BRE-AS启动子负调控区变异与启动子活性、母猪繁殖力的关系.pdf

南京农业大学学报():/.:./.收稿日期:基金项目:江苏省农业重大新品种创制专项()江苏省种业振兴揭榜挂帅项目()江苏省高校青蓝工程项目()作者简介:王杨硕士研究生通信作者:李齐发教授主要从事动物分子遗传研究:.王杨王苗苗单保森等.启动子负调控区变异与启动子活性、母猪繁殖力的关系.南京农业大学学报():.():.启动子负调控区变异与启动子活性、母猪繁殖力的关系王杨王苗苗单保森吴望军杜星李齐发(南京农业大学动物科技学院江苏 南京)摘要:目目的的 本试验旨在研究 反义()基因启动子负调控区()序列特征以及变异位点多态性与母猪繁殖性状、启动子活性的关系 方方法法 采用 测序法获得大白猪 基因 序列利用池 测序筛选大白猪 基因 上的变异位点 测序法进行基因分型利用 模型进行变异位点多态性、单倍型与母猪繁殖性状的关联分析利用荧光素酶报告系统分析变异对 基因启动子活性的影响 结结果果 大白猪 基因的 位于 长度 在大白猪 基因 的 和 处发现了 个变异位点分别将其命名为.和.在大白猪群体中 基因.位点有 种基因型其中 型为优势基因型(.)为优势等位基因(.)在.位点有 种基因型其中 型为优势基因型(.)为优势等位基因(.)个变异位点形成 种合并基因型其中/型为优势基因型(.)为优势单倍型(.)关联分析发现 个位点及其合并基因型均与母猪总产仔数()、产活仔数()和健仔数()等 个繁殖性状间显著(.)或极显著(.)关联 荧光素酶活性分析发现 单倍型启动子活性极显著高于 单倍型(和.)通过影响启动子活性影响其母猪繁殖力关键词:大白猪多态性繁殖性状负调控区中图分类号:文献标志码:文章编号:()():()().(.)(.).(.)(.)./(.)(.).(.)()()().南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 (.).:长链非编码()作为一类转录本长度超过 个核苷酸()的功能性 分子通常被认为不具备编码蛋白的能力而是以 的形式在转录和转录后水平上调控基因的表达 依据基因组上与邻近蛋白编码基因的位置关系可将 分为同义()、反义()、双向型()、基因间()和内含子()等 随着高通量测序技术的应用哺乳动物中越来越多的 被发现其功能也被注释 在哺乳动物许多生理和病理过程中的重要调控作用也逐渐引起人们的关注 在雌性生殖系统中 在多种相关组织(如下丘脑、垂体、卵巢和子宫等)中分布通过多种机制参与卵泡发育、卵母细胞成熟、排卵、妊娠和胚胎发育等多个生殖过程的调控 例如在人卵巢颗粒细胞()中高表达的 复合群()表达水平与卵泡数有关敲减 可抑制 增殖和细胞周期进程同时影响芳香化酶基因的表达和雌二醇的生成小鼠卵中 类固醇受体 激活剂()能够刺激 的生长增加雌激素和孕激素水平在猪闭锁卵泡中高度表达的 能够通过 簇/轴诱导 凋亡 此外 印记母源表达转录本()被证实是影响胚胎发育的主要调节因子可通过调节 的加工来抑制胎盘发育其失调会引起孕酮生成异常引起胎儿生长以及妊娠中相关疾病的发生 通过将 募集到染色质来激活小鼠胚胎干细胞中同源框()和同源框()的转录对胚胎早期发育至关重要小鼠卵母细胞特异性表达()在卵母细胞胞质分裂和早期胚胎发育的母源 合子转换()中具有重要的调节作用 这些结果均表明 在卵泡发育和雌性生殖中具有重要作用不断改善和提高家畜的生产性能是家畜育种的根本目标而筛选与家畜生产性能有关的重要经济性状的候选基因和遗传标记对于加快实现育种目标具有重要意义 虽然目前鉴定的影响家畜重要经济性状的候选基因基本都是蛋白编码基因但研究证实 在家畜重要经济性状相关的细胞功能中也发挥与蛋白编码基因相似的功能如 肌肉生长促进因子()与猪产肉性状候选基因类肌球蛋白()(前者是后者的靶标)均可诱导肌细胞的肌源性分化与卵泡闭锁相关()和母猪繁殖性状候选基因转化生长因子 受体()(后者是前者的靶标)均可抑制 凋亡因此可以看出 也可以作为家畜重要经济性状的潜在候选基因 等以 为潜在候选基因在美系大白猪 基因中发现 个单核苷酸多态性()这些 均与产肉性状(背膘厚和眼肌面积)显著关联证实 是影响猪产肉性状的关键 基因 等以 为潜在候选基因利用 混池测序法在猪 基因中发现 个变异位点其中启动子 序列拷贝变异表现出品种特异性在高繁殖力猪种(二花脸猪)中为双拷贝在国外引进猪种大白猪和长白猪中为单拷贝认为 是影响高繁殖力性状的候选 基因 但目前发现的影响家畜重要经济性状的候选 基因较少 本课题组前期研究证实 是猪卵泡闭锁和 凋亡的重要调节因子且位于母猪繁殖性状的()内 因此本试验拟以 为潜在候选基因采用 测序法分离其启动子负调控区()序列、筛选 采用一般线性模型()分析 与大白猪繁殖性状之间的关系采用荧光素酶报告系统分析其机制评估 作为母猪繁殖性状候选 基因的可行性以期为母猪繁殖性状的分子育种提供遗传标记 材料与方法.试验样品用于基因组 提取、基因分型及与繁殖性状关联分析的 份大白母猪耳组织样来自常州康乐农牧有限公司种猪场详细记录每头母猪的繁殖性能 基因组 的提取采用常规的酚/氯仿抽提法.引物设计、扩增、测序和生物信息学分析根据本课题组前期分离的猪 基因 调控区序列和鉴定的 利用 .软件设计扩增大白猪 基因 序列的引物 和(表)反应体系和反应程序见文献 第 期王杨等:启动子负调控区变异与启动子活性、母猪繁殖力的关系 产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后委托生工生物工程(上海)公司测序 从 数据库(:/.)获取杜洛克猪基因组中的目标序列 利用 (:/./)预测潜在的转录因子结合位点利用(:/./)预测序列中潜在的 结合位点表 猪 基因启动子扩增的引物序列 编号.引物序列()退火温度/产物长度/用途/扩增克隆 /扩增克隆 .的筛选、分型与关联分析将 头大白猪基因组 等量混匀构建 池 以池 为模板利用表 中的引物进行 扩增 扩增产物经检测合格后委托生工生物工程(上海)公司测序筛选 利用 测序法对每头母猪进行分型 根据文献中的方法计算基因型频率等参数进行哈代温伯格平衡检验和关联分析.载体的构建、细胞培养与转染不同单倍体型 荧光素酶报告载体由南京擎科生物科技有限公司合成 将液氮罐中储存的人 系()取出放入水浴锅中 复苏 再置于 灭菌的离心管中常温下 离心 然后接种于含有 胎牛血清的 培养基(公司)的 瓶内置于 、的细胞培养箱(公司)中培养 待细胞长至铺满瓶壁约 时用胰蛋白酶消化 加入等量 培养基并终止消化转移至 离心管离心后弃上清液再用 培养基重悬均匀接种 孔细胞培养板 待细胞量长满约 时用 试剂(公司)转染报告载体.荧光素酶活性分析细胞转染 后使用 裂解液(公司)裂解细胞 在避光条件下用酶标仪(公司)测量每个样品的萤火虫荧光和海肾荧光并计算两者的比值.数据处理与分析试验数据以平均值标准误()表示 利用 .软件(公司)进行统计分析和绘图 结果与分析.大白猪 基因 扩增与序列分析大白猪 基因 序列长度为 与参考基因组(杜洛克猪)相应序列的一致性为(图、)大白猪 基因 序列由.的碱基、.的碱基、.的碱基 和.的碱基 组成 用 在线网站预测发现猪 基因 含有多个潜在的转录因子(如、和 等)结合元件用 在线工具预测到多个潜在的(如、和 等)结合元件(图).大白猪 基因 上 筛选与多态性分析.筛选 利用 混池()测序法筛选大白猪 基因 上的 结果发现共有 个 分别是位于 处的 单碱基突变和位于 处的 单碱基突变 根据规则将这 个 分别命名为.位点和.位点.位点多态性分析 利用 测序法对大白猪群体().位点进行了基因分型结果发现 种基因型分别为、和 型其中 型为优势基因型基因型频率为.(图、)等位基因频率计算结果显示 为优势等位基因等位基因频率为.(图)卡方检验显示大白猪群体.位点的基因型分布符合哈代温伯格平衡定律(.).位点多态性分析 在大白猪群体()中.位点也存在 种基因型即南 京 农 业 大 学 学 报第 卷、和 型其中 型为优势基因型基因型频率为.(图、)为优势等位基因等位基因频率为.(图)大白猪群体.位点的基因型分布也符合哈代温伯格平衡定律(.)图 猪 基因 序列 .猪 基因 结构示意图 .猪 基因 序列 .加粗碱基为顺式作用元件 .图 大白猪 基因 上 多态性分析 .位点不同基因型峰图()、基因型频率()和等位基因频率()()()().位点不同基因型峰图()、基因型频率()和等位基因频率()()()().大白猪 基因 上 多态性与母猪繁殖性状关联分析.位点多态性与母猪繁殖性状关联分析为了研究 基因.位点变异与母猪繁殖性状的关系利用 模型分别对.位点多态性与大白猪群体 个繁殖性状等进 第 期王杨等:启动子负调控区变异与启动子活性、母猪繁殖力的关系行了关联分析 如图 所示:.位点多态性与大白猪总产仔数()、产活仔数()和健仔数()等性状显著关联(.)其中 型母猪、和 均显著高于 型母猪(.)这些结果说明 是大白猪、和 等繁殖性状的候选基因.位点多态性与母猪繁殖性状关联分析 基因.位点多态性与大白猪群体 个繁殖性状关联分析结果如图 所示 基因.位点多态性与大白猪、和 这 个繁殖性状间极显著关联(.)其中 型母猪的、和 极显著高于 型母猪(.)型母猪的 极显著高于 型母猪(.)和 显著高于 型母猪(.)这些结果进一步说明 是大白猪、和 等繁殖性状的候选基因图 基因 上.突变()和.突变()与大白猪繁殖性状关联分析 .().():总产仔数 :产活仔数 :健仔数 :弱仔数 :死胎数 :出生窝重 .不同大小写字母分别表示差异极显著(.)和差异显著(.)下同 (.)(和.)进行联合分析结果在大白猪群体中发现 种合并基因型(/、/和/型)其中/型为优势合并基因型合并基因型频率为.(图)此外在大白猪群体中共发现 种单倍型 型和 型其中 型是优势单倍型单倍体型频率为.(图).合并基因型与母猪繁殖性状关联分析关联分析结果如图 所示:基因 上 个 合并基因型与大白猪、和 等繁殖性状显著或极显著关联其中/型和/型母猪的 极显著高于/型母猪(.)/型母猪的 极显著高于/型母猪(.)/型母猪的 显著高于/型母猪(.)/型母猪的 显著高于/型母猪(.).上 对 启动子活性的影响为了分析猪 基因 上 是否通过调控启动子活性来影响大白猪繁殖性能本试验构建了 基因(.和.位点)的 种单倍体型 荧光素酶报告载体 和(图)将空载 和、分别与 共转 细胞结果(图)发现 的荧光素酶活性极显著高于(.)说明 基因 上 影响猪 中促凋亡因子 的转录活性南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 大白猪 基因 上 合并基因型与大白猪繁殖性状的关联分析 .合并基因型频率 .单倍型频率 .合并基因型与繁殖性状的关联分析 .图 上 对 启动子活性的影响 .个单倍型 报告载体示意图 .荧光素酶活性 .位点多态性与生长、体型、屠宰和肉质性状显著关联苏淮猪骨形态发生蛋白()基因 上.位点多态性与母猪产仔数性状显著关联扬州鹅泛素羧基末端水解酶()基因启动子.位点多态性与生长性状显著关联 但目前鉴定的与畜禽重要经济性状显著关联的 绝大多数都位于蛋白编码基因上而非编码基因上的极少 本文在本实验室前期证实 为猪卵泡闭锁和 凋亡的重要功能 的基础上在其 上鉴定 个与母猪繁殖性状(包括、和)显著关联的(.和.)进一步证实 是母猪繁殖性状的候选基因 此前鉴定的影响母 第 期王杨等:启动子负调控区变异与启动子活性、母猪繁殖力的关系猪繁殖力的候选 只有 另外在其他畜禽 上还发现了一些与重要经济性状关联的 如 等发现 母系表达基因()基因 个 与猪肉质性状显著关联等发现 祖细胞更新相关非编码()上的 个 突变与奶牛金黄色葡萄球菌乳腺炎抗性性状显著关联 等发现 基因启动子.与鸡的生长性状显著关联 等发现 肝脏甘油三酯合成调节因子()上.与鸡生长和胴体性状显著相关 总之占基因组序列 以上的非编码区正在逐渐成为畜禽重要经济性状遗传标记挖掘的热点目标区域畜禽重要经济性状相关的关键功能基因 调控区上的 往往通过调节基因的转录活性来发挥作用 等发现与鹅生长性状显著关联的.突变增强 基因的启动子活性 骨形态发生蛋白受体()基因第 内含子中与母猪繁殖性状显著关联的 个 组成的单倍型中二花脸猪特异的单倍型调控区活性显著高于杜洛克猪特异的单倍型 调控区 影响基因转录活性一般通过改变转录因子与其结合位点的结合亲和力来实现 等在二花脸猪 启动子中检测到的双拷贝 序列主要通过募集更多转录因子核因子 ()来增强 中 的转录活性 等利用 方法鉴定了奶牛乳脂性状的一个重要的候选基因核糖体蛋白()发现启动子.突变通过影响转录因子 和 启动子上结合位点的互作来改变 基因的转录活性 本研究发现 上.和.变异可引起 中 基因转录活性的改变其中 单倍型启动子活性低于 单倍型这与/基因型母猪繁殖力高于/母猪型母猪以及本实验室前期证实 是母猪繁殖力限制因子等结果是一致的 但本文并未检测到 基因 上 可引起雌性生殖相关的转录因子结合位点的改变因此关于 影响 启动子活性的机制还有待于进一步研究总之本试验获得了大白猪 基因 序列发现了 个与母猪繁殖性状(如、和 等)显著关联的 .和.初步阐明了 个 影响母猪繁殖力的分子机制(增强母猪繁殖力抑制因子 的转录活性)结合前期功能研究结果证实 是第 个被发现的影响母猪繁殖性状的功能 而鉴定出的 个(.和.)均可作为母猪繁殖性状分子育种的潜在遗传标记参考文献:.():.():.:.():.():.:.():.:.():.():.:.:.():./.:.():.南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 .():.:.():.:.()():.王玲芳李尚来李琦琦等.基因.位点突变与大白猪繁殖性能的关系.南京农业大学学报():.:./.():().:.:.:.尹杭杜星潘增祥等.苏淮猪 基因 多态性分析.南京农业大学学报():.:./.():().李清春和军飞陈鑫等.、和 基因多态性与母猪繁殖性能的相关分析.畜牧与兽医():.():().():.():.():.():.().():.():.():.():.:.()():.():.责任编辑:周广礼