猪链球菌1_2及2型分离鉴定与耐药分析.pdf

12023.8试验研究0 引言猪链球菌病是链球菌属中猪链球菌（SS）、马链球兽疫亚种及马链球菌马亚种等多种致病性链球菌导致的急性、热性、败血性人畜共患病。其中SS是引起猪链球菌病的主要病原，临床上猪链球菌可引起猪脑膜炎、关节炎或败血症等症状。根据荚膜多糖抗原多样性可将SS收稿日期：2023-05-08基金项目：贵州省科技计划项目（黔科合支撑2023一般076，黔科合支撑2022重点032，黔科合成果2022一般007，黔科合支撑2022一般008，贵州省生猪产业技术体系）作者简介：齐婧（1995-），女，硕士，研究实习员，从事畜牧兽医相关研究工作。*通信作者简介：史开志（1981-），男，博士，研究员，从事地方猪疫病防控工作。齐婧，周思旋，张静，等猪链球菌1/2及2型分离鉴定与耐药分析J现代畜牧科技，2023，99（8）：1-6doi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.001QI Jing，ZHOU Sixuan，ZHANG Jing，et alIsolation，Identification and Drug Sensitivity Test of Streptococcus Suis Type 1/2 and Type 2JModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，99（8）：1-6猪链球菌1/2及2型分离鉴定与耐药分析齐婧1，周思旋1，张静1，黎芷欣2，谭娅1，张雄1，赵春萍1，王婧1，史开志1*（1.贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005；2.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）摘要：为确诊贵州省某猪场猪的死亡原因，分析病原特征并提供用药指导。根据临床症状，采用相关病原特异性引物进行PCR扩增检测病死猪肺组织中的病原，针对阳性病原进行分离纯化、形态学、生化试验、16S rRNA序列分析、血清型和PCR-RFLP鉴定，通过药敏试验检测病原耐药性。在肺组织中均扩增出链球菌的特异性片段，形态学特性、生化特征、16S rRNA序列分析结果表明分离菌株均为猪链球菌，将其分别命名为GYSS73和GYSS74；通过分子血清定型和PCR-RFLP鉴定确定GYSS73为猪链球菌1/2型、GYSS74为猪链球菌2型。药敏试验结果为GYSS73的高敏药物是阿莫西林和头孢拉定；GYSS74的高敏药物是阿莫西林及青霉素。研究表明，猪发病死亡的原因是分别感染了猪链球菌1/2型和2型，可用高敏药物阿莫西林进行治疗。关键词：猪链球菌1/2型；猪链球菌2型；分离鉴定；耐药性分析；诊疗中图分类号：S852.61文献标识码：Adoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.001Isolation，Identification and Drug Sensitivity Test of Streptococcus Suis Type 1/2 and Type 2QI Jing1，ZHOU Sixuan1，ZHANG Jing1，LI Zhixin2，TAN Ya1，ZHANG Xiong1，ZHAO Chunping1，WANG Jing1，SHI Kaizhi1*（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Guizhou Academy of Agricultural Science，Guiyang Guizhou 550005，China；2.College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang Guizhou 550025，China）Abstract：To confirm the diagnosis of the cause of pig death in a pig farm in Guizhou Province and to provide guidance on the use of drugsThe pathogen was detected by PCR amplification in the lung tissues of dead pigs，followed by isolation and purification of the bacteria for morphological identification，biochemical tests，16S rRNA sequence analysis，serotype and PCR-RFLP identification，and drug resistance analysisStreptococcus specific fragments were amplified in lung tissues，and two suspected strains were isolated and purified，whose culture characteristics，morphological characteristics and biochemical characteristics were similar to those of StreptococcusGYSS73 was identified as Streptococcus suis type 1/2 and GYSS74 was Streptococcus suis type 2The highly sensitive drugs for GYSS73 were amoxicillin and cefradin;the highly sensitive drugs for GYSS74 were amoxicillin and penicillinThe cause of acute death of the two pigs was infection with Streptococcus suis type 1/2 and type 2 respectively，which could be treated with the highly sensitive drug amoxicillinKeywords：Streptococcus suis type 1/2，Streptococcus suis type 2，isolation and identification，drug resistance analysis，diagnosis and treatment2 2023.8试验研究分为35种血清型（134型和1/2型）1。尽管不同血清型的分布因菌株的地理来源而不同，但血清2型在猪中致病性最强且分布广，而且全球范围内人感染猪链球菌2型的检出率最高2；在北美洲和加拿大血清3型和1/2型也是猪链球菌主要流行血清型3-4，但贵州省已报道从病猪中分离出血清1/2型5，基于此，针对养殖场猪链球菌病的精准鉴定及治疗，是解决以上问题的重要手段。本试验针对贵州省某养殖场出现猪急性死亡的现象，采用分子生物学检测手段，明确疫病感染情况；采用分离培养、形态学鉴定、生化试验、分子生物学鉴定及药敏试验对链球菌进行分离鉴定及耐药分析，拟为该养殖场的疫病防治工作提供科学依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 病料来源2例病死猪肺组织样本均采集于贵州省某猪场，死亡猪分别为87日龄和53日龄，临床表现为不同程度的呼吸道疾病症状，疑似为呼吸系统疾病相关细菌或病毒感染导致。1.1.2 主要试剂胰蛋白胨大豆琼脂（TSA Agar），购自青岛海博生物公司；PBS，购自上海索莱宝生物科技有限公司；柱式 DNA 核酸提取试剂盒，购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；DreamTaq Green PCR Master Mix（2X）和BstNI 限制性内切酶，均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；DL-2000 Marker、Trizol、PrimeScriptTM RT reagent Kit（RR047），均购自宝生物工程（大连）有限公司；细菌微量生化反应管和药敏纸片，均购自杭州滨和微生物试剂有限公司；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.1.3 主要仪器立式压力蒸气灭菌器（YSQ/LS/70A）、37 恒温培养箱（GSP 9160MBE），均购自上海博讯实业有限公司；超净工作台（SW/CJ11Fc），购自苏州净化设备有限公司；低温高速离心机（Microfuge 20R），购自美国贝克曼库尔特有限公司；PCR扩增仪（BSA223S），购自美国应用生物系统公司；电泳凝胶图象分析系统（Gel Doc XB+），购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；-20 冰箱（BCD-642WDVMU1），购自青岛海尔股份有限公司。1.2 方法1.2.1 引物设计与合成引物序列引用自参考文献5-16，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表1。表1 引物序列信息引物名称引物序列（5 3）退火温度（）产物长度（bp）参考文献备注GdhF：GCAGCTATTCTGTCAAACG556886鉴定猪链球菌R：CCATGGACAGATAAAGATGGHpsF：GTGATGAGGAAGGGTGGTGT598217鉴定副猪嗜血杆菌R：GGCTTCGTCACCCTCTGTMhpF：ACAAGGTCTTTCACTTGCG564218鉴定猪肺炎支原体R：GGTGATTGCTTGTTCGGCAppF：TAGAACCTTGTAAGCCTCGTCCATA564899鉴定猪传染性胸膜肺炎R：CGTTTGTTAAGTGGTGTTGAGCPlpEF：ATGAAACAAATCGTTTTAAA501 00810鉴定多杀巴氏杆菌R：TTATTGTGCTTGGTGACTTPCVF：CACGGATATTGTAGTCCTGGT5549411鉴定猪圆环病毒R：TTTGAATTCTTACGACACGGCGTCGCAPRRSVF：ATGTTGTGCTTCCTGGGGTTGA 5892612鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒R：TGTGTCATCAAGCAGCTCCCTG16S rRNAF：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG591 46613-R：ACGGCTACCTTGTTACGACTTCps1IF：TCTTATAACAGGCGTCAAAACA5515314血清1型R：ATCGGTATAAAAGCAAGACACACps1/2JF：GATTTGTCGGGAGGGTTACTTG6145015血清1/2型R：TAAATAATATGCCACTGTAGCGTCTCCps2JF：ATGTTTGGAATACGCAGAGCAAAGAT553515血清2型R：CAACAAGGGCTATTAAAGATACCGCCps7HF：AGCTCTAACACGAAATAAGGC552515血清7型R：GTCAAACACCCTGGATAGCCGCps8HF：ATGGGCGTTGGCGGGAGTTT5932015血清8型R：TTACGGCCCCCATCACGCTGCps9HF：GGCTACATATAATGGAAGCCC553885血清9型R：CCGAAGTATCTGGGCTACTGcpsKF：GTTGCTGGTTATGATAGGGTAG5348616-R：AAGCTTCTTTTGCTGTTTGCTC32023.8试验研究1.2.2 核酸提取病死猪剖检后，取适量肺病变组织样本于1.5 mL EP管中，加入约1 mL的灭菌生理盐水，于全自动研磨仪中进行充分研磨后，按照试剂盒说明书提取DNA，于-20 保存备用。采用Trizol法提取RNA，参照试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，于-20 保存备用。1.2.3 PCR（或病原）检测PCR扩增反应体系为25 L，分别为2PCR pre-Mix 17.5 L、ddH2O 4.5 L、上下游引物各1 L、模板1 L。PCR反应条件为95 5 min；95 30 s，退火30 s，72 50 s，35个循环；72 10 min。取5 L PCR产物于2%琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像仪下观察结果。1.2.4 细菌分离纯化及形态学观察无菌环境下，分别采集2例病死猪肺组织，接种于含5%新生牛血清的胰酪大豆胨琼脂（TSA）培养基，37 恒温培养24 h，观察菌落生长形态特征。挑选疑似链球菌的单菌落进行纯化，纯化后的菌株于TSA固体培养基上进行传代培养，并进行革兰氏染色。用100油镜观察菌体形态特征及染色特性。1.2.5 生化试验参照生化试验管的说明书进行操作，将1.2.4分离纯化的菌株分别接种于甘露糖、山露醇、山梨醇、-半乳糖苷、葡萄糖、乳糖、棉籽糖、七叶苷、水杨素、赖氨酸脱羧酶等微量生化管中，37 培养2448 h后，观察结果。根据伯杰细菌鉴定手册对各生化反应结果进行判定。1.2.6 细菌的16S rRNA扩增及遗传进化分析利用表1中的16S rRNA引物，参照1.2.3中的PCR扩增体系及反应条件，对分离获得的2株疑似菌进行PCR扩增及电泳，并将PCR产物送至成都擎科生物科技有限公司进行测序。采用DNAStar软件对测序获得的16S rRNA序列进行拼接、比对，采用Mega6软件将其与 GenBank 上的不同血清型菌株 16S rRNA 序列进行遗传进化分析，绘制系统进化树。1.2.7 细菌血清分型及酶切鉴定根据分离鉴定结果，对分离菌株进行分型鉴定，采用的分型引物序列，见表1，参照1.2.3中的PCR扩增体系及反应条件，对分离获得的菌株进行PCR扩增及电泳检测。针对分离菌株，采用PCR-RFLP方法16对阳性菌进行酶切鉴定，限制性内切酶消化5 L，置于37 孵育，取5 L于2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，鉴定分离菌株血清型。1.2.8 细菌药敏试验将猪链球菌纯培养物均匀涂抹于TSA平板上，用无菌镊子将各类药敏片分别平贴于培养基的表面，于37 恒温培养箱中培养2448 h观察并测量抑菌圈的直径。药敏试验结果参考杭州微生物试剂有限公司提供的药敏试验纸片法的抑菌范围标准来判断猪链球菌对药物的敏感程度。2 结果2.1 病原检测结果2头病死猪的肺脏组织PCR鉴定结果为猪链球菌（Gdh）检测结果阳性；多杀巴氏杆菌（PlpE）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV）、猪传染性胸膜肺炎（App）、猪肺炎支原体（Mhp）和副猪嗜血杆菌（Hps）检测结果为阴性，见图1。图1 病猪肺脏组织PCR检测结果M：DL-2000 Maker；1、4、7、10、13、16、19：空白对照；2、3：样品1、2（PlpE）；5、6：样品1、2（PRRSV）；8、9：样品1、2（PCV）；11、12：样品1、2（Gdh）；14、15：样品1、2（App）；17、18：样品1、2（Mhp）；20、21：样品1、2（Hps）2.2 细菌纯化及镜检结果2株疑似菌株进行分离纯化，TSA平板上均可观察到菌落边缘平滑、呈针尖状大小、灰白透明且接近圆形，见图2A、2C；挑取单菌落进行革兰氏染色，镜检均为革兰氏阳性菌，多以圆形或椭圆形组成的链状形式存在，镜检形态特征，见图2B、2D。图2 细菌形态学鉴定 A：菌株1的菌落形态；B：菌株1的革兰氏染色；C：菌株2的菌落形态；D：菌株2的革兰氏染色2.3 生化试验结果生化试验结果表明，菌株1可发酵甘露糖、葡萄688 bp250 bpM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21100 bp2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp4 2023.8试验研究糖和乳糖，可利用七叶苷和水杨素，-半乳糖苷呈阳性；菌株2可发酵甘露糖、葡萄糖、乳糖和棉籽糖，可利用七叶苷和水杨素，见表2。2种菌株的糖、醇发酵能力及其他生化试验的鉴定结果符合链球菌的生化特性。2.4 16S rRNA基因扩增及测序结果分析如图3、4所示，分离菌株与GenBank中已公布的不同血清型猪链球菌株的同源性为96.0%99.9%，其中菌株1与GenBank登录号为CP011419的血清2型菌株构成同一分支，同源性为98.4%；菌株2与GenBank登录号为CP024126的血清2型菌株构成同一分支，同源性为98.4%。表明分离的2菌株均为猪链球菌，并将菌株1命名为GYSS73，菌株2命名为GYSS74。表2 分离菌株的生理生化特征生化项目菌株1菌株2甘露糖+甘露醇-山梨醇-半乳糖苷+葡萄糖+乳糖+棉籽糖-+七叶苷+水杨素+尿素-赖氨酸脱羧酶-木糖-图4 分离株16S rRNA基因核苷酸序列构建系统进化树2.5 血清型鉴定结果GYSS73和GYSS74菌株均未扩增出血清1、7、8和9 型目的条带，但2株菌均扩增出血清1/2、2型目的条带，分别是450 bp和351 bp，见图5，表明2株分离菌为猪链球菌血清1/2或2型。图5 猪链球菌分离株血清型PCR鉴定结果M：DL-2000 Maker；1、2：GYSS73、GYSS74菌株（Cps1I）；4、5：GYSS73、GYSS74菌株（Cps1/2J）；7、8：GYSS73、GYSS74菌株（Cps2J）；10、11：GYSS73、GYSS74菌株（Cps7H）；13、14：GYSS73、GYSS74菌株（Cps8k）；16、17：GYSS73、GYSS74菌株（Cps9H）；3、6、9、12、15、18：空白对照图3 分离株16S rRNA基因核苷酸序列同源性比较450 bp351 bp250 bpM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18100 bp2 000 bp1 000 bp750 bp500 bpCP058742.Netherlands_Serotype1CP102137.Spain_Serotype2CP102152.Denmark_Serotype9CP030022.USA_Serotype2CP047248.China_Serotype10NR_036918.1Canada_Serotype2CP002465.Cina_Serotype14CP006246.Cina_Serotype15FM252031.Sichuan_Serotype2CP100432.Serotype15CP102141.Denmark_Serotype8GYSS73CP011419.Canada_Serotype2GYSS74CP024126.Nanjing_Serotype2CP002007.Beijing_Serotype2CP102143.Netherlands_Serotype2CP071806.China_Serotype7CP102135.Spain_Serotype30CP030124.China_Serotype4CP003993.China_Serotype16CP002644.China_Serotype9CP068708.Thailand_Serotype24CP076517.Thailand_Serotype1CP079193.Thailand_Serotype5CP017092.USA_Serotype10CP017785.USA_Serotype12CP102136.Spain_Serotype19CP030125.China_Serotype4CP017666.Guangxi_Serotype31CP017667.Guangxi_Serotype152023.8试验研究为进一步确定GYSS73和GYSS74的血清型，对分型特异性cpsK基因的PCR产物进行PCRRFLP 鉴定。如图6所示，经BstNI 限制性内切酶消化后，GYSS73菌株的条带未被切开，酶切后呈486 bp目的条带，表明其为猪链球菌1/2型；GYSS74菌株被切成长度约为139 bp和347 bp的2段目的条带，表明分离菌株为猪链球菌2型。图6 PCR-RFLP鉴定结果M：DL-2000 Maker；1：GYSS73（cpsK）；2：GYSS74（cpsK）；3：SS1/2型阳性对照（cpsK）2.6 药敏试验结果采用16种抗生素对2株菌株进行药物敏感性检测，见表3。结果显示，GYSS73对阿莫西林和头孢拉定敏感，对头孢噻肟中介，对庆大霉素、丁胺卡那、氨苄西林、青霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氟苯尼考、红霉素、复方新诺明、磺胺异恶唑、大观霉素和克林霉素13种药物耐药；GYSS74对阿莫西林和青霉素敏感，对大观霉素、头孢噻肟和头孢拉定中介，对庆大霉素、丁胺卡那、氨苄西林、恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氟苯尼考、红霉素、复方新诺明、磺胺异恶唑和克林霉素11种药物耐药。表3 分离菌株药敏试验结果药敏片 判定标准 抑菌圈直径（mm）判定结果耐药R中介I敏感SGYSS 73GYSS 74GYSS 73GYSS 74庆大霉素12131415710RR丁胺卡那141516176.57RR氨苄西林1819252677.5RR阿莫西林131417182020.5SS青霉素192027281820.5RS恩诺沙星151620211315RR诺氟沙星121316171011.5RR环丙沙星1516202112.515RR氟苯尼考1718202114.517RR红霉素1516202170RR复方新诺明2425313212.55RR磺胺异恶唑1516222310.52RR大观霉素141517181215RI克林霉素1516181900RR头孢噻肟1415222318.519.5II头孢拉定1415171819.516SI3 讨论猪链球菌是猪最重要的细菌病原之一，对全世界养猪业造成重大经济损失。本研究从病死猪肺组织中分离纯化出2株疑似菌株，经形态学鉴定、生化试验、分子生物学分析确定2株菌株分别为猪链球菌血清1/2型和2型，并分别将其命名为GYSS73和GYSS74。基于16S rRNA序列构建系统发育树的结果显示，GYSS73与CP011419（低毒力、血清2型加拿大分离株）菌株在同一个分支，同源性为98.4%；GYSS74与CP024126（低毒力、血清2型南京分离株）菌株在一个分支，同源性为98.4%；表明GYSS73和GYSS74菌株可能与其他地区猪链球菌血清2型存在演化关联，推测是在生猪贸易或引种过程导致的输入型病原，提示相关部门或引种场应重视和加强以上2个环节的猪链球菌检疫、防控工作。本试验中为提高菌株鉴定的准确性，在16S rRNA序列系统进化分析的基础上，分别针对猪链球菌血清1、1/2、2、7、8和9型特异的荚膜多糖（Cps）毒素基因Cps1I、Cps1/2J、Cps2J、Cps7H、Cps8H和Cps9H进行检测，结果显示，GYSS73和GYSS74均能扩增出Cps1/2J和Cps2J目的片段。无法明确GYSS73和GYSS74菌株血清型。相关研究也表明，普通PCR方法不能区分血清1/2型和2型17。进一步挖掘文献资料发现，虽然猪链球菌血清1/2型和2型的cps基因序列同源性较高，但cpsK基因的483位单核苷酸可发生突变，血清2型的cpsK基因483位核苷酸为G，而血清1/2型的cpsK基因483位核苷酸为C或T，此位点可作为BstNI酶的酶切位点16，以此来区分血清1/2型和血清2型链球菌。故本研究进一步采用PCR-RFLP进行鉴定，结果显示GYSS73菌株为血清1/2型，GYSS74菌株为血清2型。由此可知，该结果中GYSS74菌株与16S rRNA系统进化树及不同血清型特异基因检测结果一致；而GYSS73菌株则与前述结果不一致。这提示在对猪链球菌进行分子生物学诊断时需结合多种方法联合鉴定分析，才能为临床治疗提供科学依据。目前，生猪养殖过程中防治猪链球菌的主要手段有免疫预防和抗生素治疗。但因其血清型复杂且同一场内存在多种血清型混合感染的情况，导致免疫预防效果不佳；抗生素是治疗猪链球菌有效方法之一，但生产上滥用抗生素则会导致耐药菌的产生。因此，为减少生产环节抗生素滥用，本试验针对分离获得的GYSS73和GYSS74菌株开展了药敏试验，结果显示，2株猪链球菌均对氨基糖苷类（庆大霉素、丁胺卡纳）、喹诺酮类（恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星）、氯霉素类（氟苯尼考）、大环内酯类（红霉素）、磺胺类（复方新诺明、磺胺异恶唑）、林可胺类（克林霉素）和氨苄西林486 bp347 bp139 bp250 bpM 1 2 3100 bp2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp6 2023.8试验研究耐药，而对阿莫西林高度敏感。而已有研究也显示，新疆阿克苏地区分离的猪链球菌对磺胺类、阿莫西林、大环内酯和林可胺类药物产生耐药18；河北分离的猪链球菌血清21型对林可胺类（林可霉素）耐药，而对大环内酯（阿奇霉素）敏感19；等河南分离的猪链球菌血清8型对红霉素明显耐药，而对氨苄西林、青霉素、环丙沙星、氧氟沙星和复方新诺明敏感20。这表明不同地区、不同血清型猪链球菌对已有的抗生素产生了不同程度的抗性，提示养殖场在选择猪链球菌治疗药物时，应以药敏试验结果为指导，以达到有效治疗、减少抗生素滥用、降低养殖成本、提高生产效率的目的。4 结论从贵州省某规模化猪场的病死猪肺组织样品中分离到猪链球菌1/2型和猪链球菌2型各1株。2株猪链球菌分离株均对阿莫西林高度敏感，可用于临床治疗。参考文献1 朱水荣，李萍，吕沈聪，等浙江省首例14型猪链球菌人源分离株鉴定及分子特征分析J中国人兽共患病学报，2023，39（2）：115-1232 岑静2型猪链球菌5种抗原与LTB和FLIC的融合表达及免疫原性研究D长沙：湖南农业大学，20173 Zhang A，Yang M，Hu P，et alComparative genomic analysis of Streptococcus suis reveals significant genomic 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