3种高温大曲发酵过程中细菌群落结构演替规律.pdf

食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术生物工程基金项目：贵州省工业和信息化发展专项资金项目（黔财工2021165 号）；贵州省科技计划项目（黔科合成果20202Y042）；遵义市优秀青年科技创新人才培养项目（遵优青20191 号）；贵州省十大千亿级工业（优质烟酒）专项资金项目（黔财工2019226 号）；贵州省纯粮固态酿造技术工程研究中心建设（黔财建2019303 号）作者简介：黄魏（1991），女（汉），硕士，研究方向：酿酒微生物。*通信作者：程平言（1988），女，硕士，研究方向：白酒酿造与白酒风味。DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2023.22.0223 种高温大曲发酵过程中细菌群落结构演替规律黄魏，李浪金，谢丹，吴成，程平言*，张健，尤小龙，胡峰（贵州习酒股份有限公司，贵州 习水 564622）摘要：为揭示 3 种类型的高温大曲（黄曲、白曲、黑曲）在细菌群落、理化指标方面的差异，初步探究不同曲种在发酵过程中功能差异的成因，通过扩增子测序、菌株培养化、物种相关性分析及理化因子与优势物种相关性分析，研究不同类型高温大曲细菌群落差异及内生、外在因素对优势菌群的影响。结果表明，Kroppenstedtia、Saccharopolyspora、Arthrobacter 是黄曲发酵过程中的优势细菌类群，Saccharopolyspora、Thermoactinomyces、norank_Bacteria 为黑曲发酵过程中的主导细菌，而白曲发酵过程中主要以 Bacillus、Thermoactinomyces、Saccharopolyspora、Weissella 为主，冗余分析（redundancy analysis，RDA）分析结果表明，上述微生物中，与黄曲密切相关的优势菌属 Kroppenstedtia 与水分含量呈强负相关；Bacillus 与糖化力呈正相关，这可能是导致白曲糖化力较高的原因；而黑曲发酵后期的优势微生物 Thermoactinomyces 则与酸度呈正相关，与水分含量呈负相关。上述研究结果初步揭示不同高温大曲发酵过程中细菌菌群结构演替的驱动因素，为有效提高酱香大曲的品质提供重要的理论依据。关键词：黄曲；白曲；黑曲；细菌群落结构；相关性Investigation of Bacterial Community Structure Succession during the Fermentation of Three Types ofHigh-Temperature DaquHUANG Wei，LI Langjin，XIE Dan，WU Cheng，CHENG Pingyan*，ZHANG Jian，YOU Xiaolong，HU Feng（Guizhou Xijiu Co.，Ltd.，Xishui 564622，Guizhou，China）Abstract：In order to reveal the differences in bacterial communities and physicochemical indices of three typesof high-temperature Daqu（yellow Daqu，white Daqu，and black Daqu），and initially investigate the causes ofthe functional differences between the different types in the fermentation process，we investigated the differencesin bacterial communities between different types of high-temperature Daqu and the effects of endogenous andexogenous factors on the dominant microorganisms by means of amplicon sequencing，strain culturing，correlation network analysisand redundancy analysis（RDA）.The results showed that Kroppenstedtia，Saccharopolyspora，and Arthrobacter were the dominant bacteria in the fermentation process of yellow Daqu；Saccharopolyspora，Thermoactinomyces，and norank_Bacteria were the dominant bacteria in the fermentation process of blackDaqu；while Bacillus，Thermoactinomyces，Saccharopolyspora，and Weissella were the dominant bacteria in thefermentation process of white Daqu.The RDA results showed that among the above microorganisms，the dominant bacteria genera that is closely related to yellow Daqu was Kroppenstedtia had a strong negative correlationwith moisture content；Bacillus was positively correlated with the amount of saccharification，which might be thereason for the higher saccharification power of white Daqu；and Thermoactinomyces，which was the dominantbacteria in the late stage of black Daqu fermentation，had an positive correlation with acidity and negative correlation with moisture.The above findings preliminarily reveal the driving factors of bacterial structure successionin Daqu，and provided an important theoretical basis for improving the quality of high-temperature Daqu.Key words：yellow Daqu；white Daqu；black Daqu；bacterial community structure；correlation155食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术引文格式：黄魏，李浪金，谢丹，等.3 种高温大曲发酵过程中细菌群落结构演替规律J.食品研究与开发，2023，44（22）：155-162.HUANG Wei，LI Langjin，XIE Dan，et al.Investigation of Bacterial Community Structure Succession During the Fermentation ofThree Types of High-temperature DaquJ.Food Research and Development，2023，44（22）：155-162.高温大曲是酱香白酒的糖化发酵剂，是保证其质量和风格的关键，高温大曲制作过程采用自然固态发酵，发酵仓内不同部位温度、水分等存在差异，导致安曲曲坯在入仓发酵后产生黄曲、白曲、黑曲 3 种形态。入仓堆积于中层，溶氧较好易形成黄曲；入仓堆积于中下层，溶氧少，湿气重，水分大，热曲时间长则易形成黑曲；入仓堆积于上层，水分挥发快，热曲时间短则易形成白曲1，3 种大曲在生产中自然形成的比例约为黄曲 88%，白曲 9%，黑曲 3%2，3 种大曲发酵过程动态变化如图 1 所示。图 1黄曲、白曲、黑曲发酵过程动态变化Fig.1Characteraction during fermentation process of yellow Daqu，white Daqu and black Daqu 5S 5+5S 5S 5+5SS+S近年来，针对 3 种高温大曲的差异研究陆续见报道，班世栋等3研究了不同颜色大曲酶活差异，发现白曲的液化酶、糖化酶、酸性蛋白酶和脂肪酶活力相对较高，黑曲的中性和碱性蛋白酶、纤维素酶和果胶酶活力较高，黄曲酶活力介于两者之间。Deng 等4研究了不同颜色高温大曲的差异：白曲表现出更高的蛋白酶活性和更低的酸度，黄曲糖化率最高，酯化率最低；功能预测表明，白曲和黄曲中编码细菌酶的基因丰度较高，与白曲（59%）和黄曲（87%）中 Kroppenstedtia 丰度较高有关，黑曲 Thermomyces 丰度最高（80%）导致编码真菌酶的基因丰度最高。张巧玲等5基于 18 种游离氨基酸建立拆仓的白曲、黄曲、黑曲判别模型，提供了新的酱香型大曲类型判别方法。陈良强等6研究了出仓白曲（20 个）、出仓黄曲（21 个）、成品曲（113 个），结果表明微生物群落结构信息与 3 种典型曲种具有强关联性并以此为依据建立了高温大曲类别判别模型。柳习月等7利用多组学技术对黄曲、白曲、黑曲进行解析，明确了不同曲种中微生物、代谢物的组成及差异，揭示了微生物以及代谢物之间的关联性。Gan 等8对半成品曲（黄曲、白曲）微生物组成进行研究，填补了成熟大曲微生物群中间阶段的研究空白，同时对比分析了半成品曲和成品曲在微生物组成和功能方面的差异，揭示了茅台大曲微生物群落与功能特性关系。3 种高温大曲具备不同功能，对酱香白酒生产都有重要意义，目前业界对 3 种高温大曲的研究主要集中在其发酵结束阶段，即半成品曲之间的差异，但由于3 种大曲在发酵之初就已形成差异，因此，本研究首次采用可培养结合未培养方法，深入解析黄曲、白曲、黑曲细菌菌群结构演替规律，同时探究物种相关性和理化因子对菌群结构多样性的贡献，从内在和外在初步揭示细菌菌群演替的驱动因素和调控机制，为保障 3种高温大曲产量连续性，提高制曲优质品率提供参考依据。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1样品的采集与保存样品采集自贵州习酒股份有限公司制曲车间，压制生物工程156食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术成型的曲坯作为安曲样品（发酵第 0 天，直接取 500 g作为一个样品），分别于一次翻曲（发酵第 8 天）、二次翻曲（发酵第 14 天）、拆曲（发酵第 39 天）各采集 3 块黄曲，粉碎混匀后取 500 g，白曲、黑曲样品采集方式参照黄曲，同时对样品进行编号：AQ 代表安曲；YF-Y 代表一次翻曲黄曲，EF-Y 代表二次翻曲黄曲，CQ-Y 代表拆曲黄曲；YF-W 代表一次翻曲白曲，EF-W 代表二次翻曲白曲，CQ-W代表拆曲白曲；YF-B代表一次翻曲黑曲，EF-B 代表二次翻曲黑曲，CQ-B 代表拆曲黑曲，以上共计 10个样品，于-80冰箱中密封保存、备用。1.1.2试剂孟加拉红培养基、营养琼脂：北京奥博星生物技术有限责任公司；WL 培养基：上海博微生物科技有限公司；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 试剂盒：美国OMEGA BioTek 公司；Qubit3.0 DNA 检测试剂盒：美国Life Invitrogen 公司；聚合酶链式反应引物：上海翌圣生物科技股份有限公司。1.2仪器与设备无菌操作台（SW-CJ-2F）：苏州净化设备有限公司；自动蒸汽灭菌器（KG-AP32L）：日本 ALP 公司；电泳仪（DYCZ-21）：北京市六一仪器厂；凝胶成像系统（FR-1000）：上海复日科技有限公司；Qubit3.0 荧光定量仪：美国 Life Invitrogen 公司；PCR 仪（ETC811）：北京东胜创新生物科技有限公司。1.3试验方法1.3.1可培养细菌分离筛选、鉴定称取 10 g 样品于 90 mL 无菌水中，150 r/min 振荡30 min 得到 10-1原液，然后吸取 1 mL 加入 9 mL 无菌水中得到 10-2样液，进一步梯度稀释为 10-3、10-4，取10-2、10-3、10-4涂布，每个梯度 3 个平行，37 静置培养2 d，挑取每个培养皿上不同形态的菌落划线分离，得到纯种菌株，每种形态采用甘油管平行保藏 3 株，选取代表菌株送生工生物工程（上海）有限公司进行分子鉴定，测序结果运用美国生物技术信息中心（NationalCenter of Biotechnology Information，NCBI）数据库的碱基局部对准检索工具（Basic Local Alignment SearchTool，BLAST）进行序列比对。1.3.2样品 DNA 提取、测序及生物信息学分析总 DNA 提取及聚合酶链式反应（polymerase chainreaction，PCR）：采用 E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit试剂盒提取样本总 DNA，具体操作流程见试剂盒说明。引物 341F（5-CCTACGGGMSGCAGCAG-3）和805R（5-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3），PCR 扩增条件：95 预变性 3 min；94 变性 20 s；55 退火20 s；72 延伸 30 s；25 次循环；72 终延伸 5 min 降至 4。PCR 反应体系：2HieffRRobust PCR Master Mix15 L，正向及反向引物各 1 L，DNA 模板 2030 ng，使用 ddH2O 补齐体系至 30 L。测序：使用 Illumina MiseqTM测序平台，分别对细菌 16S rRNA 基因 V3V4 区进行高通量测序。物种注释：下机数据经预处理得到有效序列，按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到 OTU 代表序列，采用核糖体数据库（ribosomal database project，RDP）完成比对。多样性分析：用 chao1 算法估计群落中含 OTU 数目的指数；用 Shannon、Simpson 指数估算样品中微生物多样性。用 Coverage 表征各样品文库覆盖率，反映测序结果是否代表样本的真实情况9。1.3.3理化指标检测大曲温度测量方式为取样时将特制温度计插入曲坯中心，待温度稳定后读取、记录数据；还原糖采用斐林法10测定；酸度、水分、糖化力参考 QB/T 42572011 酿酒通用大曲分析方法进行测定11。1.4数据处理1.4.1物种间相关性分析选取所有样品中属水平相对丰度1%的物种，采用 SPSS24.0 软件计算 Spearman 相关性系数，选择显著性 p0.05 的物种，采用 Cytoscape5.0 软件绘制相关性网络图。1.4.2冗余分析（redundancy analysis，RDA）采用理化指标与所有样品中属水平相对丰度排名前 10 的优势物种丰度数据，使用 Canoco5.0 软件进行 RDA 分析。2结果与分析2.13 种高温大曲发酵过程可培养细菌差异性3 个曲种发酵过程共分离筛选到 8 个属的 12 种细菌，共保藏 132 株，其中，发酵初始阶段即安曲样品共分离筛选到 4 种细菌，黄曲发酵过程共分离筛选到7 种细菌，白曲发酵过程共分离筛选到 6 种细菌，黑曲发酵过程共分离筛选到 8 种细菌，见表 1。由表 1 可知，分布频率较高的菌种有 Bacillusamyloliquefaciens、Bacilluslicheniformis、Virgibacillusnecropolis、Kroppenstedtiasp.，尤其是Bacillusamyloliquefaciens，在所有曲种每个发酵阶段均有检出，Bacillus属细菌可以产生淀粉酶、糖化酶以及吡嗪等风味物质12-14。仅在安曲样品筛选到的可培养细菌有 Staphylococcus gallinarum、Weissella confusa，仅在黄曲发酵过程筛选到的菌有 Bacillus subtilis，研究报道黄曲糖化率高4，可能与 Bacillus subtilis 产淀粉酶和糖化酶有关，仅在黑曲发酵过程筛选到的有 Staphylococcus saprophyticus、Mi生物工程157食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术表 1可培养细菌来源及形态Table 1Source and morphology of culture-dependent bacteriacrococcus sp.，Staphylococcus 作为大曲样品中的可培养核心细菌，具有可耐受高酸、高乙醇等特性15，而白曲发酵过程未分离筛选到特有菌种，整体而言，黄曲和黑曲发酵过程的可培养细菌多样性高于白曲。2.23 种高温大曲发酵过程未培养细菌差异性2.2.1 多样性本次测序共检出 307869条有效序列，共检出 15 个门、44 个纲、84 个目、157 个科、276 个属、404 个种的细菌，多样性指数见表 2。样品文库的覆盖率均达到 99.8%以上，表明此次测序结果足以代表样本真实情况。由表 2 可知，白曲Chao1 指数低于黄曲和黑曲，说明白曲物种丰富度低于黄曲和黑曲。黄曲和黑曲 Simpson 指数和 Shannon指数呈现动态变化，说明黄曲和黑曲发酵过程中其微生物多样性发生了较大的演变。白曲 Simpson 指数呈现增加趋势，Shannon 指数呈现减少趋势，说明随着发酵进行白曲细菌多样性不断减少。AQ 样品 Shannon 指数最低，Simpson 指数最高，其微生物多样性最低。2.2.2细菌菌群结构多样性属水平相对丰度见图 2。安曲曲坯微生物主要来源于母曲、原料等16，优势细菌有 Weissella（93.06%）、Kroppenstedtia（2.17%）、Enterobacter（2.00%），其中，Weissella 是绝对优势菌，周天慈等17研究中高温大曲微生物来源时也发现，该曲种在发酵开始阶段 Weissella 是主要细菌，并且初步探明了在该生产工艺下，Weissella 主要来源于室内草席，值得一提的是，Weissella 在黄曲和黑曲后续发酵阶段均未呈现优势，表明 Weissella 菌属可能并非这两种曲形成的关键微生物。黄曲发酵前期的优势菌属主要为 Kroppenstedtia、Arthrobacter、Bacillus、Thermoactinomyces、Saccharopol-yspora 以及 Virgibacillus，发酵中期由 Saccharopolyspo-ra、Bacillus、norank_Bacteria、Pantoea、Kroppenstedtia、Thermoactinomyces 替代，发酵后期的绝对优势菌属为Kroppenstedtia，丰度达到 90%以上，据文献报道，Kroppenstedtia 菌属耐热能力强，在高温大曲中经常被检测编号种名菌株来源菌落形态1StaphylococcusgallinarumAQ2StaphylococcussaprophyticusYF-B3Staphylococcushominis subsp.novobiosepticusEF-B、CQ-W、CQ-B4Pseudomonas versutaYF-Y、YF-W、CQ-Y、CQ-W5Weissella confusaAQ6Bacillusamyloliquefaciens所有样品7CaldibacilluskokeshiiformisYF-Y、YF-B；EF-Y8Bacillus subtilisCQ-Y9Bacillus licheniformisAQ；YF-Y、YF-W、YF-B；EF-Y、EF-W、EF-B10VirgibacillusnecropolisYF-Y、YF-B；EF-Y、EF-B；CQ-Y、CQ-W、CQ-B11Kroppenstedtia sp.YF-Y、YF-B；EF-B；CQ-Y、CQ-W12Micrococcus sp.CQ-B表 2 多样性指数统计表Table 2Statistical table of bacterial Alpha diversity index样品序列数OTUsShannon指数Chao1指数Simpson指数覆盖率AQ18 474360.7041.600.730.999 6YF-Y31 6661693.08169.000.110.999 9EF-Y35 3953384.20339.000.050.999 9CQ-Y58 6441500.99205.250.490.999 1YF-W24 912662.44108.000.110.999 2EF-W26 723572.4078.000.130.999 4CQ-W29 6611072.16150.330.170.998 7YF-B28 9473294.816331.500.020.999 8EF-B34 1831651.43208.380.400.998 6CQ-B19 2641982.26228.570.190.998 0生物工程158食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术图 2属水平相对丰度图Fig.2Plot of relative abundance at genus level到，但针对其发酵特性研究较少，需进一步揭示18，而Saccharopolyspora 在黄酒麦曲中作为优势菌属被报道，麦曲发酵最高温度能达到 50 60，表明该菌属能在极端环境下以芽孢的方式生存19。白曲发酵初期 以 Bacillus、Saccharopolyspora、Lactobacillus、Weissella、Thermoactinomyces、Kroppenstedtia 为主，发酵中期演替为 Bacillus、Saccharopolyspora、Weissella、Lactobacillus、Thermoactinomyces、Pantoea、Kroppenstedtia，而其 发 酵 后 期 则 由 Thermoactinomyces、Bacillus、Psychrobacter、Acinetobacter 主导，Thermoactinomyces 菌属的微生物具有较好的耐高温特性，常在高温大曲中检出，如 Thermoactinomyces daqus 分泌的高温蛋白酶对大曲原料降解及大曲特征风味前体物质的形成具有潜在价值20-21。黑曲发酵过程中，norank_Bacteria、Arthrobacter、Kroppenstedtia、Bacillus 是发酵初期的优势微生物，发酵中期优势菌群为 Saccharopolyspora、Bacillus，而发酵后期 Thermoactinomyces、Arthrobacter、Acinetobacter 成为优势细菌，Li 等22研究茅台大曲中心黑色部分的细菌结构发现，排名前三的种分别是Bacillus sp.（45%）、Thermoactinomyces sp.（24%）以及Saccharopolyspora sp.（21%），在本研究中，这 3 个属的微生物丰度也占了相当大一部分比例，与该研究相似。2.3可培养与未培养方法结果比较未培养测序技术具有快速分析鉴定样本中微生物群落组成的能力，特别是小类菌群的组成，可培养方法能够获得实体菌株，其可作为后续研究的物质基础。本研究通过未培养方法检测到的丰度排名前十的菌属为Kroppenstedtia、Weissella、Saccharopolyspora、Thermoac-tinomyces、Bacillus、Arthrobacter、norank_Bacteria、Lact-obacillus、Psychrobacter、Pantoea，可培养方法分离筛选到的优势菌属有 Kroppenstedtia、Weissella、Bacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Virgibacillus、Caldibacill-us、Micrococcus，两种方法均检测到了 Kroppenstedtia、Weissella、Bacillus，但是可培养方法并未筛选得到未培养检测到的其他优势菌属，是由于可培养方法存在工作量大、筛选不彻底等局限性，但就目前而言，可培养方法依然是获得实体菌株并研究其生长代谢特征不可或缺的手段，两种方法联用能够优势互补，更全面解析菌群结构多样性及其功能。2.4优势物种相关性细菌属水平相关性网络图见图 3。由图 3 可知，24 个菌属间存在 74 个正相关，9 个负相关关系，绝大多数细菌为正相关关系。其中，Weissella、Pediococcus 与其他菌属间只存在负相关关系，尤其是 Weissella，与 Arthrobacter 呈显著的负相关关系，Arthrobacter 在黄曲（23.58%）和黑曲（10.27%）发酵初始阶段均作为优势菌存在，但在白曲发酵初期其丰度接近于零，这可能是 Weissella 生长受到Arthrobacter 的抑制，并未在黄曲和黑曲发酵过程保持其生长优势的原因。Psychrobacter 与 Thermoactinomyces 为正相关关系，两者在白曲发酵过程中，丰度均呈现逐渐增长的趋势，最终形成了以这两种菌属为优势的白曲菌群结构（丰度之和达到65.11%）；黑曲发酵过程中，Arthrobacter与 Thermoactinomyces 间的显著正相关关系，可能驱动黑曲最终形成以 Arthrobacter 与 Thermoactinomyces 为主导（丰度之和达到 73.67%）的菌群结构，而黄曲发酵过程的优势菌属 Kroppenstedtia 与任何一种细菌间无显著相关性，可能是由于黄曲发酵的环境因子更适合该菌属的生长，最终黄曲形成以该菌做为绝对优势菌的菌群结构。2:&:$2:8&8$28:#&#$2#,。ysobacterDysgonomonasDechloromonasnorank_GammaproteobacteriaBacteroidesSphingobacteriumComamonasPaenarthrobacterPediococcusSphingomonasAliihoefleaPseudomonasEnterobacterStaphylococcusVirgibacillusPantoeaAcinetobacterPsychrobacternorank_Bacteria。actobacillusArthrobacterBacillusWeissellaThermoactinomycesSaccharopolysporaKroppenstedtia生物工程159食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术LactobacillusThermoactinomycesPsychrobacterPaenarthrobacter SaccharopolysporaAcinetobacterBacillusPantoeaSphingomonasnorank_Bacterianorank_GammaproteobacteriaVirgibacillusWeissellaAliihoefleaSphingobacteriumBacteroidesPediococcusDechloromonasDysgonomonasStaphylococcusArthrobacterComamonasEnterobacterPseudomonas,B,2.5优势物种与理化指标 RDA 分析理化指标结果见表 3。优势物种与理化因子 RDA分析图见图 4。利用冗余分析（RDA）探究理化因子对优势物种的影响，结果表明，Kroppenstedtia 与水分呈显著负相关，较低的水分含量有利于该菌生长，结合黄曲发酵过程来看，随着发酵进行水分逐渐降低，Kroppenstedtia 丰度逐渐升高，最终成为绝对优势菌；Saccharopolyspora、Bacillus 与温度和糖化力呈正相关，该研究结论与左乾程等23研究机械化制曲过程中细菌菌群结构演替的结论一致，大曲淀粉转化力通常用糖化力和液化力来衡量，Bacillus、Saccharopolyspora 与糖化力的正相关关系暗示了这两种微生物能产生糖化酶，而 Bacillus 在白曲发酵前期、中期作为优势菌存在，这可能是白曲糖化力要高于黄曲和黑曲的主要原因24；Thermoactinomyces 与酸度呈显著正相关，与水分含量呈负相关，结合理化指标来看，黑曲在发酵前期和中期酸度高于其图 3细菌属水平相关性网络图Fig.3Horizontal correlation map of bacteria at genus levelB1B10 表示相对丰度排名前 10 的菌属，分别代表 Kroppenstedtia、Saccharopolyspora、Thermoactinomyces、Weissella、Bacillus、Arthrobacter、Lactobacillus、norank_Bacteria、Psychrobacter、Acinetobacter。箭头间的夹角代表相关性（锐角：正相关；钝角：负相关；直角：无相关性）图 4优势物种与理化因子 RDA 分析图Fig.4RDA analysis diagram of dominant genus andphysicochemical factors表 3理化指标Table 3Physicochemical index样品水分含量/%酸度/（mmol/10 g）还原糖/（g/100 g）糖化力/U温度/AQ37.450.230.590.0410.450.17 69.300.61 25.130.15YF-Y 32.300.703.470.1928.740.25 67.310.27 66.030.15EF-Y 36.730.463.210.1719.830.30 65.621.07 55.030.15CQ-Y7.800.222.380.1619.280.03 57.210.31 27.670.31YF-W 17.500.161.150.1110.490.22 56.980.08 55.230.21EF-W 20.530.550.570.035.090.1262.280.26 49.970.35CQ-W 8.260.271.150.0611.910.12 81.930.63 25.170.21YF-B 33.620.053.680.1720.670.62 60.080.14 72.270.31EF-B 35.700.233.080.1116.190.17 67.580.38 60.270.25CQ-B 16.460.112.140.1715.390.20 65.490.64 32.370.35.)E2F#2!F5-65-15-45-35-105-85-95-75-55-2生物工程160食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术余两种大曲，相对较高的酸度为该菌属提供了适宜的生长环境，这可能是该菌属最终在黑曲发酵结束形成优势的原因。Weissella 与酸度呈显著负相关，表明酸度过大会抑制其生长，这就解释了 Weissella 在安曲阶段是优势菌，但是随着发酵进行，曲坯酸度上升，该菌属相对丰度锐减。3讨论与结论高温大曲生产采用开放式自然发酵，许多不可控的内生环境因子会影响其微生物菌群结构25，而不同的微生物菌群结构代谢特征差异大，因此采用可培养结合未培养方法，具有很好的互补性，两种技术联用解析菌群结构与功能特性更全面26。本研究中，可培养及未培养结果均表明，相对于黄曲和黑曲而言，白曲细菌多样性低，结构稳定性高，这与 Wang 等27研究不同类型成品曲的细菌结构得出的结论一致。值得一提的是，在本研究中，一是无论是可培养还是未培养方法检测到的初始阶段的绝对优势菌Weissella，在后续发酵过程并未一直延续其生长优势，而未培养方法检测到部分初始丰度极低的细菌反而随着发酵进程不断富集，在发酵结束成为了主导微生物，例如黄曲中的 Kroppenstedtia；白曲中的 Thermoactinomyces、Psychrobacter；黑曲中的 Thermoactinomyces、Arthrobacter，上述特征性差异为 3 种高温大曲的最终判别提供了新的借鉴。二是某些细菌在安曲环节并未检出但在后续发酵过程中检出，例如可培养细菌 Bacillus subtilis，Virgibacillus necropolis 等，未培养检测中安曲阶段丰度为零，但在后续发酵过程检出，有的甚至在某一阶段形成绝对优势，例如 Psychrobacter 在白曲拆曲，norank_Bacteria 在黑曲一次翻曲，这部分细菌的来源及其作用，有进一步研究的价值。物种相关性分析结果表明，大部分细菌之间存在正相关关系，少部分细菌之间存在负相关关系，发酵过程中微生物间存在的共生、竞争及拮抗等关系，形成了复杂的相互调控机制控制着微生物间的此消彼长，而冗余分析则进一步揭示了理化因子对不同大曲细菌结构的重要影响：黄曲发酵结束时的绝对优势细菌 Kroppenstedtia 与水分呈强负相关；Bacillus 在白曲前两个发酵阶段都作为优势菌存在，该菌与糖化力呈正相关，这可能是导致白曲糖化力较高的原因；而黑曲发酵后期的优势细菌 Thermoactinomyces 则与酸度呈正相关，与水分呈负相关。最新研究表明，理化性质和代谢图谱可明确区分 3 种不同类型的高温大曲28，在此基础上，以该类研究为参考，结合代谢组学技术明晰发酵过程微生物菌群与发酵环境、代谢产物的关系，进一步明晰 3 种高温大曲形成的驱动因素，保证不同曲种的产量和质量奠定理论基础是今后的主要研究方向。参考文献：1唐佳代,刘力萍,龙亚飞,等.不同感官特性酱香大曲细菌群落结构与理化特性研究J.中国酿造,2022,41(1):138-142.TANG Jiadai,LIU Liping,LONG Yafei,et al.Bacterial communitystructure and physicochemical characteristics of sauce-flavor Daquwith different sensory characteristicsJ.China Brewing,2022,41(1):138-142.2曾凡君,罗胜,杨刚仁,等.高温仿生机制曲在酱香习酒生产中的应用J.酿酒科技,2016(5):80-82,85.ZENG Fanjun,LUO Sheng,YANG Gangren,et al.Application ofbionic mechanical press in the making of high-temperature DaquJ.Liquor-Making Science&Technology,2016(5):80-82,85.3班世栋,王晓丹,胡宝东,等.酱香型大曲中水解酶