疟疾镜检专题知识讲座专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,疟原虫镜检技术,疟疾镜检专题知识讲座,第1页,一、显微镜镜检用于疟疾诊疗,显微镜镜检仍是当前广泛应用疟疾诊疗技术(金标准）,主要优点,-特异高,-能区分虫种,-能分期,-能计数,-1小时内能完成诊疗程序,疟疾镜检专题知识讲座,第2页,1.,所需设备,（1）载玻片,（2）采血针,（3）玻片盒,（4）75乙醇棉球,（5）铅笔,（6）记录表,二、血片制作及染色,疟疾镜检专题知识讲座,第3页,2血片制作,（1）取血部位,采血部位有指尖、耳垂、婴儿可在足跟取血,（,2,）涂制血膜,厚血膜涂制：,用推片左下角刮取血液4-5l（约火柴头大小），将血滴涂于载片中央偏右，由里向外划圈涂成直径为0.8-1厘米厚薄均匀圆形厚血膜。,疟疾镜检专题知识讲座,第4页,用棉球抹净角上血渍，再刮取血液1.5l约1/4火柴头大小)，将推片一端置于血滴之前，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25-35角，从右向左快速向前推成舌状薄血膜，长约2.5CM。,（一）薄血膜涂制：,疟疾镜检专题知识讲座,第5页,（3）厚薄血膜位置：,每张载玻片上分别做1个薄血膜，1个厚血膜。标准血膜位置以下列图所表示。,（4）血膜编号,制成血片后，待薄血膜干后用铅笔将代号或个人编号写于血膜基部，编号要与登记本及结果汇报单上编号相一致，以防差错。,疟疾镜检专题知识讲座,第6页,标准血膜示意图,疟疾镜检专题知识讲座,第7页,（二）血片染色,1薄血膜固定,血片完全干燥后才可染色,固定方法：,将涂片血膜面向上，厚血膜在上端，略倾斜放置，干后用小玻棒蘸甲醇在薄血膜上轻轻抹过以固定薄血膜。,（,注意：厚血膜不能固定,）,疟疾镜检专题知识讲座,第8页,2 染色用水和冲洗用水配制,惯用中性蒸馏水或经煮沸过滤冷开水。用pH7.0pH7.2缓冲液效果最正确。在没有蒸馏水情况下，也可用井水、河水、泉水或雨水。为了使血膜着色很好。,（1）两种贮备液配制：,贮备液I 1/15M磷酸氢二钠（Na,2,HPO,4,）溶液,Na,2,HPO,4,9.5 g,蒸馏水 1000 ml,贮备液 1/15M磷酸二氢钾（KH,2,PO,4,）溶液,KH,2,PO,4,9.07 g,蒸馏水 1000 ml,疟疾镜检专题知识讲座,第9页,（2）缓冲液配制,PH M/15 Na,2,HPO,4,M/15 KH,2,PO,4,DW,(ml)(ml)(ml),6.8 49 51 900,7.0 63 37 900,7.1 68 32 900,7.2 73 27 900,7.4 81 19 900,加缓冲液PH可用试纸或0.02%酚红液测定,。,亦可用PH7.0中性蒸馏水稀释染剂,疟疾镜检专题知识讲座,第10页,（1）配制吉姆萨（Giemsa）染液：,吉姆萨粉 10g,甲醇 500ml,甘油 500ml,将吉姆萨粉置于研钵中，加入少许甘油充分研磨，然后边加边磨，至甘油加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少许甲醇洗涤掉剩下部分并倒入瓶内，重复数次，一并倒入瓶中，至研钵中甘油洗净为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，在室温下放置3-5天，天天摇动，即可使用。放置时间越长染色效果愈佳。,疟疾镜检专题知识讲座,第11页,（2）,染色方法：,A.,常规染色,用PH7.0-7.2缓冲液或蒸馏水将吉氏原液与缓冲液1：20稀释。,分别加数滴经稀释吉氏染液于厚、薄血膜，染色25-30分钟后，用中性蒸馏水轻轻将片上染液冲去，（,冲洗时勿用水直接对准厚血膜，以免血膜脱落,）凉干后镜检。,疟疾镜检专题知识讲座,第12页,B,.,快速吉氏染色,在每毫升缓冲液中加吉氏原液3滴，（10-15%吉氏染液）分别加数滴于厚、薄血膜上，染色5分钟，用流水轻轻冲洗洁净，凉干后镜检。,疟疾镜检专题知识讲座,第13页,瑞氏（Wright）染液:,（1）染液配制：,瑞氏染剂粉 0.10.5g,甘油 3ml,纯甲醇 97 ml,将瑞氏染剂粉置于研钵内，加入甘油充分研磨后，然后加入少许甲醇碾磨后倒入有玻塞瓶中，再分次用甲醇冲洗碾钵中瑞氏染粉甘油液，倒入瓶中，直至洗完。充分摇匀，普通放置一二星期后，再过滤应用（保留时间愈久，染色力愈佳）。,急用时，放置24小时后过滤也可使用。,疟疾镜检专题知识讲座,第14页,（2）染色方法：,先用腊笔在厚薄血膜间画一界限，滴2-3滴蒸馏水于厚血膜上溶血,弃残液。（,小心勿使蒸馏水超出腊笔线而触及薄血膜,）。,在薄血膜上滴瑞氏染液5-8滴，再加与染液等量蒸馏水，与染液混合均匀后用玻棒引至厚血膜上，厚薄血膜同时染色5-8分钟后，用清水轻轻冲洗数秒钟，待干后镜检。,疟疾镜检专题知识讲座,第15页,3.,染色质量,染色很好血片，肉眼看上去呈淡紫红色（不应该出现蓝,绿色或红色）；,镜检红细胞呈淡红色，嗜酸性细胞颗粒呈鲜红色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈蓝色或淡蓝色，白细胞核呈紫蓝色；,疟原虫核呈红色，疟色素清楚可见，在显微镜下仅有小量染液沉淀。,疟疾镜检专题知识讲座,第16页,4.影响血膜染色原因,血膜染色好坏，除与玻片清洁、血膜制作技术等相关外，尚与以下原因相关：,(1)试剂和溶剂质量：,染料、甲醇和甘油如不纯，常使所配染液偏酸或偏碱，从而影响血膜染色。,(2)染液新旧：,新配制染液，因色素还未充分溶解，普通染色力弱，且常带碱性。染液放置较久，染色力逐步增加，尤以吉氏染液为甚。通常在染液配制1-2周后才使用,。,疟疾镜检专题知识讲座,第17页,(3)染液稀释浓度：,染液浓度高，则着色快而深，各种细胞着色粗糙、薛氏点等粗大显著，但颜色偏碱；使用,染液浓度低，染色时间长，则着色慢，颜色偏酸，各种细胞内部结构着色均匀、细致。,(4)染色时间与温度：,染色时间长，化学反应充分完成，染色效果好，反之则染色效果差。,疟疾镜检专题知识讲座,第18页,用水过酸,可致受染RBC上点彩染不出来，,用水过碱，,则使薄血膜上RBC染成灰蓝色，致使R胞浆难以辨论。,所以，当染色结果发生偏蓝（碱）或偏红（酸）时，可用酸碱度与之相反缓冲液冲洗血膜，给予调整。,(5)稀释和冲洗用水：,疟疾镜检专题知识讲座,第19页,疟疾镜检专题知识讲座,第20页,血片染色好坏除了与玻片是否,清洁,，血片制作质量好坏等相关外，还受到以下几个原因影响：,（1）染料溶剂质量,染料、甲醇和甘油假如不纯，常使配制染液偏酸或偏碱而影响染色效果。所以必须用分析纯甲醇和中性甘油，而且在配制时所用器具必须洁净而无水份。,疟疾镜检专题知识讲座,第21页,（2）染液新旧,新配制染液因色素还未充分溶解，染色力较弱且常有沉渣。染液存放时间越久，染色力越强。通常在染液配制12周后才使用，盛装染液瓶子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。,（3）染液稀释后使用时间,染液主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊红碰到美蓝和天青即产生沉淀。所以，必须在稀释染液当初使用，普通在半小时内染色力最强。,疟疾镜检专题知识讲座,第22页,（,4）染液稀释浓度与染色时间,染液浓度高其着色就快而深，染色时间相对缩短，疟原虫寄生红细胞薛氏点粗大显著，但颜色常偏蓝；染液浓度过低则染色时间相对长一些，颜色偏酸红，薛氏点不显著或消失。,（5）稀释和冲洗用水：,为使厚、薄血膜着色很好，应使稀释染液呈中性或稍偏碱性，故应用pH7.0pH7.2水稀释。当染色太蓝，可用pH较低缓冲水冲洗；如染色太红，则用pH较高缓冲液冲洗；如染色太深，可延长冲洗时间，给予校正。,疟疾镜检专题知识讲座,第23页,薄血膜中常见血液成份,中性白细胞,酸性球,血小板,大单核球,淋巴球,红血球,疟疾镜检专题知识讲座,第24页,（三）厚薄血膜优缺点及其适用范围,薄血膜,用血量约为2l，涂制成2cm宽4cm长面积薄血膜。因为在制备过程中，血片通常经甲醇固定，使红细胞及其内疟原虫形态保持完整，便于疟原虫虫种判定。惟因为用血量少，为确保检测敏感性，常,耗时较多,，似不适合用于大规模调查。即使在医院化验室，因为要求在短时间内作出诊疗，因而极,有可能出现漏诊,。,疟疾镜检专题知识讲座,第25页,厚血膜,用血量约为10l20l。涂制成直径1cm厚血膜因为在制备过程中红细胞已溶解，疟原虫在形态上仍可分辨，但胞浆和胞核不可防止地形成一定程度固缩。受影响较大有大滋养体、裂殖体形态。在镜检厚血膜时，普通门诊须检验2001 000个油镜视野（相当于0.52.5l血量），才能确保镜检敏感性和可重复性。通常敏感性可达约1020个原虫/l血。,因为厚血膜与薄血膜相比血量大，须查范围小，节约时间，阳性检出率较高。厚血膜能查出疟原虫数是薄血膜1525倍。所以，我们推荐疟疾诊疗应以,检验厚血膜为主,。在普查时均应,查完整个厚血膜,，未查见疟原虫则判为阴性。,疟疾镜检专题知识讲座,第26页,混合感染判别,1、轻易判别混合感染,1）同一血膜中发觉间日疟各期原虫和恶性疟雌雄配子体。,2）同一血膜中发觉大量纤细恶性疟环状体，并混有少许间日疟原虫。,2、,不易判别混合感染,1）间日疟各期原虫和粗环恶性疟环状体。,2）仅有间日疟和恶性疟环状体。,3 分子生物学方法应用于疟原虫分型,1）提升检出：对镜检漏诊病人,敏感性达5个原虫/100uL血,2）确定四种疟原虫，做复核判定,疟疾镜检专题知识讲座,第27页,三、厚血膜疟原虫计数,依据预先测定白细胞数目计算出每微升血液中疟原虫数目。在制作厚血膜同时，使用Coulter计数器或血球计确定每微升血液中白细胞数。然后镜检厚血膜，计数同一视野中疟原虫数和白细胞数，直到所计数白细胞数到达确定数值为止(假如疟原虫密度较高，计数100200个白细胞即可，但在疟原虫密度很低时，计数白细胞数需达1000个)。,用下式算出疟原虫密度：,疟原虫数/白细胞数白细胞数/l血=疟原虫数/l血。,假如无法进行白细胞计数，则可按常规预计白细胞数。国外最常采取数值是8000白细胞/l血,国内惯用6000白细胞/l血。,疟疾镜检专题知识讲座,第28页,谢谢大家,疟疾镜检专题知识讲座,第29页,