猪圆环病毒2型分离鉴定与致病性研究.pdf

PECIAL ECONOMIC ANIMALS AND PLANTS特种经济动植物S62023 年/第 9 期猪圆环病毒 2 型分离鉴定与致病性研究谢春贤（甘肃省嘉峪关市畜牧技术推广站 甘肃 嘉峪关 735100）摘要：为了解猪圆环病毒 2 型（PCV-2）的致病性，采集疑似猪圆环病毒 2 型感染的病死猪的淋巴结和脾脏等病料组织 5 份，采用 PCR 方法、病毒的分离培养、间接免疫荧光试验等方法对 PCV-2进行分离鉴定，并采用动物人工感染试验验证分离毒株的致病性。结果表明：通过采用 PCR 方法、病毒的分离培养、间接免疫荧光试验等方法分离得到了 1 株 PCV-2 分离毒株，命名为 HLC1 株，其TCID50为 4.12107TCID50/0.1mL，分离的 PCV-2 毒株 HLC1 株对 28 日龄仔猪具有致病性。研究结果可为猪圆环病毒 2 型的综合防控提供参考依据。关键词：猪圆环病毒 2 型；TCID50；分离鉴定；致病性猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）为单股负链环状 DNA 病毒，是直径为 17nm 的圆形小病毒粒子，呈 20 面体对称，没有囊膜，同时该病毒被认为是目前已知能在哺乳动物细胞中自行复制的最小病毒。现已发现了 4 个型，即PCV-1、PCV-2、PCV-3 和 PCV-4，其中 PCV-2的致病性较高，患病后的仔猪表现为多系统衰竭综合征，一般会出现生长发育迟缓，身体逐渐消瘦，呼吸困难，精神萎靡，皮毛杂乱，食欲减退等症状，而且 PCV-2 容易与其他病毒共同侵害仔猪，出现混合感染，使病情加重，增加治疗难度1-4。猪感染 PCV-2 后可引起免疫抑制，使机体免疫力下降，在生猪养殖领域中流行较广，威胁不同、年龄不同品种的猪，其中对断乳仔猪、育成猪和繁殖母猪威胁最为严重，给养殖户造成巨大的经济损失5-6。目前，我国基层养猪业的发展规模不断扩大，PCV-2 的发生频率也不断提高，严重威胁到了我国基层养殖产业的健康发展。通过对猪圆环病毒 2 型（PCV-2）的分离鉴定与致病性进行研究，可为 PCV-2 的诊断和预防提供指导，以便做好 PCV-2 的防控工作。1 材料与方法1.1 病料来源 2023 年 2 月，采集疑似猪圆环病毒 2 型感染的病死猪的淋巴结和脾脏等病料组织 5 份。1.2 试验方法1.2.1病毒的 PCR 鉴定根据 GenBank 中发布的 PCV-2 基因序列设计的 PCV-2 型鉴定引物F1：5-ACCGTTACCGCTGGAGAAGGAA-3；F2：5-TGGTTACACGGATATTGTAGTCCTG-3；引 物大小为 549bp。引物由生物工程（上海）股份有限公司合成。将病料组织按照 1 5 的比例加入无菌 PBS 进行研磨后，取组织悬液进行分离上清液（10000r/min 离心 5min），过滤除菌，采用病毒DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA，以提取基因组 DNA 为模板进行 PCR 鉴定。1.2.2 病毒的分离与培养 将 PK-15 细胞从液氮中取出室温复苏，在无菌条件下在 24 孔板中加入 DMEM培养液（含 10%胎牛血清），在 375%CO2培养箱中进行培养。取 PCR 鉴定阳性的病料组织，按照 1 5 的比例加入无菌 PBS 进行研磨，在-80条件下反复冻融 3次，取组织悬液进行分离上清液（10000r/min 离心 5min），过滤除菌（022nm 的滤器）。当 PK-15 细胞单层长到 85%时，弃 DMEM培养液，用 DMEM培养液洗涤 3 次，按照 1 100 比例加入上清液（病毒液），在 375%CO2培养箱中吸附 1h 后加入 DMEM培养液（含 10%胎牛血清），在 375%CO2培养箱中继续培养 2448h，盲传 10 代后，收取细作者简介：谢春贤（1987.10-），女，中级兽医师，从事畜牧技术，动物检疫工作。实验研究72023 年/第 9 期胞在-80条件下保存，提取基因组 DNA，用PCV-2 型鉴定引物进行 PCR 鉴定。1.2.3 间接免疫荧光试验检测 将 PK-15细胞在无菌条件下接种于24孔板中，加入 DMEM 培养液（含10%胎牛血清），在375%CO2培养箱中培养至65%，将 PCR 鉴定为 PCV-2阳性的盲传10代病毒液，按照上述方法接种到24孔板中吸附1h，同时设立空白对照孔，DMEM培养液（含10%胎牛血清）在375%CO2培养箱中培养48h，进行间接免疫荧光试验检测。1.2.4 病毒的 TCID50的测定 将 PK-15 细胞在无菌条件下在接种于 24 孔板中,加入 DMEM培养液（含 10%胎牛血清），在 375%CO2培养箱中培养至 85%，将间接免疫荧光试验为阳性的病毒液在-80条件下反复冻融 3 次，离心取上清液（1000r/min，10min）并进行 10 倍梯度稀释，分别接种于 PK-15 细胞，每个稀释度接种 10 个重复，同时设立对照组，培养 48h 后进行间接免疫荧光检测，采用 Karber法计算 HLC1 株的TCID508。1.2.5 动物人工感染试验 将 10 头 8 日龄、体重相近的三元杂交仔猪分成 2 组，每组 5 头。每头仔猪通过肌肉注射的方法攻毒盲传 10 代病毒液 2mL，剂量为 412107TCID50/头，对照组给予等量的 PBS。观察每个试验组仔猪的发病情况，采集病死仔猪的病料组织，采用 PCR 方法和间接免疫荧光试验进行 PCV-2 鉴定9。2 结果与分析2.1 病毒的 PCR 鉴定结果 由图 1 可知，从采集的病料组织中扩增到约为 549bp 的目的片段，说明采集疑似猪圆环病毒 2 型的病死猪的病料组织中含有 PCV-2。MPN123549bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpMDL-2000Marker；PPCV-2 病毒；N 空白对照；12 淋巴结组织；3 肺脏组织。图 1 淋巴结和肺脏组织 PCR 扩增结果2.2 病毒的分离与培养由图2可知，从盲传10代的细胞培养物中扩增到约为 549bp的目的片段。与预期一致，通过测序分析，确定分离毒株为PCV-2，命名为HLC1株。MPN123549bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpMDL-2000Marker；PPCV-2 病毒；N 空白对照；13 细胞培养物。图 2 淋巴结和肺脏组织 PCR 扩增结果2.3 间接免疫荧光试验检测由图 3 可知，感组 PCV-2 阳性的盲传 10 代病毒液的PK-15 细胞可观察到特异性绿色荧光，对照组的 PK-15 细胞未见特异性荧光。PECIAL ECONOMIC ANIMALS AND PLANTS特种经济动植物S82023 年/第 9 期ABA 感染组 PK-15 细胞；B 对照组的 PK-15 细胞。图3 间接免疫荧光试验检测2.4 病毒的 TCID50的测定结果采用Karber法计算 HLC1株的 TCID50，结果显示，HLC1株的TCID50为412107TCID50/01mL。2.5 动物人工感染试验结果攻毒组的仔猪在攻毒后的 36d 出现精神沉郁、采食量减少，被毛粗乱、个别身上出现小红点，其中 3 头仔猪在攻毒后的 5d 出现死亡，死亡率为 60%。对死亡仔猪进行剖检，可见肺脏、脾脏及淋巴结出现不同程度的病理变化。采集死亡仔猪病料组织，采用 PCR 方法和间接免疫荧光试验鉴定 PCV-2为阳性，对照组的仔猪未出现明显临床症状，说明分离的 HLC1 株对仔猪具有致病性。3 讨论猪圆环病毒对养猪业的危害比较大，尤其是我国 PCV2 感染率居高不下，给养殖户造成了巨大的经济损失，临床中 PCV-2 单独感染一般不会引起猪发生典型的临床症状，尤其 PCV 与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒病病毒（PPV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪附红细胞体、猪副猪嗜血杆菌病等病毒发生混合感染后，将导致感染猪出现严重的临床症状2-5。PCV-2 的感染能诱导产生免疫抑制并损害免疫系统，造成免疫功能紊乱，给养猪业造成严重的经济损失10。因此，在仔猪的日常的养殖工作中，要定期接种 PCV-2 疫苗，降低 PCV-2 对仔猪群的不利影响，同时加强饲养管理，减少该病的发生与流行概率。4 结论试验从疑似猪圆环病毒 2 型感染的病死猪的淋巴结和脾脏等病料组织中分离得到了 1 株PCV-2 分离毒株，命名为 HLC1 株，其 TCID50为412107TCID50/01mL，分离的 PCV-2HLC1 株毒株对 28 日龄仔猪具有致病性。HLC1 株分离为PCV-2 疫苗的制备奠定了良好基础。参考文献1翟新国，李朋辉，苏金辉，等.河北省及周边地区猪圆环病毒 2 型的遗传变异与重组分析 J.黑龙江畜牧兽医，2023，665（5）：80-86，137.2王承玉，李鑫淼，郑朝朝，等.猪圆环病毒悬浮培养工艺研究 J.中国猪业，2023，18（1）：67-70，75.3周博.复方中草药制剂对断奶仔猪猪圆环病毒 2 型抗体和免疫机能的影响 J.中国猪业，2023，18（1）：84-86.4王福厚，李风云，葛生虎.河北邢台及周边地区猪圆环病毒 2 型分子流行病学调查 J.养猪，2022，185（6）：113-115.5高小鹏，罗胜军，徐麟，等.猪圆环病毒 2 型分子流行病学研究进展 J.中国兽医学报，2022，42（11）：2315-2321.6陈翔鸿，黄英，宋文博，等.20192020 年我国中南地区猪圆环病毒 2 型的分子流行病学研究 J.畜牧与兽医，2022，54（11）：84-91.7李枝兰，何帅，张敬寒，等.云南省部分地区猪圆环病毒2 型的分离鉴定与进化分析 J.黑龙江畜牧兽医，2021，633（21）：74-80，85，153.8何帅，章雨竹，吕念词，等.云南省猪圆环病毒 2 型遗传进化分析 J.广东农业科学，2022，49（12）：110-117.9库旭钢.猪圆环病毒3型分子病原学监测及分离株致病性研究 D.武汉：华中农业大学，2022.10 徐丽华，苏菲，李军星，等.2016 2020 年浙江地区猪圆环病毒 2 型分子流行病学分析 J.浙江大学学报（农业与生命科学版），2022，48（5）：644-652.