait for 5 min, add 10 mL 以正式出版文本为准11SN/T 257420195% ammonia of acetonitrile solution(4.5), vortex for 1 min under 2 000 r/min, wait for 5 min, add 5% ammonia of acetonitrile solution(4.5) until total volume is 20 mL. Centrifuge for 5 min under 8 500 r/min. Transfer 2.0 mL supernatant layer into a container. Add 2 mL 5% ammonia of acetonitrile solution(4.5), mix it, centrifuge for 5 min under 8 500 r/min. Collect the supernatant to clean up.7.2Clean upTransfer the solution into N-Al2O3 solid-phase extraction (SPE) column (4.20)， collect the eluate. Add 2 mL 5% ammonia of acetonitrile solution (4.5) elute the column deeply. The solution is evaporated to below 0.5 mL in a water bath below 40 to dryness. The residues was reconstituted in 2.0 mL acetonitrile and 2.0 mL water, mix it. The solution is passed through a 0.22 m filter (4.21). The filtrate is ready for LC-MS/MS determination.7.3Determination7.3.1HPLC operating condition7.3.1.1LC column: C18, 150 mm 4.6 mm (i.d.), 5m, or equivalent column.7.3.1.2Injector volumn: 10 L.7.3.1.3Column ：25 .7.3.1.4Mobile phase: see Table 1.Table 1Gradient program of mobile phaseTime/minFlow/mL/min0.15% formic acid water solution/%Acetonitrile/%0.000.460.040.08.000.435.065.09.000.75.095.014.000.75.095.015.000.760.040.016.000.460.040.019.000.460.040.07.3.2MS/MS operating condition7.3.2.1Ion source: electrospray ionization source (ESI), positive-ion mode.7.3.2.2Monitor model: multiple reaction monitoring (MRM).7.3.2.3Gas are all high purity nitrogen (N2) or equivalent, optimize the flow rate of each gas and ion source temperature to reach the requirement of the sensitivity of mass spectrometry. Detailed parameters and monitoring ion pairs (m/z) are listed in annex A.7.4Standard working curveThe operation of the blank test is the same as that described in the method of determination (analysis procedure 7.1 and 7.2), but with omission of sample addition. The standard solution was spiked into blank matrix solution, and then get the concentration of standard working curve are 0.00 ng/mL, 0.25 ng/mL, 0.5 ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL, 以正式出版文本为准12SN/T 2574201915 ng/mL, respectively.7.5QualitativeUnder above determination condition, the variation range of the retention time for the peak of analyte in unknown sample and in the standard working solution are not be out of range of 2.5%. For the same analysis batch and the same compound, the variation range of the ion ratio between the two daughter ions for the unknown sample and the standard working solution at the similar concentration are not be out of range of table 2, and then the corresponding analyte must be present in the sample.Table 2Maximum permitted tolerances for relative ion intensities while confirmationRel