自发性先天性白内障大鼠遗传状况分析.pdf

第 40 卷第 4 期2023 年 8 月实验动物科学LABORATORY ANIMAL SCIENCEVol.40No.4August 2023论著收稿日期:2022-02-02基金项目:全军实验动物专项基金(SYDW201710)作者简介:尤金炜(1983),男,硕士,研究方向:医学实验动物研究与实验室管理.E-mail:jsyjw000 通信作者:田小芸(1965),女,副教授,研究方向:医学实验动物繁育与动物实验.E-mail:tianxiaoyun838 自发性先天性白内障大鼠遗传状况分析尤金炜 梁 磊 张旭亮 吴正林 董 敏 田小芸(东部战区总医院医疗保障中心实验动物室,南京210002)摘要:目的了解自发性先天性白内障(TSC)大鼠的遗传状况,评价遗传质量分析方法。方法对 TSC 大鼠、BN大鼠、F344 大鼠下颌骨 11 项变量进行测量,使用 SPSS18.0 统计软件进行数据分析;选取近交系大鼠常用的 6 个微卫星位点,通过 PCR 扩增和琼脂糖电泳鉴定,进行遗传质量检测。结果TSC 大鼠与 BN 大鼠相比较,下颌骨参数有 9 个差异有统计学意义(P0.01);TSC 大鼠与 F344 大鼠相比较,下颌骨参数有 5 个差异有统计学意义(P0.01)。TSC 大鼠不同个体在 6 个微卫星位点上的扩增产物均只出现一个条带,4 个位点可以将 TSC 大鼠与 BN 大鼠区别,4 个位点可以将 TSC 大鼠与 F344 大鼠区别,1 个位点可以将 3 种近交系大鼠区分。结论TSC 大鼠下颌骨变量与 BN 大鼠和 F344 大鼠有明显的差异;TSC 大鼠符合近交系要求,包含 6 个微卫星位点组合,可用于 TSC 大鼠与常用近交系大鼠品系 BN 和 F344 的遗传背景监测。关键词:TSC 大鼠;下颌骨;微卫星;遗传质量中图分类号:Q95-3文献标志码:A文章编号:1006-6179(2023)04-0044-05DOI:10.3969/j.issn.1006-6179.2023.04.009Genetic Analysis of Spontaneous Congenital Cataract RatsYOU Jinwei,LIANG Lei,ZHANG Xuliang,WU Zhenglin,DONG Min,TIAN Xiaoyun(Laboratory Animai Department of Medical Security Center,General Hospital of Eastern Theater Command,Nanjing 210002,China)Abstract:ObjectiveTo investigate the genetic status of spontaneous congenital cataract rats(TSC)and evaluate the genetic quality analysis method.Method 11 variables of mandible of TSC rats,BN rats and F344 rats were measured and analyzed by SPSS18.0;choose 6 microsatellite loci commonly.PCR amplification and agarose electrophoresis were used to detect the gene quality.ResultThere were 9 significant differences in mandibular parameters between TSC rats and BN rats(P0.01),5 significant differences between TSC rats and F344 rats(P 0.01).Only 1 band appeared in the amplification products of TSC rats at 6 microsatellite loci of different individuals.4 loci could distinguish TSC rats from BN rats,4 loci could distinguish TSC rats from F344 rats,and 1 loci could distinguish three inbred rats.ConclusionThe mandibular variables of TSC rats were significantly different from those of BN rats and F344 rats.TSC rats met the requirements of inbreeding lines.The combination of six microsatellite loci can be used to monitor the genetic background of TSC rats and common inbred lines BN and F344.Key words:TSC rats;mandible;microsatellite;genetic quality自发性先天性白内障(TSC)大鼠是东部战区总医院实验动物室 2007 年在 SD 大鼠繁殖生产时发现的 5 只先天性白内障大鼠为基础培育的近交系大鼠,经过 10 多年的连续近交繁殖,现已 39 代,暂定第 4 期尤金炜等:自发性先天性白内障大鼠遗传状况分析 名为 TSC 大鼠,我们已经对 TSC 大鼠的生长繁殖性能、生理生化指标、晶状体病理学等做了详细的分析,且根据国家标准1对其进行了皮肤移植以及生化标记分析遗传质量的研究2,该大鼠符合近交系质量标准规定。下颌骨形态具有高度的遗传稳定性,它们的形态和出现的变异可以作为动物突变或变异的标志,被 广 泛 用 于 实 验 动 物 生 物 学 研 究 及 品 系 间 的鉴定3。微卫星(microsatellite),又被称作短串连重复(short tandem repeats,STRs)或 简 单 重 复 序 列(simple sequence repeats,SSRs),每单元长度在 1 6 bp,是均匀分布于真核生物基因组中的一类分子标记,在不同的近交系动物之间存在核心序列或重复次数变化4,国内外研究均证明微卫星标记应用于实验动物的遗传质量检测,具有可靠性5-7。为了保证此品系大鼠的遗传稳定性和可靠性,本研究同时应用下颌骨形态学分析和微卫星 DNA分析方法对其遗传质量进行进一步分析,并与常用近交系 BN 大鼠和 F344 大鼠进行比较,以积累 TSC大鼠的遗传学数据,为该品系的遗传学标准建立积累数据。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物:TSC 大鼠由本实验室提供,生产许可证号【SCXK(军)2017-0018】;BN 大鼠、F344 大鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,生产许可证号【SCXK(沪)2018-0006】,大鼠各 30 只,均为68 周龄,体质量 170200 g,雌雄各半。所有动物均在 SPF 级设施饲养,使用许可证号【SYXK(军)2017-0037】,并按使用的 3 R 原则给予人道的关怀。1.1.2主要仪器与试剂:电泳仪(天能 EPS-100),凝胶图像处理系统(天能 3500R),基因扩增仪(天隆-DTC)。DNA 分子质量 Marker(索莱宝),琼脂糖(OXOID),Taq 酶(诺唯赞),DNA 提取试剂盒(天根),其他试剂为国产或进口分析纯。1.1.3引物选择:根据文献报道,选择近交系大鼠常 用 的 6 个 微 卫 星 位 点:D3Wox9、APOC3、D11Mgh3、D12Mit2、RATIL6G 和 PA2S。所有引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。1.2方法1.2.1下颌骨形态分析:参照文献8建立的方法,利用 11 个变异函数,1 6 为高度测量点,7 11 为长度 测 量 点,均 为 右 侧 下 颌 骨。拍 照 后 利 用 PhotoshopCS5 分析获得数据。1.2.2微卫星 DNA 检测1.2.2.1鼠尾 DNA 提取:灭菌剪刀 剪取鼠尾约30 mg,剪碎处理为细胞悬液,根据试剂盒步骤提取DNA 备用。1.2.2.2PCR 扩增:反应体系为 25 L,Mix 12.5 L,上游引物和下游引物各 1 L,模板 DNA 1 L,用超纯水补足 25 L。扩增条件:94 预变性 3 min,94 变性 15 s,55 复性 15 s,72 延伸 15 s,共循环 35 次。1.2.2.3扩增产物鉴定:2.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物,30 min。凝胶图像处理系统成像后,根据是否有稳定的条带以及在凝胶上的泳动距离判断结果,如果泳动距离一致,则表现为单态性;若泳动距离有差异,则表现为多态性。2结果2.1下颌骨形态分析经方差分析,TSC 大鼠、BN 大鼠、F344 大鼠 11项下颌骨变量测量结果见表 1,TSC 大鼠与 BN 大鼠相比较,下颌骨参数有 9 个差异有统计学意义(P0.01);TSC 大鼠与 F344 大鼠相比较,下颌骨参数有5 个差异有统计学意义(P0.01)。表 13 种大鼠下颌骨形态参数比较(xs,n=30)Table 1Comparison of morphological parameters ofmandible in 3 kinds of rats(xs,n=30)变量TSCBNF344X11.290.321.660.291.610.16X24.370.284.830.394.300.22X35.560.626.951.125.200.47X49.350.4310.520.719.840.30X510.360.4511.490.6910.740.28X612.050.5013.780.8412.300.33X720.300.7321.001.0820.790.49X822.810.9522.781.1522.420.61X924.100.8624.771.2123.930.52X1026.940.9928.621.5326.790.68X1126.340.8927.841.5126.580.68注:与 TSC 大鼠比较,P0.01Note:Compared with TSC rats,P0.0154 实验动物科学40 卷2.2微卫星位点的引物和泳动距离所选 6 个微卫星位点,在 2.5%琼脂糖凝胶上均有稳定的条带,采用泳动距离为标准进行判读,“a、b、c”表示不同的距离,其中 a 表示距离最长,依次为 a、b、c。详见表 2。表 26 个微卫星引物序列及泳动距离(n=2)Table 2Information about 6 microsatellite primers and associated band-speed(n=2)位点序列(53)泳动距离TSCBNF344PA2SAGTGTTGCCCTCCTATGCATACAGAACATGCTGTTGTCAGGCTCabbRATIL6GACTCTACAAGGACCAGAAAGTGGCATCTTAGCTGGGCTGACCbabD11mgh3GGAGCTGAAATACGAGAGAAATAAGTCCTGCTGGCTGTGCATcbaD12Mit2GTGGCTCTTTTCCTTAGGGATCGGCTTCTGAATGTATTGGbbaAPOC3GATTTGAAGCGATTGTCCATGTCTAGCTGCCCACAGGAGbabD3Wox9TTCAGGTATGATTCGGGAACATTGGCGATATCATTTCACTAACbba注:a、b 和 c 代表不同的泳动距离,其中 a 表示距离最长,其次为 b 和 cNote:a,b and c represent different speed of migration.a for fastest,followed by b and c结果显示,同一品系不同个体之间在同一位点扩增产物的条带完全相同,表现为单态性,泳动距离一致,详见图 1,2;在不同品系之间表现为多态性,详见图 3,4。其中位点 PA2S、RATIL6G、D11Mgh3、APOC3 可以将 TSC 与 BN 大鼠区别;位点 D3Wox9、D12Mit2、PA2S、D11Mgh3 可以将 TSC 与 F344 大鼠区别;D11Mgh3 一个位点就可以将 3 种大鼠完全区别。注:M:DNA marker;18.TSC 大鼠Note:Lane M:DNA marker;Lane18.TSC rats图 1近交系大鼠 TSC 在微卫星位点 D12Mit2 扩增产物电泳结果(n=8)Fig.1The electrophoresis results of amplified products for themicrosatellite loci(D12Mit2)in TSC rats(n=8)注:M:DNA marker;18.TSC 大鼠Note:Lane M:DNA marker;Lane18.TSC rats图 2近交系大鼠 TSC 在微卫星位点 D11Mgh3 扩增产物电泳结果(n=8)Fig.2The electrophoresis results of amplified products for themicrosatellite loci(D11Mgh3)in TSC rats(n=8)64第 4 期尤金炜等:自发性先天性白内障大鼠遗传状况分析 注:M.DNA marker;16.PA2S 位点,712.RATIL6G 位点;1、2、7、8.TSC,3、4、9、10.BN,5、6、11、12.F344Note:Lane M.DNA marker.Lane 12.TSC(PA2S);Lane 34.BN(PA2S);Lane 56.F344(PA2S).Lane 78.TSC(RATIL6G);Lane 910.BN(RATIL6G);Lane 1112.F344(RATIL6G)图 3近交系大鼠 TSC、BN 和 F344 在微卫星位点 PA2S、RATIL6G 扩增产物电泳结果(n=2)Fig.3The electrophoresis results of amplified products for the two microsatellite loci(PA2S,RATIL6G)in TSC,BN and F344 rats(n=2)注:M.DNA marker;16.D12Mit2 位点,712.D3Wox9 位点,1318.APOC3 位点;1、2、7、8、13、14.TSC,3、4、9、10、15、16.BN,5、6、11、12、17、18.F344Note:Lane M.DNA marker.Lane 12.TSC(D12Mit2);Lane 34.BN(D12Mit2);Lane 56.F344(D12Mit2).Lane 78.TSC(D3Wox9);Lane 910.BN(D3Wox9);Lane 1112.F344(D3Wox9);Lane 1314.TSC(APOC3);Lane 1516.BN(APOC3);Lane1718.F344(APOC3)图 4近交系大鼠 TSC、BN 和 F344 在微卫星位点 D12Mit2、D3Wox9、APOC3 扩增产物电泳结果(n=2)Fig.4The electrophoresis results of amplified products for the three microsatellite loci(D12Mit2,D3WoX9,APOC3)in TSC,BN and F344 rats(n=2)3讨论实验动物在生命科学研究中被公认是不可缺少的“活的精密仪器”,而实验动物的遗传状况对动物实验的结果有着非常大的影响。但是实验动物在生产、繁殖、应用过程中,常会造成实验动物遗传物质的改变,进而影响实验数据的准确性。所以实验动物遗传质量监测是实验动物标准化管理一个极其重要的内容,是确保实验动物品系纯度和同一性的重要手段。下颌骨形态是遗传力很高的性状,由某些多态性位点决定,具有品系特征,一般环境因素对下颌骨形态几乎没有影响,是一种很好的定量分析技术,下颌骨分析属于表型检测,也是国标中近交系动物遗传检测方法之一。微卫星 DNA 有着基因位点多、多态性高、扩增片段短的特点,同样在近交系动物中微卫星的长度一般不会变化,可以作为某一品系的恒定参数,不同品系则可能存在差异,因此微卫星 DNA 的检测在实验动物遗传检 测和品系 鉴定中 具 有 非 常 重 要 的价值。近年来,利用微卫星进行遗传检测的报道很多,有研究9分析了国内 6 个品系、8 个近交系大鼠群体;有研究10选取了 87 个微卫星标记,对 6 种近交系大鼠进行遗传检测;还有研究11建立了大鼠 24 个微卫星位点库,优选出 6 个微卫星位点,可用于 3 种常用近交系大鼠的监测;同时也有研究6就实验小鼠、大鼠微卫星 DNA 检测法标准的编制进行了详细的阐述。本研究结合下颌骨测量和微卫星检测,对 TSC大鼠进行遗传分析。结果表明,TSC 大鼠、BN 大鼠、F344 大鼠 11 项下颌骨变量测量结果与 TSC 大鼠和BN 大鼠相比较,X1-X7、X10-X11 差异极显著(P0.01);TSC 大鼠与 F344 大鼠相比较,X1、X3-X5、X7 差异极显著(P0.01)。采用的 6 个微卫星位点,结果显示同一品系不同个体之间在同一位点扩增产物的条带完全相同,表现为单态性,微卫星位点均为纯合,符合近交系动物的遗传质量标准。在不同品系之间表现为多态性,6 个微卫星位点的组合可用于 TSC 大鼠与常用近交系大鼠品系 BN 和F344 的遗传背景监测,4 个位点可以将 TSC 大鼠与BN 大鼠区别,4 个位点可以将 TSC 大鼠与 F344 大鼠区别,组合后均可区分 3 种大鼠,其中 D11mgh374 实验动物科学40 卷一个位点就可以将 3 个品系大鼠完全区别。生物医学的发展离不开实验动物,实验动物发展的基础是遗传质量控制,随着现代生物技术高速发展,检测手段和检测仪器在不断的进步,分子生物学技术被广泛的运用到检测中。微卫星作为第二代遗传检测技术,其优点是操作简便,重复性好,无需安乐死实验动物,只需剪小段尾巴提取 DNA 进行检测,符合动物福利和 3R 原则,主要应用于近交系动物的遗传分析,但尚未形成国家标准,本研究测定的 TSC 大鼠和常用近交系大鼠品系 BN、F344 的 6个微卫星位点,为大鼠遗传监测工作提供了有益的参考,也积累了 TSC 大鼠的遗传学数据和监测方法,为该品系大鼠的深入研究及应用推广建立了较为系统的原始资料。参 考 文 献 1 中华人民共和国国家标准,GB/T 149232010.实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制S.2 尤金炜,董敏,吴正林,等.自发性先天性白内障大鼠皮肤移植及生化 位 点 的 研 究 J.实 验 动 物 科 学,2021,38(1):13-16.3 李厚达.实验动物学M.北京:中国农业出版社,2003.4 覃辉艳,陈华凤,王芳,等.微卫星与生化位点法对 BALA/c小鼠遗传检测比较分析 J.实验动物科学,2019,36(4):14-17.5 ERHART M A,KIM T,CREWS G M,et al.The use of unilateral PCRto identify prominent heteroduplexes formed during PCR of the mouse microsatellite locus D17Mit23 J.Mol Biotechnol,2006,33(1):37-48.6 王洪,魏杰,冯育芳,等.实验小鼠、大鼠微卫星 DNA 检测法标准的编制J.中国比较医学杂志,2019,29(9):97-102.7 刘军须,蔡月花,王瑜,等.近交系 MIJ 和 HFJ 大鼠生化标记基因的测定J.中国实验动物学报,2011,19(5):428-430.8 FESTING M F.Genetic monitoring of laboratory mouse colonies in the medical research council accreditation scheme for the suppliers of laboratory animals J.Lab Animals,1974,8:291-299.9 李瑞生,陈振文,宋德光,等.PCR 扩增近交系大鼠微卫星DNA 多态性的研究J.遗传,2001,23(6):539-543.10ELIZABETH C,LELA K.Multiplex microsatellite marker panels forgenetic monitoring of common rat strainsJ.J Am Assoc Lab Animal Sci,2008,47(3):37-41.11王越甲,杨炜峰,车路平,等.利用优选的微卫星标记建立常用大小鼠品系的遗传监测体系J.实验动物科学,2014,31(3):5-9.84