Carba NP及mCIM试验在检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的临床应用价值.pdf

SYSTEMS MEDICINE 系统医学系统医学 2023 年 7 月第 8 卷第 13 期 论著 Carba NP及mCIM试验在检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的临床应用价值沈旭峰1，施爱军1，张雪松1，王扣群21.如东县中医院检验科，江苏如东 226400；2.如东县中医院内科，江苏如东 226400摘要 目的 探讨 Carba NP 试验与改良碳青霉烯类失活法（modified carbapenem inactivation method,mCIM）试验检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的临床价值。方法 选取 2021年 3月2022年 6月如东县中医院临床分离的 60株碳青霉烯类药物肠杆菌科细菌（carbapenem resistant enterobacteriaceae,CRE），分别对细菌进行 Carba NP试验和mCIM试验检测，以碳青霉烯酶耐药基因聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）检测结果为金标准，计算两项试验的检测效能。结果 基于金标准，Carba NP试验检测肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的灵敏度与特异度分别为90.00%、93.33%，mCIM试验检测肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的灵敏度与特异度分别为93.33%、100.00%，两种检测方法诊断灵敏度与特异度比较，差异无统计学意义（P0.05）。结论 Carba NP 试验与mCIM试验均是检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的有效可行方法。关键词 肠杆菌科细菌；碳青霉烯酶；Carba NP试验；mCIM试验中图分类号 R446 文献标识码 A 文章编号 2096-1782（2023）07(a)-0015-04The Clinical Application Value of Carba NP and mCIM Test in the Detection of Enterobacteriaceae CarbapenemaseSHEN Xufeng1,SHI Aijun1,ZHANG Xuesong1,WANG Kouqun21.Department of Laboratory Medicine,Rudong Hospital of Traditional Chinese Medicine,Rudong,Jiangsu Province,226400 China;2.Department of Internal Medicine,Rudong Hospital of Traditional Chinese Medicine,Rudong,Jiangsu Province,226400 ChinaAbstract Objective To explore the clinical value of Carba NP test and modified carbapenem inactivation method(mCIM)test in the detection of enterobacteriaceae carbapenemase.Methods Sixty strains of carbapenem resistant enterobacteriaceae(CRE)clinically isolated from the Rudong Hospital of Traditional Chinese Medicine from March 2021 to June 2022 were selected,and the bacteria were detected by Carba NP test and mCIM test respectively.The detection results of carbapenemase resistance gene polymerase chain reaction(PCR)were used as the gold standard to calculate the detection efficiency of the two tests.Results Based on the gold standard,the sensitivity and specificity of Carba NP test for detecting carbapenase production by enterobacteriaceae bacteria were 90.00%and 93.33%,respectively,and the sensitivity and specificity of mCIM test for detecting carbapenase production by Enterobacteriaceae bacteria were 93.33%and 100.00%,respectively.There was no significant difference in diagnostic sensitivity and specificity between the two methods(P0.05).Conclusion Both Carba NP test and mCIM test are effective and feasible methods for detecting carbapenemase of enterobacteriaceae bacteria.Key words Enterobacteriaceae;Carbapenemase;Carba NP test;mCIM test近些年，随着广谱抗菌药物的长期大量使用，细菌耐药性增强，耐碳青霉烯类药物肠杆菌科细菌（carbapenem resistant enterobacteriaceae,CRE）检 出率也在不断提高。此类细菌所致感染性疾病具有DOI：10.19368/ki.2096-1782.2023.13.015基金项目 南通市科学技术局（MSZ21097）。作者简介 沈旭峰（1985-），男，本科，主管检验师，研究方向为检验微生物。15系统医学 2023 年 7 月第 8 卷第 13 期 论著 系统医学 SYSTEMS MEDICINE一定复杂性，治疗难度较大，已经成为临床抗感染治疗的棘手问题1。肠杆菌科细菌耐碳青霉烯类药物的机制复杂，其中产碳青霉烯酶是主要机制，该物质能够明显水解碳青霉烯类抗生素的 beta-内酰胺酶，从而使细菌耐药2。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是检测碳青霉烯酶耐药基因的金标准，不过此法技术条件要求严苛，而且操作繁琐，检测成本高、效率低，同时也会受检测基因数量、引物突变、样本污染等原因而出现假阴性或假阳性的情况，限制了基层医院常规实验室开展3。Carba NP 试 验 与 改 良 碳 青 霉 烯 类 失 活 法（modified carbapenem inactivation method,mCIM）试验是近年应用于临床的两种碳青霉烯酶检测方法，本文以 2021 年 3 月2022 年 6 月如东县中医院检验室分离出的 60 株肠杆菌科细菌为例，探究两种方法的检测效能，以期寻找适合基层医院开展的碳青霉烯酶检测方法，现报道如下。1 资料与方法1.1 一般资料选取本院临床分离的 60 株 CRE，标本来源：痰液标准 31 株，尿液标本 12 株，胸腹水标本 9 株，血液标准6株，伤口拭子标本2株。细菌种类：肺炎克雷伯菌 39株，大肠埃希菌 11株，产气肠杆菌 10株。其中30株耐碳青霉烯。1.2 纳入与排除标准纳入标准：本院收治患者住院期间临床分离的肠杆菌科细菌，标本类型与具体菌种不限；耐碳青霉烯肠杆菌科细菌的折点判定参照 CLSI2017 年标准4，即美罗培南和亚胺培南至少一种最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）4 g/mL。排除标准：重复分离的菌株；检测数据资料不全。1.3 方法1.3.1 Carba NP 试验方法 每例菌株准备两个 EP试管，分别标记试验管A及对照管B。在每支EP试管中加入 100 l 的细菌蛋白抽提液，然后用 10 l接种环从血平板上挑取受试菌株（菌株已复苏），分别加入装有提取液的 EP 管中，进行充分振荡混匀后，将 100 l A 液（0.05%酚红与 0.1 mmol/L ZnSO4的混合检测液）、100 l B液（A液中加入6 mg/mL亚胺培南西司他丁钠）分别加入上述 EP 管中，完成后在 37温度条件下进行孵化培育 2 h，期间每隔0.5 h对其颜色变化进行观察记录一次。1.3.2 mCIM试验方法 用10 l接种环从血培养基取 1 满环待测菌株将其置于含有 400 l 蒸馏水的EP 试管中，振荡器混匀后，放入 10 g 美罗培南药敏试纸片 1 张，在 37温度条件下进行培育至少 2 h 后，孵育临近结束时用0.9%氯化钠溶液制备0.5 MCF 的大肠埃希菌（ATCC 25922）菌悬液，均匀涂布于 M-H平板，取出美罗培南药敏试纸片，将其贴在涂布大肠埃希菌质控菌株的 M-H 平板上，继续放置37条件下培养6 h后进行结果观察分析。1.3.3 碳青霉烯酶耐药基因PCR检测方法 严格按照有关试剂盒说明书要求操作，提取细菌 DNA 后，采用 PCR 扩增试验进行碳青霉烯酶常见基因类型检 测，包 括 blaKPC、blaIMP、blaNDM-1、blaVIM。PCR 扩增由本院 PCR 实验室 ABI7500仪器进行，产物测序委托上海生工生物工程公司检测，测序结果提交 BLAST 程序进行比对，确定耐药基因的基因型。1.4 观察指标统计Carba NP试验和mCIM试验对细菌碳青霉烯酶的检出情况。以碳青霉烯酶耐药基因 PCR 检测结果为金标准，计算 Carba NP 试验与 mCIM 试验检测碳青霉烯酶的临床效能（灵敏度、特异度）。实验过程及结果判读严格按照 CLSIM100-525文件推荐方法，实验同时设置阴阳性质控对照和空白对照。Carba NP试验判定标准5：B相对于A颜色由红色变化成橙或黄色后，表示结果为阳性，颜色无变化，为阴性，出现其他颜色为无效。mCIM试验判定标准6：按照实验操作说明，对产碳青霉细菌菌株试验结果显示美罗培南药敏试纸片周围不存在抑制圈，即表示实验结果为阳性，反之则为阴性。mCIM试验/Carba NP试验与金标准诊断均为阳性真阳性，与金标准诊断均为阴性真阴性，试验阳性但金标准阴性假阳性，试验阴性但金标准阳性假阴性7。灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）100%。特异度=真阴性/（真阴性+假阳性）100%。1.5 统计方法采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计数资料用例（n）和率（%）表示，P0.05）。3 讨论编码碳青霉烯酶的基因位于可移动的遗传原件上，可以通过质粒等传递给其他敏感细菌，导致耐药基因传播，造成 CRE 流行甚至爆发。因此，检测肠杆菌科细菌的碳青霉烯酶十分必要，可以为抗感染治疗及减少耐药菌传播提供重要依据。Carba NP试验是由Pa-trice Nordmann领导的团队于 2012 年提出的碳青霉烯酶检测新方法，后于2015年被美国 CLSI抗菌药物敏感性试验标准操作文件（M100-S25）引入，推荐用于感染控制和流行病学研究8。此法采用比色法原理，适用于肠杆菌科、不动菌属和假单胞菌属碳青霉烯酶的表型检测，可以对细菌细胞裂解形成的蛋白抽提液和亚胺培南进行反应，根据碳青霉烯酶对碳青霉烯类药物的水解作用使其开环后产酸，导致pH值降低，促使检验液中的酚红出现变色反应，进而通过观察颜色变化来判断试验菌株是否产碳青霉烯酶9-10。此法不仅可以区分没有碳青霉烯酶活性的碳青霉烯酶易感菌，同时也可以区分产碳青霉烯酶机制与产生超广谱内酰胺酶、头孢菌素酶过表达引起细胞外膜通透性缺陷等机制介导的细菌耐药11。此法操作简单，检测快速，可重复性好，检测费用低，适宜在基层医院的普通实验室开展，而且检测的敏感性与特异性高，可以实现碳青霉烯类抗生素耐药菌株的快速筛查12。本研究中，基于 PCR 检测金标准，Carba NP 试验检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的灵敏度与特异度分别为 90.00%和 93.33%。有研究显示13，Carba NP试验检测的灵敏度与特异度分别为 92.5%和 92.7%，同 PCR 结果一致性良好，与本文报道结论相符。不过，Carba NP 试验结果受黏液性菌株影响，也会出现假阴性，影响检测准确率14。mCIM 试验是在碳青霉烯类失活法（carbapenem inactivation method,CIM）实验基础上改良的碳青霉烯酶检测新方法，于 2017 年被 CLSI 推荐用于肠杆菌科细菌产生碳青霉烯酶的表型确认试验15。此法将传统 CIM 试验中的生理盐水改为缓释剂三乙醇胺缓冲盐水溶液，同时将孵育时间延长至 4 h，更利于细菌生长、酶的产生以及 beta-内酰胺酶水解，同时可以增强金属酶检测敏感性16。有研究指出，mCIM 试验可以在 8 h 内检测革兰阴性杆菌的碳青霉烯酶，对 KPC、NDM、IMP、-内酰胺酶等碳青霉烯酶的检测灵敏度与特异度均很强，与 PCR 检测一致性高17。本研究中，基于金标准，mCIM 试验检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的灵敏度与特异度分别为 93.33%和 100.00%，与文献报 道 mCIM 试 验 检 测 灵 敏 度（95.0%）与 特 异 度（98.0%）相符18，检测效能与 Carba NP 试验基本相当。不仅如此，mCIM 试验结果不会受细菌产生黏液的影响。有研究显示，Carba NP 试验中黏液性菌 株 可 表 现 为 弱 阳 性 的 橙 色，即 假 阴 性，而 经mCIM 试验均呈阴性，说明 mCIM 试验在筛查黏液性肠杆菌科细菌碳青霉烯酶中更具技术优势。此外，mCIM 试验也不受菌龄和药敏纸片的影响，试验使用常规药敏纸片即可，操作简单、成本低廉，而且结果直观明确，适用于基层医院微生物实验室常规开展。不过，铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等其他耐碳青霉烯细菌日益增多，mCIM 试验在这些细菌表型检测中的效能与价值如何，尚需更多的试验验证，有待今后进一步研究。综上所述，Carba NP 试验与 mCIM 试验均是检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶有效可行的方法，值得临床应用推广。表1Carba NP试验与金标准检测结果比较(n)Carba NP试验阳性阴性合计碳青霉烯酶耐药基因PCR检测阳性27330阴性22830合计293160表2mCIM试验与金标准检测结果比较(n)mCIM试验阳性阴性合计碳青霉烯酶耐药基因PCR检测阳性28230阴性03030合计28326017系统医学 2023 年 7 月第 8 卷第 13 期 论著 系统医学 SYSTEMS MEDICINE参考文献1 包海林,花鸿燕,孙恒亮,等.改良 Carba Np 试验和mCIM/eCIM 快速鉴定产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌表型的临床应用J.检验医学,2022,37(10):963-968.2 胡锡池,胡仁静,刘小云.Carba NP 直接纸片法检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的应用评估J.临床与病理杂志,2017,37(10):2043-2049.3 曹蕾,李小月,周万青,等.CIM和Carba NP筛选肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的比较J.临床检验杂志,2016,34(9):646-649.4 Martino Marines,Mariko Koga,Paula Celia,et al.Evaluation of a new rapid test for carbapenemase detection in carbapenem resistant EnterobacteriaceaeJ.Aquatic Mammals,2017,43(3/4):20-21.5 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