4种真菌发酵对三七叶化学成分及药理活性的影响.pdf

198 2023,Vol.44,No.20 食品科学 生物工程4 种真菌发酵对三七叶化学成分及 药理活性的影响杨金梅1,2，李云嵌1,3，何霞红1,*，王振兴1,3,*（1.西南林业大学 西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，云南 昆明 650224；2.西南林业大学林学院，云南 昆明 650224；3.西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650224）摘 要：以三七叶为原料，选择米根霉、粗糙脉孢菌、红曲霉和鲁氏毛霉4 种真菌对其进行发酵，测定发酵过程中三七叶总皂苷、总多糖、总酚和总黄酮的含量变化，评估其体外抗氧化活性和-葡萄糖苷酶抑制活性的变化，并采用超高效液相色谱-质谱对发酵前后三七叶的代谢谱进行分析。结果表明：4 种真菌均可使三七叶中总皂苷和总多糖含量显著降低，但米根霉、粗糙脉孢菌和红曲霉可提高总酚含量，而米根霉和鲁氏毛霉可提高总黄酮含量。真菌发酵35 d后，三七叶的抗氧化活性明显增强，其中红曲霉发酵3 d的增强效果最好，可使三七叶的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、2,2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基清除能力以及铁离子还原能力分别提高14.30%、5.13%、18.40%。此外，真菌发酵可先降低后提高三七叶的-葡萄糖苷酶抑制活性，其中红曲霉在发酵6 d后可使其提高16.03%。进一步的非靶向代谢组学分析，从三七叶中共鉴定出573 种代谢物，经红曲霉发酵3 d后，其上调代谢物明显少于下调代谢物，主要为氨基酸、生物碱、碳水化合物、脂类、酚类、类黄酮以及萜类化合物等；对其中的21 种皂苷类化合物进行进一步分析，发现其中只有人参皂苷 F2显著上调，另有8 种皂苷显著下调；对差异代谢物进行京都基因与基因组百科全书富集分析发现，嘌呤代谢、嘧啶代谢、类黄酮生物合成、辅助因子的生物合成等是三七叶在发酵过程中最可能的代谢通路。综上，真菌发酵尤其是红曲霉发酵是改善三七功能活性的绿色有效手段，其可通过多个作用途径使三七叶的代谢物变化，影响其功能活性，本研究可为三七叶的绿色加工提供科学参考。关键词：三七叶；发酵；化学成分；抗氧化活性；-葡萄糖苷酶抑制活性；代谢组学Influence of Fermentation by Four Fungi on Chemical Constituents and Pharmacological Activities of Panax notoginseng LeavesYANG Jinmei1,2,LI Yunqian1,3,HE Xiahong1,*,WANG Zhenxing1,3,*(1.Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Utilization in the Southwest Mountains of China,Ministry of Education,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China;2.College of Forestry,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China;3.College of Life Science,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)Abstract:In this study,Panax notoginseng leaves(PNL)were separately fermented by Rhizopus oryzae,Neurospora crassa,Monascus and Mucor rouxianus,and changes in the contents of total saponins,total polysaccharides,total phenolics,and total flavonoids,as well as in vitro antioxidant activity and-glucosidase inhibitory activity of PNL during the fermentation process were assessed.Additionally,the metabolite profiles of raw and fermented PNL were analyzed by ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry(UPLC-MS/MS).The results indicated that the contents of total saponins and total polysaccharides in PNL were significantly reduced by fermentation with each of these four fungi.收稿日期：2023-04-16基金项目：云南省郑文杰专家工作站项目（202205AF150018）；云南省农业联合专项面上项目（202101BD070001-109）；云南省中央引导地方科技发展资金项目（202207AB110015）；云南省云岭学者项目；云南省“兴滇英才支持计划”创业人才、青年人才项目第一作者简介：杨金梅（1998）（ORCID:0009-0007-5692-1107），女，硕士研究生，研究方向为中草药的功能活性。E-mail:*通信作者简介：何霞红（1975）（ORCID:0000-0002-8702-2135），女，教授，博士，研究方向为林下药材的种植和开发利用。E-mail:王振兴（1984）（ORCID:0000-0002-6110-9216），男，讲师，博士，研究方向为林下药食资源的开发利用。E-mail:zhenxing_生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.20 199Interestingly,R.oryzae,N.crassa and Monascus were found to increase the content of total phenols,while Rhizopus oryzae and Mucor rouxianus increased the total flavonoid content.Fermentation for 35 days significantly enhanced the antioxidant activity of PNL,and the most pronounced effect was achieved with Monascus fermentation for three days,which increased the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)and 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS)radical cation scavenging capacity and ferric reducing capacity by 14.30%,5.13%,and 18.40%,respectively.Moreover,the-glucosidase inhibitory activity of PNL initially decreased and then increased during fungal fermentation,which increased by 16.03%after Monascus fermentation for six days.By untargeted metabolomics analysis,573 metabolites were identified from PNL.After three days of Monascus fermentation,the up-regulated metabolites were significantly less than the down-regulated ones,and the predominant up-regulated metabolites were amino acids,alkaloids,carbohydrates,lipids,phenols,flavonoids,and terpenoids.Furthermore,analysis of the 21 saponins showed that only ginsenoside F2 was significantly up-regulated,while eight other saponins were significantly down-regulated.The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)enrichment analysis indicated that co-factor biosynthesis,flavonoid biosynthesis,purine metabolism,and pyrimidine metabolism were the most probable metabolic pathways during the fermentation process.In conclusion,fungal fermentation,especially Monascus fermentation,can effectively improve the functional activity of P.notoginseng by metabolic alterations through various pathways.Therefore,this study provides a scientific reference for the green processing of PNL.Keywords:Panax notoginseng leaves;fermentations;chemical composition;antioxidant activity;-glucosidase inhibitory activity;metabolomicsDOI:10.7506/spkx1002-6630-20230416-149中图分类号：TS255.36 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）20-0198-14引文格式：杨金梅,李云嵌,何霞红,等.4 种真菌发酵对三七叶化学成分及药理活性的影响J.食品科学,2023,44(20):198-211.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230416-149.http:/YANG Jinmei,LI Yunqian,HE Xiahong,et al.Influence of fermentation by four fungi on chemical constituents and pharmacological activities of Panax notoginseng leavesJ.Food Science,2023,44(20):198-211.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230416-149.http:/三七（Panax notoginseng）为我国传统名贵植物，为五加科（Araliaceae）人参属，主要分布于我国云南文山、广西、广东、福建等地1。三七的叶、果以及根茎均可药用，其味甘、微苦，性温，现代药理研究表明，三七具有镇痛、抗炎、保肝利胆、抗心律失常、抗血栓等作用2。三七叶是云南当地特色食品，具有与根部相似的药用价值。研究表明三七叶富含皂苷、总黄酮、多酚、多糖等活性成分3，具有活血化瘀、止痛消炎、促进消化等多种功能活性4-6。但是目前对于三七叶的开发利用较少，只有三七叶茶、粉等产品，造成严重的资源浪费，因此迫切需要加大对三七叶的开发利用。利用食用真菌或细菌发酵是对植物基食品进行增效加工的有效手段之一，在发酵过程中，微生物发酵可作用于植物中多糖、蛋白质等成分7，促进有效成分的释放，同时将难于吸收的大分子代谢成小分子8，增加植物有效成分的含量9，或者可将低活性有效成分转化为高活性有效成分，具有无污染、酶活性高、转化率高、成本低、周期短、可以实现工业化等优点10。目前已有利用食用微生物进行发酵三七叶的相关研究，如张媛媛等11通过凝结芽孢杆菌发酵三七叶茶，发现发酵可以提高三七叶的总皂苷含量，提高其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基清除能力。陈红惠等12发现经黑曲霉发酵后的三七叶茶具有较好的抗氧化能力。Yang Min等13发现酿酒酵母和枯草芽孢杆菌共发酵三七叶后，其皂苷、酚酸、黄酮类化合物等活性物质含量显著增加，并表现出良好的抗氧化活性。此外，益生菌发酵对三七叶中主要活性成分皂苷具有一定的转化作用，如Li Fei等14利用真菌Cordyceps sinensis和Ascomycota sp.将常见人参皂苷Rb1转化为稀有人参皂苷Rg3和CK。Liu Chunying等15发现黑曲霉能将原人参二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd转化为稀有人参皂苷CK。相对细菌而言，真菌对皂苷的转化时间更短，转化率更高，其产物中功能性较强的人参皂苷Rg3、Rg2和CK含量更高16。但这些研究主要是利用单一菌株或者复合菌株对三七叶进行发酵，有必要针对不同菌株对三七叶的发酵性能进行比较，从而筛选出适合三七叶发酵的优质菌株。200 2023,Vol.44,No.20 食品科学 生物工程米 根 霉（R h i z o p u s o r y z a e）、粗 糙 脉 孢 菌（Neurosporo crassa）、红曲霉（Monascus）和鲁氏毛霉（Mucor rouxianus）是食品领域常用的4 种真菌，其中米根霉具有发达的淀粉和蛋白酶系，是药和酒曲中的优势菌种，在我国传统发酵中十分重要17；粗糙脉孢菌高产纤维素酶、漆酶和多种消化酶，适合于发酵含纤维素较高的木本植物18；红曲霉在我国已有1 000多年的食品发酵历史，其能利用多种糖类和酸类、有机氮等，生成多种蛋白酶、淀粉酶等初级代谢产物和红曲色素、抗菌素等次生代谢产物19；鲁氏毛霉是一种接合菌纲真菌，主要用于食品发酵，其分解纤维素的能力较强20。考虑到三七叶含有丰富的多糖、蛋白、纤维等成分21，本研究选用上述4 种真菌对三七叶进行发酵，研究其化学成分和功能活性的变化，筛选出对三七叶功能活性增效最明显的菌株，并分析其发酵过程中的代谢物变化，以探讨其发酵机制。旨在为三七叶发酵食品的菌株选择提供参考，并为三七叶的开发利用提供理论基础。1 材料与方法1.1 材料与试剂三七叶，2021年11月采收于云南省昆明市寻甸县羊街镇丰乐林下三七种植基地，经西南林业大学植物学教研室戚建华副教授鉴定为三七的叶子，真空冷冻干燥，粉碎并过40目筛，20 保存。叶片椭圆形或倒卵形，长约59 cm，宽约25 cm。粗糙脉孢菌经本实验室从发酵豆腐渣中分离纯化所得；米根霉（CICC 3037）、红曲霉（CDMCC 3.438）、鲁氏毛霉（CICC 40933）购自广东省微生物菌种保藏中心。没食子酸、D()-无水葡萄糖、阿卡波糖、ABTS、对硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-D-glucopyranoside，PNPG）、水溶性VE（Trolox）、三七总皂苷 上海源叶生物科技有限公司；芦丁、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪（2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine，TPTZ）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DPPH 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；-葡萄糖苷酶（700 000 U/mL）北京索莱宝科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸（均为色谱级）美国Millipore公司；氨水（色谱级）德国Merck公司；其余试剂均为国产分析纯。1.2 仪器与设备FD-304箱式真空冷冻干燥机 济南骏德仪器有限公司；XINYI-IID超声波粉碎机、SB-400DTY超声波清洗机 宁波新艺超声设备有限公司；BSA224S电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Infinite F50酶标仪 帝肯贸易有限公司（上海）；Nexera X2 LC-30AD超高效液相色谱系统 日本岛津公司；Q Exactive plus质谱仪 美国赛默飞世尔科技公司；Concentrator plus真空离心浓缩仪 艾本德中国有限公司。1.3 方法1.3.1 菌种活化与培养将米根霉、粗糙脉孢菌、红曲霉和鲁氏毛霉分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基上，25 恒温培养22。待菌种长满平板后，用打孔器打取已活化好的菌种并接种到PDA液体培养基中，得到浓度为1105 个/mL的菌悬液23。1.3.2 样品及发酵液制备取4 g三七叶粉末，加100 mL蒸馏水，121 高压蒸汽灭菌15 min，冷却至室温后，接种4 mL浓度为1105 个/mL的菌悬液，于28、150 r/min摇床中培养10 d，每隔24 h等体积取样一次，取样后置于4 冰箱中停止发酵，并将所有样品保存在20 冰箱备用13。在不含菌种的三七叶溶液中取样，作为空白对照，即为 第0天发酵液。随后，加入无水乙醇使发酵液中乙醇的体积分数为80%，然后置于50 水浴超声（160 W，40 kHz）提取2 h，离心后取上清液置于20 冰箱24。1.3.3 总皂苷含量测定采用香草醛-高氯酸-冰乙酸法25测定。40 L样品溶液，于80 恒温水浴锅中蒸干溶剂后加入20 L 5%香草醛-冰乙酸溶液和80 L高氯酸，60 水浴15 min，冰浴5 min后加入200 L冰乙酸停止反应，在540 nm波长处测定吸光度。在同等条件下测定质量浓度分别为50、100、150、200、250、300 g/mL三七总皂苷溶液的吸光度，绘制标准曲线，得到公式Y=1.776 8X0.058 6（R2=0.995），根据公式计算总皂苷含量。1.3.4 总多糖含量测定采用苯酚-硫酸法26测定总多糖含量。50 L样品溶液，加入50 L 5%苯酚溶液，随后缓慢加入250 L浓硫酸，40 水浴恒温10 min，冷却至室温，于490 nm波长处测定吸光度。在同等条件下测定质量浓度分别为20、40、60、80、100、150、200 g/mL的D()-无水葡萄糖溶液的吸光度，绘制标准曲线，得到公式Y=4.818X0.215 6（R2=0.991 5），根据公式计算总多糖含量。1.3.5 总酚和总黄酮含量测定采用福林-酚法27测定总酚含量。取50 L样品溶液，加入125 L 0.1 mol/L福林-酚溶液，最后加入100 L 75 g/L碳酸钠溶液，避光反应30 min后，于765 nm波长处测定吸光度，以100 L蒸馏水代替碳酸钠溶液作对照组。同等条件下测定没食子酸质量浓度为10、20、40、60、80、100 g/mL时的吸光度，并绘制没食子酸标准曲线，得到公式Y=0.009X0.036 5（R2=0.997 8），根据公式计算总酚含量。生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.20 201采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法28测定总黄酮含量。取40 L样品溶液，加入20 L 50 g/L亚硝酸钠溶液，室温反应6 min，加入20 L 100 g/L硝酸铝溶液，室温反应6 min，加入140 L 40 g/L氢氧化钠溶液，室温反应15 min后，于510 nm波长处测定吸光度。80%乙醇溶液代替相应的试剂为对照组。同等条件下测定芦丁质量浓度为20、40、60、80、100 g/mL时的吸光度，并绘制芦丁标准曲线，得到公式Y=0.001 3X0.010 3（R2=0.992 1），根据公式计算总黄酮含量。1.3.6 体外抗氧化活性测定1.3.6.1 DPPH自由基清除能力参照Xiao Yecheng等29的方法测定不同发酵液的DPPH自由基清除活性，并作适当修改。适宜浓度100 L样品溶液，加入100 L DPPH自由基溶液，混匀，室温避光反应30 min，于517 nm波长处测定吸光度，其中，以80%乙醇溶液代替DPPH自由基溶液作为对照组。VC和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）为阳性对照。以Trolox为标准品，绘制标准曲线，得到公式Y=0.019 7X0.896 8（R2=0.990 6），计算样品的Trolox当量，结果以其与第0天发酵液DPPH自由基清除能力的比值表示（相对能力/%）。1.3.6.2 ABTS阳离子自由基清除能力参照Tao Liang等30的方法，并作适当修改。将7 mmol/L ABTS和140 mmol/L过硫酸钾溶液混合，室温避光反应1216 h，制得ABTS阳离子自由基储备液，后稀释至其吸光度在734 nm波长处为0.70.2，可得ABTS阳离子自由基工作液。取50 L适宜浓度的样品溶液于酶标板中，加入200 L ABTS阳离子自由基工作液，室温避光反应6 min后于734 nm波长处测吸光度。VC和BHT为阳性对照。其中，以80%乙醇溶液代替ABTS阳离子自由基溶液作为对照组。以Trolox为标准品，得到公式 Y=0.008 9X0.740 6（R2=0.993 3），根据公式计算，计算样品的Trolox当量，结果以其与第0天发酵液ABTS阳离子自由基清除能力的比值表示（相对能力/%）。1.3.6.3 铁离子还原能力参照Xu Xiaoyan等31的方法测定样品的铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）。分别配制30 mmol/L pH 3.6的乙酸缓冲溶液、10 mmol/L TPTZ工作液及20 mmol/L的FeCl3溶液，将3 种溶液以体积比10 1 1混匀即得到FRAP工作液。取50 L样品溶液于酶标板中，加入250 L FRAP工作液，37 水浴恒温10 min后在593 nm波长处测定吸光度。其中，80%乙醇溶液代替FRAP工作液作为对照组。同等条件下测定硫酸亚铁的吸光度，绘制标准曲线，得到公式Y=0.005 6X0.020 6（R2=0.992 9），根据公式计算，结果以其与第0天发酵液相应FRAP的比值表示（相对能力/%）。1.3.7-葡萄糖苷酶抑制能力测定参照Amirah等32的方法，略修改。50 L样品溶液中加入25 L 0.2 U/mL-葡萄糖苷酶溶液（磷酸缓冲液配制），37 C水浴恒温10 min，后加入50 L 5 mmol/L PNPG溶液，37 下水浴恒温15 min后，加入100 L 0.2 mol/L碳酸钠溶液终止反应，并在405 nm波长处测定吸光度（A）。其中，以蒸馏水代替-葡萄糖苷酶溶液作为对照组（A0），以80%乙醇溶液代替样品溶液作为空白对照（A1）。以阿卡波糖为阳性对照。按下式计算-葡萄糖苷酶抑制率：?/%?1?A?A0A1?1001.3.8 代谢组学分析米根霉、粗糙脉孢菌、红曲霉和鲁氏毛霉发酵后，综合比较三七叶化学成分和体外抗氧化活性及抑制-葡萄糖苷酶能力的变化情况，并筛选得到对功能活性增效最强的菌株，对该菌株发酵后的代谢物做进一步分析。代谢物提取33：样品置于4 解冻后吸取3 mL液体样品于离心管中，冻干后加入1 mL甲醇-水溶液（4 1，V/V）混匀，冰浴超声30 min，于20 静置2 h，然后于4、16 000g离心20 min，取上清液。将上清液在高速真空浓缩离心机中挥干，加入100 L甲醇-水溶液（1 1，V/V）复溶，4、20 000g离心20 min，取上清液用于质谱分析，同时从每个样品中取等体积样品，混匀制备QC样品，以验证系统的稳定性和可重复性。超高效液相色谱条件34：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm100 mm，1.8 m）；柱温40；流速0.3 mL/min；进样量4 L。整个分析过程样品一直置于4 自动进样器中。梯度洗脱程序如表1所示。表 1 梯度洗脱过程Table 1 Gradient elution procedure时间/minA乙腈/%B 0.1%甲酸溶液/%020100260481005261048100520101210001212.11000010012.1150100质谱条件35：样品采用电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）进行正离子和负离子模式检测。喷雾电压正离子模式为3 800 V，负离子模式为3 200 V；离子传输管温度为320；母离子扫描范围为m/z 71 050。数据处理：原始数据采用MSDIAL软件进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配（质量偏差0.02）和二级谱图匹配（质量偏差0.02 Da）的方式，检索HMDB、MassBank202 2023,Vol.44,No.20 食品科学 生物工程等公共数据库及自建数据库。对提取得到的数据，删除组内缺失值50%的离子峰；对正负离子数据分别进行总峰面积归一化，整合正负离子峰并应用R软件进行模式识别，数据经Unit variance scaling预处理后，进行后续数据分析。1.4 统计分析所有实验3 次重复，使用Origin 2018和SPSS进行数据统计、分析、绘图。P0.05，差异显著。利用OmicStudio云平台（https:/ component analysis，PCA）。2 结果与分析2.1 发酵对总皂苷含量的影响由图1可知，不同菌株对三七叶总皂苷的影响存在显著差异，其中随着发酵时间的延长，米根霉、粗糙脉孢菌和鲁氏毛霉发酵的三七叶皂苷含量均呈现先降低后升高然后又降低的趋势，而红曲霉则是先降低后升高。除米根霉外的3 种真菌发酵后的总皂苷含量均低于未发酵样品，原因可能是由于皂苷发酵过程中转化成了稀有人参皂苷，导致总皂苷含量降低36。陈红惠等12同样发现黑曲霉发酵可使三七叶中皂苷含量先增加后下降，原因是极性较低的稀有皂苷含量有所增加。闫炳雄等37报道了黑曲霉可以高效地转化三七药材中的皂苷类成分，且伴有几种稀有人参皂苷和三七皂苷的生成。而米根霉发酵4 d后，其总皂苷含量从未发酵的170.19 mg/g增加到187.31 mg/g，原因可能是三七叶木质部细胞的细胞壁被米根霉产生的某些纤维素酶水解，提高了皂苷提取率38。0200250A15010050?/?mg/g?/d012345678910cddeabceaabcdedebcdee0200250B15010050?/?mg/g?/d012345678910aabbceddabccdcd0200250C15010050?/?mg/g?/d012345678910aababbcdeefgffgfcd0200250D15010050?/?mg/g?/d012345678910aabccbcbbcccddAD.米根霉、粗糙脉孢菌、红曲霉、鲁氏毛霉发酵，图2、5同。字母不同表示差异显著（P0.05），下同。图 1 真菌发酵对总皂苷含量的影响Fig.1 Effect of fungal fermentation on total saponin content 2.2 发酵对总多糖含量的影响如图2所示，随着发酵时间的延长，4 种真菌发酵后的总多糖含量均明显降低，其原因可能是微生物在生长过程中，需要不断地消耗多糖等营养物质36。进入发酵后期，菌种活力下降，减少了对糖类的利用39。与梅玉立等40研究结果一致。0200A15010050?/?mg/g?/d012345678910abcdcdecdedecdecdeecde0200B15010050?/?mg/g?/d012345678910abcbbccdcddcdcd0200C15010050?/?mg/g?/d012345678910accdcdebccdefedef生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.20 2030200D15010050?/?mg/g?/d012345678910abcdcdcdcdcdcccd图 2 真菌发酵对多糖含量的影响Fig.2 Effect of fungal fermentation on polysaccharide content 2.3 发酵对总酚和总黄酮含量的影响由图3可知，米根霉、粗糙脉孢菌和红曲菌在发酵710 d后使三七叶的总酚含量分别提高40.4%、17.66%、8.1%；而鲁氏毛霉发酵却使三七叶总酚含量显著下降。经研究发现，不同菌种、发酵时间和发酵方式会造成发酵前后总酚含量的不同41-42。张媛媛等11研究发现三七叶茶经凝结芽孢杆菌发酵后，其醇提物的总酚和总黄酮含量显著降低。陈红惠等12研究发现三七叶发酵茶经黑曲霉发酵后，其多酚含量显著降低，黄酮含量在发酵第15天达到最大值。此外，米根霉和鲁氏毛霉在发酵12 d后使三七叶的总黄酮含量分别提高8.66%和17.11%；而粗糙脉孢菌和红曲霉发酵后，三七叶的总黄酮含量显著降低。米根霉和鲁氏毛霉发酵三七叶后其总黄酮的含量显著升高，原因可能是米根霉和鲁氏毛霉在发酵过程中产生的水解酶降低了淀粉、纤维等高分子对活性成分的包裹作用，有利于黄酮类物质的溶出43。粗糙脉孢菌和红曲霉发酵三七叶后其总黄酮的含量显著降低，这与发酵过程中三七叶的某些黄酮类成分转化有关。0108A1642?/?mg/g?/d012345678910cbcccbccbbcbca0108A2642?/?mg/g?/d012345678910bcdbbcababbcdbcdacddcd0108A3642?/?mg/g?/d012345678910ababbcbccccbcbcca0108A4642?/?mg/g?/d012345678910aaabbcdbcbcbcdbccdcd020B115105?/?mg/g?/d012345678910babcecdebcdedeggf020B215105?/?mg/g?/d012345678910aaaabbcbcdbcddcdb020B315105?/?mg/g?/d012345678910aaabababcabccabcbcbcab020B415105?/?mg/g?/d012345678910abcabaabcabcabcccccbc下标14.米根霉、粗糙脉孢菌、红曲霉、鲁氏毛霉发酵，图4同。图 3 真菌发酵对总酚（A）和总黄酮（B）含量的影响Fig.3 Effect of fungal fermentation on the contents of total phenols(A)and total flavonoids(B)204 2023,Vol.44,No.20 食品科学 生物工程2.4 发酵对体外抗氧化活性的影响考虑到抗氧化机制的复杂性，采用DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力以及FRAP综合评价其体外抗氧化活性。如图4所示，米根霉、粗糙脉孢菌、红曲霉发酵后，三七叶的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力以及FRAP呈先降后升的趋势，而鲁氏毛霉发酵后，三七叶的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力以及FRAP呈先降后平缓的趋势。4 种真菌发酵35 d均可显著增强三七叶的抗氧化活性，但不同菌株之间作用不一。对增效作用进行分析比较，发现红曲霉发酵310 d后，三七叶的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力以及FRAP分别提高14.30%、29.46%、18.40%，显著高于其他菌株。其中，三七叶的DPPH自由基清除能力和FRAP在红曲霉发酵3 d后效果显著，ABTS阳离子自由基清除能力在红曲霉发酵3 d后提高5.13%，但显著低于发酵10 d后。真菌发酵可以增强抗氧化活性，与凌阿静等44研究结果相似。50012345610987100150A1aaaaabadcdabc?/%?/d50012345610987100150A2abcdebbcdbbcffefcd?/%?/d50012345610987100150A3abcdefbcdefgeffacdefbcdbcde?/%?/d50012345610987100150A4abcdabcdbcdbcdcddabcabcababc?/%?/d4001234561098712080160B1aecdabcbcdbcdabecddab?/%?/d4001234561098712080160B2acdebcebdeefcdbc?/%?/d4001234561098712080160B3abcdbbccdcdefcdfdde?/%?/d4001234561098712080160B4effcdedebcabbcdeabbcdbcdea?/%?/d4001234561098780120C1dfeccaabdcdebc?/%?/d4001234561098780120C2abdeacabababccbcab?/%?/d生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.20 2054001234561098780120C3bdefdeeffcddefacdbccd?/%?/d4001234561098780120C4decdcdbcabbcaabbcab?/%?/dA.DPPH自由基清除能力；B.ABTS阳离子自由基清除能力；C.FRAP。图 4 真菌发酵对抗氧化活性的影响Fig.4 Effect of fungal fermentation on antioxidant activity of P.notoginseng leaves2.5 发酵对-葡萄糖苷酶抑制活性的影响由图5可知，4 种真菌在发酵前期均降低了三七叶对-葡萄糖苷酶抑制活性，但随着发酵时间的延长，对-葡萄糖苷酶抑制活性有所增强。米根霉、粗糙脉孢菌和鲁氏毛霉发酵后，三七叶对-葡萄糖苷酶抑制活性影响不明显，而红曲霉发酵6 d后，三七叶对-葡萄糖苷酶的抑制活性提高16.03%，明显高于其他菌株。这与王丹等45的研究结果一致，红曲霉发酵可以提高-葡萄糖苷酶抑制活性。因此，红曲霉是增强-葡萄糖苷酶抑制活性较合适的菌株。0120A10080604020?/%?/d012345678910aabbcdabccddabcd abcabcbcd abcd0120B10080604020?/%?/d012345678910aabaababababababbab0120C10080604020?/%?/d012345678910bcddbcdbcdcdbcdabcdbbbc0120D10080604020?/%?/d012345678910abbcdbcddbcdcdabcacdbcdbcd图 5 真菌发酵对抑制-葡萄糖苷酶活性的影响Fig.5 Effect of fungal fermentation on-glucosidase inhibitory activity2.6 代谢组学分析基于前面的实验结果，红曲霉发酵对三七叶的功能活性增效最好，因此采用非靶向代谢组学分析红曲霉发酵3 d后三七叶中代谢物的变化。2.6.1 代谢物分类?6.33%?13.57%?25.79%?3