Captiva EMR-Lipid技术结合超高效液相色谱-串联质谱测定血清中尼古丁和其代谢产物可替宁.pdf

卫生检验与实验研究JiangsuJPrevMedVol.34,No.5572江苏预防医学2 0 2 3年9 月第34卷第5期CaptivaEMR-Lipid技术结合超高效液相色谱-串联质谱测定血清中尼古丁和其代谢产物可替宁熊文，夏俊鹏，吴飞，徐小培，周乐，徐勤扬州市疾病预防控制中心，江苏扬州2 2 50 0 0摘要：目的建立一种超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS-MS）测定血清中尼古丁和可替宁的方法。方法血清样品加人同位素内标后与乙腈混合均匀，经离心后得样品处理液，注人CaptivaEMR-Lipid小柱，柱下连接0.2 2 m微孔滤膜，加压，净化，得最终样品。采用Poroshell120HILIC-Z色谱柱（2.1mm100mm，2.7 m），流动相为乙腈-10 mmol/L甲酸铵（pH3.0)（V:V为9 0:10)等度洗脱，正离子扫描，内标法定量。结果血清中可替宁和尼古丁在1.0 0 2 0 0 ng/mL范围内线性良好，检出限分别为0.0 1、0.0 6 6 ng/mL，定量限分别为0.0 33、0.2 ng/mL。可替宁的加标回收率为8 7.9%114.2%，相对标准差（RSD）为3.9%4.5%；尼古丁的加标回收率为8 6.4%113.1%,RSD为4.2%8.7%。结论本方法简便、快速、高效，适用于血清中尼古丁和可替宁的测定。关键词：超高效液相色谱-串联质谱；尼古丁；可替宁；CaptivaEMR-Lipid小柱中图分类号：R113文献标识码：B文章编号：10 0 6-9 0 7 0(2 0 2 3)0 5-0 57 2-0 4生物标志物检测法是评价烟草烟雾暴露最好的方法，烟草中的生物碱尼古丁含量最高，占总生物碱的9 8%。尼古丁暴露进人人体后部分在肝脏经细胞色素氧化酶（CYP2A6）代谢转化为可替宁2】，另一部分以尼古丁原型存在，可随血液分布到人体各部位。尼古丁及其代谢物可替宁可作为评价烟草暴露的关键生物标记物，通过尿液、血液、唾液和头发等生物材料的测定，来评估人体烟草暴露的剂量和程度34。目前测定血中尼古丁和可替宁的主要方法有气相色谱质谱法5-6 、液相色谱法7 、液相色谱质谱法18-等。液相色谱质谱法的灵敏度高，更适用于测定人群血清中的尼古丁和可替宁。血清样品前处理主要包括液液萃取法12】、沉淀蛋白法【13，还有文献报道运用固相萃取的方法，但需要通过氮吹操作使样品浓缩，比较繁琐。本研究以CaptivaEMR-Lipid净化技术为净化手段，此方法已运用在牛奶14、猪肉15、沙拉酱【16 、婴儿配方乳粉17 的前处理中，用在血清样品净化中的文献报道较少。由于测定物质的极性较大，色谱条件采用HILIC亲水性色谱柱18 1 1等度洗脱的方法，分析时间较短，流动相配比固定，实际操作简单易行。整套分析方法净化效果好，灵敏度高，且操作方便，无需氮吹操作，直接移液枪吸取小体积的血清样品就能够满足测定需要。1材料与方法1.1仪器与试剂SCIEXAPI4500QTRAP质谱仪，SCIEXExionLCADpump液相色谱仪，高速离心机（H e a l Fo r c e 上海力申科学仪器有限公司），IKA涡旋振荡器，针头式有机系微孔滤膜（0.2 2 m，上海安谱实验科技股份有限公司）；AgilentCaptivaEMR-Lipid固相萃取小柱（1mL40mg）；超纯水；甲醇，乙腈（上海安谱实验科技有限公司）；甲酸铵（上海安谱实验科技有限公司，8 0 52 K036）；甲酸（aladdin，F16 2 7 0 37）；可替宁标准品（1g，多伦多研究化学公司，1-FAX-38-1），可替宁-D，标准品（0.1g，CD N同位素公司，D-3518）；尼古丁标准品（0.2 g/L，中国测试技术研究院，13050072009），尼古丁-D，标准品（10 mg，Be Pu r e，E0025225）；牛血清（上海源叶生物科技有限公司）。1.2标准品溶液的配制可替宁-D3、尼古丁-D，和可替宁标准储备液：分别准确称取10 mg可替宁-D3、尼古丁-D，和可替宁标准品，用甲醇溶解并定容至10mL，配制成质量浓度为1mg/mL的标准储备液，于-20保存。混合内标标准应用液：取可替宁-D，、尼古丁-D，标准储备液用50%乙稀释至50 0 ng/mL，于-20保存。混合标准应用液：取可替宁、尼古丁标准溶液用50%乙腈稀释成1、10、10 0 g/L不同浓度的混合标准应用液，于-2 0 保存。10 mmol/L甲酸铵D01:10.13668/j.issn.1006-9070.2023.05.017作者简介：熊文（19 8 7 一），男，江苏扬州人，主管技师，主要从事环境健康与食品安全监测工作通信作者：徐勤，主任技师，E-mail：148 32 140 0 0 q q.c o mJiangsu J Prev Med,Vol.34,No.5江苏预防医学2 0 2 3年9 月第34卷第5期573（p H 3.0）：称取0.315g甲酸铵，用50 0 mL纯水溶解，甲酸调节pH至3.0 左右。1.3样品的采集收集随机人群全血样品，经处理得血清样品，储存于2 mL离心管中，-8 0 冰箱中保存。1.4样品的处理取取0.50 mL血清样品于2 mL离心管中，加人混合内标标准应用液2 0 L，涡旋混匀，再加入0.50 mL乙睛，先沉淀蛋白，高速离心机10 0 0 0r/min,离心半径7.2 cm，离心5min，得样品处理液。取样品处理液适量，转移至CaptivaEMR-Lipid小柱中，柱下连接0.2 2 m微孔滤膜，加压、净化，得最终样品，供LC-MS/MS测定。1.5色谱和质谱条件1.5.1色谱条件色谱柱:Poroshell 120 HILIC-Z(2.1mm100mm,2.7m）)；柱温：35；进样量：2.0L;流动相：A相为乙腈,B相为10 mmol/L甲酸铵(pH3.0),A:B=90:10(V:V);流速:0.2 mL/min。1.5.2质谱条件电离方式：电喷雾（ESI+）；气帘气：35psi；喷雾电压：550 0 v；辅助加热气温度：500；雾化气：40 psi；辅助加热气：40 psi。2结果2.1色谱条件的选择考察了 ZORBAX SB-C18(2.1mmx50 mm,1.8 m),Poroshell 120 HILIC-Z(4.6 mmx100mm,2.7 m)和 Poroshell 120 HILIC-Z(2.1 mmx100 mm,2.7 m)3根色谱柱,考察了乙腈与甲醇两种有机相,水和10 mmol/L甲酸铵2 种水相。结果表明,在一般 C18色谱柱上可替宁出峰很快，考虑到其有较强的极性，改用亲水性色谱柱(HILIC柱)进行分析。比较2 种不同内径的HILIC色谱柱，内径较大,峰型较宽，且通过将流速调快的方式不能使峰形改善,最终选用Poroshell 120HILIC-Z 色谱柱(2.1 mmx100 mm,2.7 m)。流动相选择方面，单纯用乙和水，尼古丁峰形较差，通过采用梯度洗脱的方式仍然得不到实质性的改善；改成10 mmol/L的甲酸铵，并调节pH为3.0后，峰形改善较大，无论是梯度洗脱或者等度洗脱，尼古丁的峰形都较好。表1为不同洗脱条件汇总，通过不同条件下的2 种目标物的离子流图比较，最终选择乙腈-10 mmol/L甲酸铵（pH3.0）（V：V为9 0：10）等度洗脱。离子流图见图1。表1不同梯度洗脱条件时间A%B%B流动相分类(min)（乙腈）（水或甲酸铵）种类条件16955纯水09010纯水47030条件24.570304.690106901009010纯水46040条件34.560404.6901069010条件46901010 mmol/L甲酸铵(pH3.0)14.61054.41054.21054.01053.81053.61053.41053.21053.01052.8x105(S)2.61052.41052.21052.01051421.8x1051.6x1051.410521.21051.0 x1058.01046.01044.01042.0 x104000.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.5时间(min)注：1.可替宁；2.尼古丁。图1乙-10 mmol/L甲酸铵（pH3.0）（V:V为9 0:10）等度洗脱条件下的2 种目标物的离子流图574Jiangsu JPrevMed,Vol.34.No.5江苏预防医学2 0 2 3年9 月第34卷第5期2.2质谱条件的确定对2 0 0 ng/mL的可替宁和可替宁-D,的标准溶液，以及2 0 0 ng/mL的尼古丁和尼古丁-D,的标准溶液进行一级质谱扫描，在正离子模式下，以流动注射的方式进样，确定母离子；改变碰撞能量，对母离子进行碎片扫描，得到碎片离子信息，选出信号较强的碎片离子，优化后的化合物质谱采集参数见表2。表2可替宁、尼古丁及其对应内标的质谱采集参数母离子子离子碰撞能量去簇电压化合物(m/z)(m/z)(CE)(DP)80.0*28.0070.00可替宁177.098.026.0070.00可替宁-D3180.379.828.0080.00130.0*30.0070.00尼古丁163.0117.035.0070.00尼古丁-D3166.0132.025.0065.00注：*为定量离子。2.3方法学指标2.3.1基质效应、标准曲线及相关系数分别选择50%乙睛为溶剂和空白牛血清为基质，配制2 条质量浓度为1.0 0、5.0 0、10.0、50.0、10 0 2 0 0 ng/mL的溶剂曲线和工作曲线，溶剂标准曲线直接进入LC-MS/MS测定，工作曲线经过全部的前处理过程后进人LC-MS/MS测定。结果，可替宁2 条曲线的斜率相差3%（不超过5%），可认为使用空白牛血清配制曲线对其斜率无影响。尼古丁2 条曲线的斜率相差7.5%（超过5%），存在一些基质增强效应，但差异不明显，综合考虑应使用溶液曲线进行测定。见表3。表3可替宁、尼古丁的回归方程、相关系数及线性范围化合物回归方程线性范围(ng/mL)溶剂y=0.040 34 x+0.002310.998791.00 200可替宁工作y=0.03915x+0.012260.998701.00200溶剂y=0.182 71 x-0.014 690.999691.00 200尼古丁工作y=0.19649x+0.219620.996451.002002.3.2定定量限、检出限选择一段空白基线作为噪音,计算标准曲线最低点质量浓度1ng/mL的S/N值，以3倍的信噪比计算仪器的检出限，以10 倍的信噪比计算方法的定量限，得到可替宁的定量限为0.033ng/mL，检出限为0.0 1ng/mL；尼古丁的定量限为0.2 ng/mL,检出限为0.0 6 6 ng/mL。2.3.3加标回收与重复性试验取空白牛血清6 份，分别加入一定量的混合标准应用液，配制成2 种化合物质量浓度为50 ng/mL的血清标准样品，按1.4样品的处理方法处理后进行检测，算出可替宁相对标准偏差（RSD）为2.5%，尼古丁为3.8%。取空白牛血清2 4份，分成3组，每组8 份，分别加人一定量的混合标准应用液，配制成3种质量浓度为5、50、10 0 n g/m L 的血清标准样品，按1.4样品的处理方法处理后进行检测。结果显示：可替宁的加标回收率为8 7.9%114.2%，RSD为3.9%4.5%；尼古丁的加标回收率为8 6.4%113.1%,RSD为4.2%8.7%。见表4。表4可替宁、尼古丁的加标回收率（n=8）加标5ng/mL加标50 ng/mL加标10 0 ng/mL化合物测得值回收率RSD测得值回收率RSD测得值回收率RSD(ng/mL)(%）(%）(ng/mL)(%）（%）(ng/mL)（%）(%）4.8296.43.953.43106.94.2103.40103.44.54.3987.951.11102.291.4891.54.7094.052.61105.296.2896.34.8997.857.09114.295.0895.1可替宁4.8797.451.53103.199.6199.64.9298.453.96107.9104.80104.84.6392.650.72101.4100.80100.84.9398.555.39110.8101.20101.24.6893.68.749.8099.66.1107.00107.04.24.3286.454.88109.8113.10113.14.3386.648.7497.5111.80111.85.15103.046.5793.1104.80104.8尼古丁5.03100.746.8093.6102.40102.44.3887.650.17100.3108.80108.85.33106.645.5791.1101.00101.04.4088.151.08102.2103.10103.1编辑：周羚上接第56 8 页）编辑：周羚575Jiangsu J Prev MedVol.34,No.5江苏预防医学2 0 2 3年9 月第34卷第5期2.3.4样品测定收集随机人群全血样品12 0 份，按照本方法进行测定。尼古丁检测出2 0 份，检出率为16.70%，检出值范围是0.13 8 8.6 7 ng/mL；可替宁检测出2 8 份，检出率为2 3.3%，检出值范围是0.17 1083.75ng/mL,与文献报道基本一致8-9 。尼古丁和可替宁在血清中可以单独或同时存在，2 种成分同时都检出的有11份，检出值 10 ng/mL的均为男性,这与吸烟者男性居多的现实吻合2 0 。由于收集的血样为随机血样，未收集吸烟相关信息，仅有性别和年龄信息，仅能得到初步结论。3结论本文建立了一种快速、高效测定血清中尼古丁和可替宁的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，前处理采用先沉淀蛋白再直接通过CaptivaEMR-Lipid小柱的方法，脂质等被截留，不需洗脱，加压直接得到目标物质，净化效果良好，方法验证结果证明此方法准确、稳定。参考文献1范茂林，杨旭东，艾雨，等.尿液中尼古丁和可替宁QuEChERS预处理气相色谱测定法建立J.中国公共卫生，2 0 17,33（2）：333-337.2Bramer SL,KallungalBA.Clinical considerations in study designs thatuse cotinine as a biomarker J.Biomarkers,2003,8(3-4):187-203.3李晶，梁梦洁，刘欣，等.超高效液相色谱-串联质谱法快速测定吸烟者尿液中尼古丁和可替宁J.理化检验-化学分册，2 0 19,55(11):1287-1291.4王俊，宋瑞金.人体内可替宁检测技术研究进展J.环境与健康杂志,2 0 0 8,2 5(12)：1111-1114.5丁敏，小林裕太，福岛正充.气相色谱-质谱法测定小鼠血浆的尼古丁和可替宁J.西南大学学报，2 0 0 7,2 9（11）：7 5-7 7.6何怡，徐东群.尿液和头发及唾液中尼古丁及其代谢物可替宁的参考文献1周倩，高玉时，唐梦君，等.食品中硝基呋喃类代谢物检测方法研究进展J.食品安全质量检测学报，2 0 16,7（8）：32 8 5-32 9 0.2黄帆，屈晓铃，周苏，等.高效液相色谱法测定饲料中硝基呋喃类药物J.现代食品，2 0 17（5）：9 1-9 2.3严忠雍，张小军，李佩佩，等.固相萃取-超高效液相色谱法测定水体中4种硝基呋喃类药物J.理化检验（化学分册），2 0 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