3-羟基丁酸对雨生红球藻PSⅡ光化学活性与色素合成的影响.pdf

食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术基金项目：天津市技术创新引导专项（基金）（20YDTPJC01470）；中央引导地方科技发展资金（22ZYCGSN00010）；天津市水产生态及养殖重点实验室开放基金项目（TJAE201805）；自然资源部海洋生态系统动力学重点实验室开放基金项目（MED202013）；天津市农业科技成果转化与推广项目（202001010）；天津市宝坻区农业科技计划-特派员帮扶项目（202012）；天津市科技局生态环境治理重大专项（18ZXSZSF00080）作者简介：黄莹（1999），女（汉），硕士生，研究方向：微藻生理生态学。*通信作者：窦勇（1985），男，讲师，博士，研究方向：微藻生理生态学。DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2023.22.0023-羟基丁酸对雨生红球藻 PS光化学活性与色素合成的影响黄莹1，张娟1，窦勇1*，原雪峰2，翟胜利3，曲木3，周文礼1（1.天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点试验室，天津 300384；2.天津现代天骄农业科技股份有限公司，天津市绿色生态饲料重点实验室，天津 301801；3.天津现代晨辉科技集团，天津 301802）摘要：利用试验生态学方法，研究 3-羟基丁酸对雨生红球藻光系统（photosystem，PS）光化学活性与色素合成的影响。结果发现，3-羟基丁酸对雨生红球藻 PS光反应中心造成胁迫损伤，细胞 PS光化学最大光能转化效率（Fv/Fm）、有效光能转化效率（Yield）和表观电子传递速率（electron transfer rate，ETR）的参数均出现不同程度降低，其中0.02、0.10 g/L 处理组的作用最明显；3-羟基丁酸造成雨生红球藻叶绿素 a 含量波动变化并最终下降至较低水平；3-羟基丁酸能够促进雨生红球藻合成并积累虾青素，其中 0.01g/L 浓度的促进作用最强，虾青素最高产量为 7.57mg/L；3-羟基丁酸影响了雨生红球藻自身资源在光合作用与抗逆合成之间的权衡分配。研究结果为使用 3-羟基丁酸作为外源诱导物促进雨生红球藻生产虾青素提供了依据。关键词：3-羟基丁酸；雨生红球藻；光系统光化学活性；叶绿素 a；虾青素Effects of 3-Hydroxybutyric Acid on PS Photochemical Activity and Pigment Synthesis inHaematococcus pluvialisHUANG Ying1，ZHANG Juan1，DOU Yong1*，YUAN Xuefeng2，ZHAI Shengli3，QU Mu3，ZHOU Wenli1（1.Tianjin Key Laboratory for Aquaculture Ecology and Cultivation，Fisheries College of Tianjin AgricultureUniversity，Tianjin 300384，China；2.Tianjin Modern Tianjiao Agricultural Science and Technology Co.，Ltd.，Tianjin Key Laboratory for Green and Ecological Forage，Tianjin 301801，China；3.Tianjin Chenhui TechnologyGroup，Tianjin 301802，China）Abstract：Using the experimental ecological method，the study investigated the effects of 3-hydroxybutyric acidon photosystem（PS）photochemical activity and pigment synthesis in Haematococcus pluvialis.The resultsrevealed that 3-hydroxybutyric acid caused stress-induced damage to the PS photoreaction centers of theH.pluvialis.PS photochemical parameters，including maximum light energy conversion efficiency（Fv/Fm），effective light energy conversion efficiency（Yield），and apparent electron transfer rate（ETR），were all reduced tovarying degrees，with the most significant effects observed in the groups treated with 3-hydroxybutyric acid at0.02 and 0.10 g/L.Furthermore，3-hydroxybutyric acid led to fluctuating changes in chlorophyll a contentin H.pluvialis and eventually decreased it to a lower level.Additionally，3-hydroxybutyric acid promoted thesynthesis and accumulation of astaxanthin in H.pluvialis，with the most potent effect observed at a concentrationof 0.01g/L，resulting inthe highestastaxanthinyieldof7.57mg/L.Overall，3-hydroxybutyric acidaffectedthe allocationofresourcesinH.pluvialisbetweenphotosynthesisandstressresistancesynthesis.The findingsprovidedabasisfor using 3-hydroxybutyric acid asan exogenousinducer to promote astaxanthin production in H.pluvialis.Key words：3-hydroxybutyric acid；Haematococcus pluvialis；pthotosystem photochemical activity；chlorophyll a；astaxanthin基础研究7食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术引文格式：黄莹，张娟，窦勇，等.3-羟基丁酸对雨生红球藻 PS光化学活性与色素合成的影响J.食品研究与开发，2023，44（22）：7-13.HUANG Ying，ZHANG Juan，DOU Yong，et al.Effects of 3-Hydroxybutyric Acid on PS Photochemical Activity and PigmentSynthesis in Haematococcus pluvialisJ.Food Research and Development，2023，44（22）：7-13.雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一种淡水单细胞藻类，隶属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属，普遍分布于自然界的淡水生境中1。在外界环境条件适宜时，微藻以游动状态存在，此时细胞呈卵圆形或椭圆形，依靠两条顶生、等长的鞭毛运动，这一阶段的细胞大多呈绿色，营养生长旺盛，生物量积累迅速。在受到环境胁迫时，雨生红球藻细胞以红色厚壁孢子形式存在，细胞鞭毛脱落，运动能力丧失，微藻细胞逐渐合成并积累虾青素，此阶段藻细胞内积累大量虾青素，雨生红球藻细胞内的虾青素含量可以占到细胞干重的 1.5%4.0%2-3，而且全部是高生物活性的 3S、3S形态，因此，雨生红球藻被公认为自然界中生产天然虾青素的最佳“生物反应器”。虾青素是一种脂溶性的次级类胡萝卜素，属于菇烯类的不饱和化合物，虾青素是目前为止在自然界有机体中发现的抗氧化能力最强的物质4，其清除自由基和单线态氧淬灭的能力远远高于维生素 E，比玉米黄质、番茄红素及-胡萝卜素等常见抗氧化物质的抗氧化能力也要高10 倍以上。因其具有清除自由基、提高机体免疫力的作用，目前多被用作保健品辅料和食品添加剂5-7。虾青素的功能不仅如此，其还有良好的着色效果，可以进入生物体并贮存在组织中，例如农业农村部 2003 年 318 号公告中指定天然虾青素为水产动物唯一着色剂8-9。雨生红球藻不动孢子内积累大量虾青素，且均为具有高生物活性的 3S、3S异构体，目前被公认为自然界中生产天然虾青素的最佳生物10。然而自然条件下雨生红球藻合成虾青素的效率和对底物、能源的利用率都很低，基本无法支撑虾青素的工业化生产，因此使用外源化学物质进行人工诱导成为提高雨生红球藻生产虾青素能力的常用方法11-17。3-羟基丁酸（3-hydroxybutyric acid，3-HB）通常被认为是生物体内关键的能量代谢中间产物之一18，它是分子量较小的高分子有机化合物，具有光学活性，纯态时可结晶，羟基基团能缔合，易溶于水、乙醇、乙醚、干蒸易分解等特点。目前，已有研究证实 3-羟基丁酸具有一系列重要的生理活性，例如可以促进神经胶质细胞和成骨细胞生长，增强颗粒细胞和半颗粒细胞的体外吞噬作用，提高血细胞内溶菌（lysozyme，LZM）和血清酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）的活性19，除此外在临床医疗领域，3-羟基丁酸及其聚合物已被用来治疗出血性休克等多种疾病20。虽然 3-羟基丁酸具备许多生理功能且具有重要的临床医疗价值，但是在诱导微藻积累次级代谢产物方面尚未得到应用，因此利用 3-羟基丁酸研究雨生红球藻是一个创新性的试验，通过研究它对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响可以更进一步地寻找雨生红球藻更优的培养条件。本研究主要探索 3-羟基丁酸对雨生红球藻光系统（pthotosystem，PS）光化学活性与色素合成的影响，以期为藻源虾青素的生产提供一定依据。1材料与方法1.1材料与试剂雨生红球藻（H.pluvialis）：天津市水产生态及养殖重点试验室；3-羟基丁酸标准品（3CAS 300-85-6，纯度98%）：美国 Sigma-Aldrich 公司；BBM 培养基配方试剂（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。1.2仪器与设备调制脉冲荧光仪（IMAGING-PAM）：德国 WALZ有限公司；紫外-可见分光光度计（TU-1810）：北京普析通用仪器有限责任公司；超声波细胞破碎仪（JY92-）：宁波新芝生物科技股份有限公司。1.3方法1.3.1试验设计以 BBM 培养基对 H.pluvialis 进行培养（配方见表1），设置光照强度为 55 mol/（m2 s），光暗比为 12 h：12 h，培养温度为（221）。每天摇动培养瓶 6 次，防止细胞附壁或下沉。将培养至对数生长期的 H.pluvialis 接种到 250 mL表 1BBM 培养基配方Table 1BBM medium formula试剂浓度/（mg/L）试剂浓度/（mg/L）NaNO3250FeSO4 7H2O4.98K2HPO475H3BO311.42MgSO4 7H2O75ZnSO4 7H2O8.82CaCl2 2H2O25MnCl21.44KH2PO4175MoO30.71NaCl25CuSO4 5H2O1.57EDTA50Co（NO3）2 6H2O0.49KOH31基础研究8食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术三角瓶中，各试验组微藻初始密度均为 5105cells/mL，培养体系体积控制在 150 mL。试验设置的 3-羟基丁酸浓度分别为 0、0.01、0.02、0.05、0.10 g/L，每个试验组均设置 3 次平行。试验周期为 30 d，每 3 d 取样分析 1 次。1.3.2H.pluvialis PS光化学活性测定使用调制脉冲荧光仪测定 PS光化学活性。向比色杯中依次加入 3 mL 双蒸水和 15 L 藻液，混匀，将样品暗适应 15 min，读取最大光能转化效率（Fv/Fm）、有效光能转化效率（Yield）和表观电子传递速率（electron transfer rate，ETR）的数值。1.3.3H.pluvialis 叶绿素 a 含量测定吸取 2mL 藻液置于离心管中，4下以 12000r/min离心 5 min，用移液枪吸去上清液，加入 80%丙酮对藻泥进行再悬浮，然后用锡箔完全包裹离心管，在暗处置于 55 水浴中 30 min，再于 4 下以 12 000 r/min 离心5 min，将上清液转移至 10 mL 离心管中，并用 80%丙酮定容至 5 mL，使用紫外-可见分光光度计测定663 nm 处吸光值（A663），然后根据下列公式计算叶绿素 a 含量（Y，mg/L）21。Y=A663821.3.4H.pluvialis 虾青素含量测定取 5mL 藻液进行离心，去上清液，向沉淀加入 5mL双蒸水，重复此过程 2 次。加入 5%KOH+30%甲醇混合液去除叶绿素。再次离心后加入 5 滴乙酸降低 pH值，收集藻泥后加入 2mL 丙酮，用细胞破碎仪处理 10min，然后用二甲基亚砜抽提至藻团呈白色。用紫外可见分光光度计测定抽提液在 490 nm 下的吸光度 A49022。虾青素含量（X，mg/L）参照如下公式计算。X=4.5A490VAVB式中：VA为二甲基亚砜体积，mL；VB为藻液体积，mL。1.4数据统计与分析各试验组数据均以平均值标准差表示。使用SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析，并且采用 Duncan 方法进行多重比较，显著性水平 P=0.05。2结果与分析2.13-羟基丁酸对 H.pluvialis PS光化学活性的影响2.1.13-羟基丁酸对 H.pluvialis Fv/Fm的影响3-羟基丁酸对 H.pluvialis 最大光能转化效率的影响如图 1 所示。不同字母表示同一时间各处理组间差异显著（P0.05）。图 13-羟基丁酸对 H.pluvialis Fv/Fm的影响Fig.1Effect of 3-hydroxybutyric acid on Fv/Fmin H.pluvialisFv/Fm为最大光能转化效率，反映了植物 PS II 的潜在最大光合能力，环境条件改变时微藻 Fv/Fm会发生显著变化。整体来看，3-羟基丁酸处理组的雨生红球藻 Fv/Fm从试验开始至第 18 天有缓慢下降趋势，此后有一定程度上升，说明雨生红球藻的 PS II 反应中心经过一段时间后对 3-羟基丁酸产生了一定的抗性，然而随着时间的延长藻受到的损害更加严重，从第 21 天开始 Fv/Fm值又呈现逐渐下降趋势。试验期间，浓度分别为 0.01、0.02、0.05、0.10 g/L 的雨生红球藻 Fv/Fm较初始状态分别降低了 9.7%、13.6%、13.6%、25.7%，在大多数时间，3-羟基丁酸处理组的微藻 Fv/Fm均显著低于对照组的微藻 Fv/Fm（P0.05）。结果表明在缺氮条件下 3-羟基丁酸处理组对雨生红球藻加强了胁迫作用，并且在 0.01 g/L 的处理组时 Fv/Fm值下降幅度最大。2.1.23-羟基丁酸对 H.pluvialis 实际光化学量子产量的影响3-羟基丁酸对 H.pluvialis 实际光能转化效率的影响如图 2 所示。BBBBBBBCBBBBCBCBCBDDCBCBCDCBBCBCDDCBCBDBCBBCBBCBCCBCBBCBCBBCBBCBCC6D(AOKE。g/L。.。1 g/L。.。2 g/L。.。5 g/L。.1。g/L基础研究9食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术Yeild 为实际光能转化效率，反映植物 PS II 在部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率。由图 2 可知，3-羟基丁酸处理组的 Yield 参数在 3 d 时，除 0.02 g/L组外，其他各 3-羟基丁酸处理组的 Yield 参数显著低于对照组的参数（P0.05）；在 6、9、21、24 d 时，0.10 g/L 组的 Yield 参数均低于对照组（P0.05）；在 18 d 时，各处理组的 Yield 参数均显著低于对照组（P0.05）。至试验第 27 天时，0.02 g/L 和 0.10 g/L 浓度组的雨生红球藻 Yield 参数下降幅度最明显，相比较初始阶段分别降低了 25%和 16%，而其他浓度组的微藻 Yield 数值下降幅度均未超过 10%。说明 3-羟基丁酸降低了雨生红球藻 PS的实际光合能力。2.1.33-羟基丁酸对 H.pluvialis 光合电子传递速率的影响3-羟基丁酸对 H.pluvialis 表观光合电子传递速率的影响如图 3 所示。不同字母表示同一时间各处理组间差异显著（P0.05）。图 23-羟基丁酸对 H.pluvialis 实际光化学量子产量的影响Fig.2Effect of 3-hydroxybutyric acid on Yield in H.pluvialis图 33-羟基丁酸对 H.pluvialis ETR 的影响Fig.3The effect of 3-hydroxybutyric acid on ETR in H.pluvialis表观光合电子传递速率（electrontransportrate，ETR）是反映植物 PS II 反应中心活性与光合电子传递效率强弱的一个重要指标，其数值影响因素较多，主要与光强、植物吸收入射光和能量分布比例以及光子通量密度有关。由图 3 可知，3-羟基丁酸处理组的雨生红球藻 ETR 参数在第 3 天时，除 0.02 g/L 组外，其余各处理组的雨生红球藻 ETR 均显著低于对照组（P0.05）；在6、9 d 时，0.01g/L 组和 0.10g/L 组雨生红球藻 ETR 低于对照组；在 24、27 d 时，0.1 g/L 组的雨生红球藻 ETR显著低于对照组；在第30天各3-羟基丁酸处理组的雨生红球藻 ETR 显著低于对照组的 ETR 参数值（P*EE(AOKE0 g/L0.01 g/L0.02 g/L0.05 g/L0.10 g/L基础研究10食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术2.23-羟基丁酸对 H.pluvialis 色素合成的影响3-羟基丁酸处理条件下，微藻资源在光合作用与抗逆合成之间权衡分配的情况，通过构建雨生红球藻细胞内虾青素与叶绿素 a 含量比值这一指标来反映，如图 4 所示。试验期间，雨生红球藻的虾青素与叶绿素 a 含量的比值呈现波动变化，其中在第 6、12、27 天出现极大值，在第 9 天和第 21 天出现极小值，从第 27 天后又开始呈逐渐降低的趋势。3-羟基丁酸处理对雨生红球藻虾青素与叶绿素 a 含量比值的影响明显高于对照组的含量比值，其中 6、12、15、18、24、27、30d 时，0.01g/L 组的数值显著高于其他浓度组（P0.05），这与 Ding 等23使用叔丁基羟基茴香醚作为诱导物的结果相类似。试验结果说明 3-羟基丁酸影响了雨生红球藻自身资源在光合作用与抗逆合成之间的权衡分配，而低浓度的影响作用更强。2.2.13-羟基丁酸对 H.pluvialis 叶绿素 a 合成的影响随着试验逐步进行，不同浓度的 3-羟基丁酸对雨生红球藻进行胁迫处理，雨生红球藻细胞内的叶绿素a 含量呈波动变化趋势如图 5 所示。从图 5 中可以看出，随着试验时间的不断延长，雨生红球藻合成叶绿素 a 含量变化呈不规律情况。微藻细胞内的叶绿素 a 含量在试验 3、9、21 d 出现极大值，在 6 d 和 12 d 出现极小值，从 21 d 开始又逐渐降低。试验期间，雨生红球藻中的叶绿素 a 含量最高超过0.6 mg/L（21 d）。2.2.23-羟基丁酸对 H.pluvialis 虾青素合成的影响3-羟基丁酸对 H.pluvialis 虾青素合成的影响如图 6 所示。从图 6 中可以看出随着试验时间的延长，雨生红球累积虾青素含量逐渐缓慢呈现上升趋势，从试验开始至第 24 天各试验组的虾青素水平呈缓慢上升趋势，从第 24 天开始藻细胞虾青素含量积累出现大幅快速增长，且在第 27 天虾青素含量的积累达到了最高峰，此时 0.01g/L 组的虾青素含量最高达到 7.57 mg/L，是对照组的 1.67 倍，由此可知，3-羟基丁酸对微藻的生长虽然没有促进作用。此后各试验组的虾青素水平出现迅速回落。3讨论3.13-羟基丁酸对 H.pluvialis PS光化学活性的影响叶绿素 a 是微藻光合作用时需要的主要色素，是绿色叶片进行光合作用时捕获光能的重要物质，其含量的高低在一定程度上反映了微藻光合能力的强弱24。当微藻受到环境胁迫时，光合作用同时受到抑制，导致光合效率降低，藻细胞吸收的部分光能通过热量和荧光形式散发出来，因此通过测定叶绿素荧光参数可以了解微藻光合机构受胁迫而损伤的程度25。并且有研究证实，环境胁迫会使藻类的 PS反应中心的受损，降低 PS反应中心活性、电子传递效率和光能的转化效率。在本研究中，通过用 3-羟基丁酸处理，结果造成雨生红球藻细胞 PS光化学参数 Fv/Fm、Yield 和 ETR 均出现不同程度降低，说明 3-羟基丁酸是雨生红球藻生长的胁迫因子，而试验中 Yield 和图 53-羟基丁酸对 H.pluvialis 叶绿素 a 合成的影响Fig.5Effect of 3-hydroxybutyric acid on chlorophyll a synthesisin H.pluvialis图 63-羟基丁酸对 H.pluvialis 虾青素合成的影响Fig.6Effect of 3-hydroxybutyric acid on astaxanthin synthesis inH.pluvialis*表示显著低于对照组（P0.05）。图 43-羟基丁酸对 H.pluvialis 虾青素与叶绿素 a 含量比值的影响Fig.4Effect of 3-hydroxybutyric acid on the content ratio ofastaxanthin to chlorophyll a in H.pluvialis;L2FUNH-Us g/Ls.s1 g/Ls.s2 g/Ls.s5 g/Ls.1s g/LAOKE42aFUNH-U0 g/L0.01 g/L0.02 g/L0.05 g/L0.10 g/LAOKE;L2F42aF0 g/L0.01 g/L0.02 g/L0.05 g/L0.10 g/LAOKE基础研究11食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术ETR 之间的变化趋势更为接近，发现它们之间具有较强相关的联系。3.23-羟基丁酸对 H.pluvialis 色素合成的影响本研究主要考察了雨生红球藻细胞内的叶绿素a 和虾青素的含量变化，叶绿素 a 含量反映微藻的光合能力，虾青素含量反映微藻的抗逆水平。在本试验中雨生红球藻细胞内的叶绿素 a 含量随时间延长呈波动变化趋势，而 3-羟基丁酸加剧了这种变化波动，这可能是微藻的光合机构在胁迫抑制和损伤修复共同作用下的结果。在试验后期（2730 d）雨生红球藻的叶绿素 a 含量出现极小值，说明 3-羟基丁酸对微藻的胁迫超出了其修复作用的限度，这也得到了微藻3 种 PS光化学参数均出现不同程度降低现象的同步印证。本研究结果表明，虽然 3-羟基丁酸对雨生红球藻的光合能力造成抑制，却能够提高微藻合成与积累虾青素的能力，这与岳陈陈等26使用褪黑素作为诱导物的研究结果类似。此外，本试验还发现较低浓度（0.01 g/L）的 3-羟基丁酸有利于雨生红球藻合成虾青素，但当浓度较高时虾青素的积累反而受到抑制，此现象说明 0.01 g/L 适合作为 3-羟基丁酸诱导雨生红球藻积累虾青素的使用浓度，而高浓度 3-羟基丁酸对雨生红球藻施加的胁迫可能已经超出了其抗逆能力的限度。3-羟基丁酸对雨生红球藻具有双重作用，不仅具有抑制叶绿素 a 合成的作用，还具有促进虾青素积累的作用。因此，雨生红球藻的生长和虾青素的积累与其所处的环境胁迫有着密切关系，由于雨生红球藻在逆境条件下积累虾青素的自我保护机制，所以适宜胁迫条件下会增加雨生红球藻积累虾青素的含量。4结论3-羟基丁酸对雨生红球藻 PS光反应中心造成了胁迫损伤，在胁迫条件下雨生红球藻的光合结构和功能都受到了一定的伤害。微藻细胞 PS光化学参数Fv/Fm、Yield 和 ETR 均出现不同程度降低，其中 0.02、0.10 g/L 组的作用最明显，降低的数值显著高于其他组，并且通过虾青素与叶绿素比值的分析同样证明0.01 g/L 浓度对雨生红球藻积累虾青素为最好的浓度。3-羟基丁酸造成雨生红球藻叶绿素 a 含量波动变化并最终下降至较低水平；3-羟基丁酸能够促进雨生红球藻合成并积累虾青素，其中 3-羟基丁酸的浓度为0.01 g/L 时，雨生红球藻积累虾青素效果优于其他组，在到达积累峰值时最高积累量为 7.57 mg/L，是对照组的 1.67 倍。3-羟基丁酸会对雨生红球藻的光合作用产生影响，同时会干涉雨生红球藻自身资源在光合作用与抗逆合成之间的权衡分配。参考文献：1张春辉.促进雨生红球藻不动细胞累积虾青素的代谢规律研究D.青岛:中国科学院大学(中国科学院海洋研究所),2019.ZHANG Chunhui.Study on the metabolism regulation of enhancingastaxanthin accumulation in Haematococcus pluvialisD.Qingdao:Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,2019.2FANG N,WANG C K,LIU X F,et al.De novo synthesis of astaxanthin:From organisms to genesJ.Trends in Food Science&Technology,2019,92:162-171.3FANG L,ZHANG J K,FEI Z N,et al.Chlorophyll as key indicatorto evaluate astaxanthin accumulation ability of Haematococcus pluvialisJ.Bioresources and Bioprocessing,2019,6(1):1-7.4WELLS M L,POTIN P,CRAIGIE J S,et al.Algae as nutritional andfunctional food sources:Revisiting our understandingJ.Journal ofApplied Phycology,2017,29(2):949-982.5苏芳.类胡萝卜素在藻虾蟹鱼中的结构分布特征及虾青素异构化研究D.青岛:中国科学院大学(中国科学院海洋研究所),2018.SU Fang.A study on the structure distribution of carotenoids in algae,shrimps,crabs and fishes and the isomerization of astaxanthinD.Qingdao:Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,2018.6SAHA M,GOECKE F,BHADURY P.Minireview:Algal naturalcompounds and extracts as antifoulantsJ.Journal of Applied Phycology,2018,30(3):1859-1874.7章真.雨生红球藻异养细胞光诱导积累虾青素工艺的优化与放大D.上海:华东理工大学,2016.ZHANG Zhen.Optimization and scale up of astaxanthin productionfrom Haematococcus pluvialis with sequential heterotrophy-dilution-photoinduction strategyD.Shanghai:East China University ofScience and Technology,2016.8KHOO K S,LEE S Y,OOI C W,et al.Recent advances in biorefineryof astaxanthin from Haematococcus pluvialisJ.Bioresource Technology,2019,288:121606.9ZHONG Y J,HUANG J C,LIU J,et al.Functional characterizationof various algal carotenoid ketolases reveals that ketolating Zeaxanthin efficiently is essential for high production of astaxanthin intransgenic ArabidopsisJ.Journal of Experimental Botany,2011,62(10):3659-3669.10 SHAH M M R,LIANG Y M,CHENG J J,et al.Astaxanthin-producing green microalga Haematococcus pluvialis:From single cell tohigh value commercial productsJ.Frontiers in Plant Science,2016,7:531.11 尚敏敏,赵永腾,赵鹏,等.黄腐酸对雨生红球藻虾青素的积累和 CHY 基因表达量影响J.水生生物学报,2016,40(3):488-492.SHANG Minmin,ZHAO Yongteng,ZHAO Peng,et al.Effects offulvic acid on astaxanthin accumulation and the expression of chy ofHaematococcus pluvialis lugurevokeJ.Acta Hydrobiologica Sinica,2016,40(3):488-492.12 LIU Y H,ALIMUJIANG A,WANG X,et al.Ethanol induced jasmonate pathway promotes astaxanthin hyperaccumulation in Haematococcus pluvialisJ.Bioresource Technology,2019,289:121720.13 LU Y D,JIANG P,LIU S F,et al.Methyl jasmonate-or gibberellinsA3-induced astaxanthin accumulation is associated with up-regulation of transcription of-carotene ketolase genes(bkts)in microalga Haematococcus pluvialisJ.Bioresource Technology,2010,101(16):6468-6474.14 KOBAYASHI M,KAKIZONO T,NAGAI S.Enhanced carotenoid基础研究12食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术biosynthesis by oxidative stress in acetate-induced cyst cells of agreen unicellular Alga,Haematococcus pluvialisJ.Applied andEnvironmental Microbiology,1993,59(3):867-873.15 于馨恒.化学诱导剂对雨生红球藻合成虾青素的影响及其机理研究D.天津:天津大学,2015.YU Xinheng.Identification and mechanism analysis of chemicalmodulators enhancing astaxanthin accumulation in HaematococcuspluvialisD.Tianjin:Tianjin University,2015.16 LI Y G,CUI D D,ZHUO P L,et al.A new approach to promote astaxanthin accumulation via Na2WO4in Haematococcus pluvialisJ.Journal of Oceanology and Limnology,2019,37(1):176-185.17 窦勇,吴琳,闫永芳,等.雨生红球藻积累虾青素的分子基础与人工诱导调控研究进展J.水产科学,2021,40(5):786-793.DOU Yong,WU Lin,YAN Yongfang,et al.A review:Research advances on molecular basis and artificially induced regulation of astaxanthin accumulation in green Alga Haematococcus pluvialisJ.Fisheries Science,2021,40(5):786-793.18 崔雪萍.PHB 提高螯虾抗副溶血弧菌侵染能力的免疫机理研究D.天津:天津科技大学,2019.CUI Xueping.Immune mechanism of PHB enhancing the resistanceof crayfish to Vibrio parahaemolyticus infectionD.Tianjin:TianjinUniversity of Science&Technology,2019.19 邹冰.3-羟基丁酸对成骨细胞和大鼠骨质疏松影响的研究D.北京:清华大学,2006.ZOU Bing.Effects of 3-hydroxybutyrate on osteoblasts and rat osteoporosis induced by ovariectomyD.Beijing:Tsinghua University,2006.20 苏佳佳,曾杰,邵邻相.3-羟基丁酸对 HeLa 癌细胞生长与凋亡的影响J.浙江师范大学学报(自然科学版),2019,42(2):195-200.SU Jiajia,ZENG Jie,SHAO Linxiang.Effects of 3-hydroxybutyrateon growth and apoptosis of HeLa cellsJ.Journal of Zhejiang Normal University(Natural Sciences