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生物基因工程专题报告
深圳源动力生物技术有限公司
一、原核基因工程上游技术
二、原核基因工程下游技术

一、原核基因工程上游技术
大肠杆菌表达系统的特点
（1） 遗传背景清楚，容易审批，例如：Amgen四个由E.coli生产并向FDA注册上市产品，年销售额超过二十亿美元。
（2） 容易大规模发酵
（3） 克隆和表达的各种载体和菌株齐全
（4） 背景文献丰富，上下游配套技术产品齐全
（5） 易形成包涵体，但近年来研究方向使得大量外源基因能在E.coli里正确折叠，如IL-11、G-CSF、GM-CSF、INF、IL-3、IL-6、Insulin、IL-2等均可获得正确折叠的重组可溶性活性蛋白
原核表达系统近年来研究取得突破性进展
1998年，美国Incyte Pharmaceutical公司华裔科学家Zhang Yang在《Protein expression and purification》(vol12,159-165)上发表论文《Expression of Eukaryotic proteins in soluble form in Escherichia coli》，文章采用E.coli分子内伴侣DsbA技术将IGF-I、IGFBP-3、3Cproteinase、TGFb-2、STGFb-RII、BDNF、GDNF、mEGFBP、Leptin和GFP十个基因全部实现了可溶性表达，且表达量均大于25%。更为惊奇的是由于DsbA分子伴侣的作用使得拥有9个半胱氨酸的复杂结构的IGFBP-3能在E.coli内形成可溶性具生物活性的高表达重组蛋白。
2002年，美国冷泉港实验室出版的《Protein Science》(2002,11:313-321)上发表了瑞典科学家Torleif《Rapid screening for improved solubility of small human proteins produced as fusion proteins in Escherichia coli》一文，从而揭开了原核高效快速组合筛选表达系统用于蛋白组学研究的序幕。

近年来Medline报导了大量利用原核表达获得有活性的可溶蛋白，现举例如下：
Gene
Expression method
Index
Proinsulin
DsbA fusion
J.Biotechnol 2001 84(2):175-85
htPA
DsbA coexpression
Appl Environ Microbiol 1998 64(12):4891-6
Bovine enterokinase
DsbA fusion
Biotech nology(NY),1995,13(9):982-7
Mucin
MBP fusion
Protein Expr Purif 1999,15(1)146-54
Human angiogenin
OmpA signal
Biochem Mol Biol Int1999,47(2):267-73
Bacillus lipase
OmpA signal
Appl Microbiol Biotechnol 1998 Apr;49(14):405-10
HEV antigen
Thioredoxin fusion
Zhonghua shi yan he lin chuang bing du xue za zhi 2002,16(1):20-2
P55 TNF receptor
Thioredoxin fusion
Protein Expr purif 2001,23(2)226-32
hLH/CG receptor
Thioredoxin fusion
Endocrine 2001,14(2):205-12
Pokeweed antiviral protein
MBP fusion
Protein Expr Purif 1999,15(1)146-54

原核基因表达定位
（1） 表达的外源蛋白定位于胞内
（2） 表达定位在胞质膜上
（3） 分泌外源蛋白到胞周质
（4） 分泌到胞外培养基
（5） 表达外源蛋白定位于菌体表面如脂蛋白、外膜蛋白、鞭毛蛋白
影响大肠杆菌中外源基因表达的因素
1、表达载体的选择
2、密码子的选择 大肠肝菌偏爱密码子表附后
3、翻译起始区
4、宿主的选择及培养条件的控制
5、折叠酶共表达、分子内伴侣和分泌表达可最大程度地避免包涵体形成。
基因表达是一项很复杂的工作，由于特定蛋白可否在大肠肝菌中按需要表达，目前尚无法预知，比较可行的办法是同时试验多种表达方法。
基因高效快速表达试剂盒
深圳源动力生物技术有限公司代理美国基因动力实验室的原核基因高效快速表达试剂盒将九种表达载体包括分泌型、引导分泌型、胞内直接表达型、分子内伴侣协助折叠型、高度稳定伴侣型等系统的多克隆位点统一，同时统一了诱导表达剂和统一了培养基，一次可以同时克隆九种载体进行表达筛选，极大地节省宝贵的科研时间。其实，象美国Amgen、Gentech、Incyte这类顶尖的生物技术公司也是采用多系统多载体同时筛选快速表达的策略。这一策略的最大优势就是快速且成功率高。本系统非常适合高通量快速筛选大量未知基因，对基因组学和蛋白组学的研究是一个不可缺少的工具。
1）冻干菌种可长期稳定保存
2）提供详实的操作说明和丰富的参考文献
3）下游多种亲和层析组合方便您快速纯化目的蛋白
4）分子内伴侣和分泌表达能最大限度避免包涵体形成，直接获得有活性可溶蛋白，这一点对于未知基因功能的研究很重要。
5）固相化蛋白酶使您去除融合伴侣十分简便
6）九套高效表达载体同时克隆筛选极大地节省您宝贵的科研时间
7）T7溶菌酶和lacIq阻遏蛋白能起到严格控制诱导前表达的作用，同时强启动子、高拷贝复制子等方法结合可获得高达50%的表达量。
本试剂盒包括冻干菌株、抗生素、统一多克隆位点的九种表达载体等。用户只要扩增出一段不带终止密码子或者带终止密码子的阅读框编码基因克隆进九种表达载体，可同时筛选，节省时间。一般两至三周可以筛选出表达菌株，在此基础上，进一步根据需要进行实验室菌株的优化从而成为工程菌株。

目的基因的扩增和酶切位点的选择

1）本试剂盒选用了统一的多克隆位点为
GGA TCC GCA GAA TTC AGC GCT AGC CAC（TAA） CAT CAT
BamHI EcoRI NheI His His His
CAT CAT CAT TAA GCTT
His His His HindIII
我们建议您扩增基因5 ¢端选BamHI或BglII，3¢端选NheI或XbaI或SpeI，同时3¢端不要带终止密码子，注意与GGA TCC（Gly Ser）表达框架正确，载体用NheI—BamHI双酶切。BamHI和BglII为同裂酶，NheI、XbaI和SpeI为同裂酶。
如您目的基因无法满足上述要求，如同时含有BamHI和BglII，5¢端可选择EcoRI，但须注意与表达框架GAA TTC（Glu Phe）对齐。如您目的基因同时含有XbaI、NheI和SpeI，3¢端可选择EcoRI。
如果您的目的基因已带有终止密码子，同样可以进行克隆表达，只是注意有些表达载体是在C端带6个His。
PCR引物设计时BamHI和EcoRI位点的5¢端保护碱基有2至3个GC即可，而XbaI、NheI和SpeI位点5¢端保护碱基须在5个左右才容易被酶切割。

本试剂盒采用的技术路线如下：
您提供的基因ORF 九种表达载体

¯克隆
¯诱导（小样）
¯SDS—PAGE分析
筛选出表达菌株
¯
发酵（中样）
¯
亲和层纯化融合蛋白
¯
固相化蛋白酶柱或液相切割
¯
目标蛋白

pLLP—OmpA表达载体采用E.coli强启动lpp和OmpA分泌信号肽，同时在C端添加了6个His可采用chelating sepharose亲和层析纯化目标蛋白。该表达载体成功地实现过人生长激素的基因工程工业化，经多年临床验证，分泌型重组人生长激素临床副反应大大低于包涵体型的重组人生长激素。
pLLP—STII表达载体采用E.coli强启动lpp和STII分泌信号肽，同时在C端添加了6个His便于采用chelating sepharose亲和层析纯化目标蛋白。STII信号肽引导能力强且易于被E.coli信号肽酶切割。即使第一个氨基酸是半胱胺酸的干扰素也可以实现分泌表达。
pMBP—P表达载体采用E.coli tac启动子和分泌型麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein）同时选用凝血酶切割位点并在C端添加6个His便于采用chelating sepharose亲和层析纯化目标蛋白。该表达系统在Medline里有大量的背景文献参考。它通过MBP引导分泌，可以实现许多基因在周质空间里正确折叠，如TPO（1-153aa）、GM—CSF、IL—2等。我们采用这一表达系统配合固相化的凝血酶成功地获得了正确折叠的rhGM—CSF，临床试用表明其副反应比包涵体型rhGM—CSF大大降低。该表达载体表达的蛋白还可通过Amylose亲和层析。
pMBP—C表达载体采用E.coli tac启动子和胞内可溶性麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein），同时选用凝血酶切割位点并在C端添加6个His便于采用chelating sepharose亲和层析纯化目标蛋白。该表达系统在Medline里有大量背景文献参考。它通过MBP胞内融合表达，表达产物可占菌体的20%—30%，可形成可溶性蛋白，也可形成包涵体。融合蛋白还可以通过Amylose亲和层析纯化。
pET—GST表达载体采用T7启动子和GST融合表达，同时选用人鼻病毒14亚型3C蛋白酶专一性切割位点。本公司有高纯度的重组人鼻病毒14亚型3C蛋白酶出售，同时还有专一性吸附该蛋白酶的树脂出售。此外，C端还添加了6个His，便于采用chelating sepharose亲和层析。本载体表达的融合蛋白可采用吸附GST的亲和层析和6个His的chelating sepharose双重亲和层析，极大地方便了下游纯化。GST融合表达背景文献在medline里极为丰富，有数百个基因采用GST融合表达成功。
pET—Trx表达载体采用蛋白质工程改造的硫氧还蛋白即将其中两个氨基酸突变成His，使硫氧还蛋白在空间立体结构上形成三个组氨酸位点（His-patch），便于采用chelating sepharose亲和层析。该表达载体采用T7启动子和（His-patch）Thioredoxin融合表达，同时选用人鼻病毒14亚型3C蛋白酶专一性切割位点。硫氧还蛋白作为分子内伴侣可以帮助许多基因在E.coli胞内正确折叠如IL—3、IL—6、IL—11等。
pET—His表达载体采用N端6个His和T7启动子。高效表达的产物N端具备6个His，便于采用chelating sepharose 亲和层析纯化目标蛋白。同时该载体选用了凝血酶专一性切割切点。融合蛋白既可以采用高纯度限制级的冻干凝血酶（本公司有售）液体切割，也可以采用固相化凝血酶（Sigma有售）切割。
pTrc—CKS表达载体采用T7启动子和蛋白质工程改造过CKS基因融合表达，同时选用人鼻病毒14亚型3C蛋白酶专一性切割位点。CKS融合表达是美国Abbot公司的专利，CKS融合蛋白研制成功HIV和HCV重组抗原并取得FDA认证在美国上市。CKS是一个非常稳定且高度可溶的理想伴侣。本发明除去掉CKS C端8个氨基酸外，还将C端Met突变成Thr，一方面可报自已的专利，另一方面有利于基因表达。
pET—DsbA表达载体采用T7启动子和DsbA基因融合表达，同时选用凝血酶切割位点。DsbA是近年来发现帮助二硫键形成的重要分子内伴侣之一。本试剂盒DsbA基因去掉了信号肽，同时将DsbA氧化还原功能相关的两个半胱氨酸（cys）突变成丝氨酸（ser），这样与突变后的DsbA融合可实现许多基因的胞内可溶性有活性的高表达（表达量大于30%），如IGF—1、IGFBP、EGF、Insulin等。
本试剂盒还将两种E.coli菌株冻干方便长期保存。
成功客户案例----汕头大学医学院肿瘤病理室李恩民、许艳丽老师课题组承担国家863课题食管瘤相关癌基因的研究。
该课题组获得肿瘤相关基因NGAL，希望能表达分离出蛋白以进一步研究其功能。课题组曾使用过Qigen公司PQE载体和6His-tag蛋白纯试剂盒、pharmcia公司pGEX(GST融合)和Novagen公司的pET15b等载体，用了近一年时间均未获得成功。原因均为包涵体表达且发酵放大过程中表达量下降。而该课题组尚未建立NGAL蛋白测活方法，为此包涵体变性和复性后活性难以测定。珠海某制备抗体的公司也接过该课题而未能成功。2002年9月李教授课题组购买了本公司的基因高效快速表达试剂盒后，仅用两周时间就成功地筛选到9号载体表达融合蛋白表达量高且可溶。随后到中试纯化，前后仅用四天就获得了40mg纯度>95%（SDS-PAGE）非融合蛋白。随后一系列实验证明该实验方案十分理想。

本公司有2002年5月出基因高效快速表达试剂盒上市以来，已有广州、武汉、成都、深圳、西安等三十多家实验室采用，其中有50%以上的实验室取得了相当令人满意的结果，解决了多个863相关子课题。尤为令人瞩目的是有几个是寻找新基因的863课题，由于新基因功能是不确定性，为此采用本试剂盒可以快速获得分泌型或可溶性纯蛋白，对活性功能的研究分析很方便。
实验室菌种库建立及其意义
一般分子生物学和基因工程实验室常用来扩增质粒的菌株E.coli JM109、E.coli DH5α、E.coli HB101等，常常从别的实验室转种而来，对其基因型缺乏确切的验证。学生在实验研究中常常用LB平板连续传代，有时一个学期就靠平板上传代来培养感受态等试验。这样表面上看来很方便，但事实上由于微生物容易发生突变，这就造成了克隆实验中转化效率不高、转化涂平板时出现氨苄抗性的小菌落、提取的质粒酶切时易于降解甚至出现基因重组突变之类的实验怪现象，这些小问题往往造成实验进程受阻，更糟的是很难分析原因。
为了根本上克服这个问题，我们将建议您购买本试剂盒后第一件事就是建立原始种子库、试验种子库和感受态种子库。
1）E.coli TOP10Fˊ冻干菌株和E.coli BL21(DE3)plysS冻干菌株，为原始种子库，于-20oC长期保存。
2）从冻干的原始种子库中取一支里面冻干的少许粉末，加入10ml LB液体培养（其中E.coli TOP10Fˊ具四环素抗性，10ml LB液体培养基加5ml(浓度为5mg/ml)四环素；E.coli BL21(DE3)plysS为氯霉素抗性，10ml LB液体培养基加5ml(浓度为25mg/ml)氯霉素。）37oC，150转振荡培养过夜。
3）第二天转种1ml至40ml液体LB培养基（抗生素添加方法同上，注意E.coli TOP10Fˊ抗四环素，E.coli BL21(DE3)plysS抗氯霉素）。37 oC，200转振荡培养3-4小时，至OD600 0.4-0.5之间，取一半用15%的灭菌甘油各保存50支(-70 oC)，即成试验种子库。另一半用SSCS溶液制备感受态，分装于每支120ml 50-100支于-70 oC保存，即成感受态种子库。
4）如没有SSCS溶液，今后可每次从试验种子库里选一支划LB平板，用后即弃去。可用CaCl2法制备新鲜感受态，一般CaCl2法感受态在4 oC可保存两至三天。平板上菌株保存时间不超过三周，避免反复连续在LB平板上传代。
大肠杆菌表达载体的元部件
以pTrc HisB为例
（1） 复制子(ori)
（2） 启动子(Ptrc)
（3） 终止子(rrnBTT)
（4） 抗终止子(antiterminator)
（5） 双顺反子(minicistron)
（6） 操纵子(lacO)
（7） 核糖体结合位点(g10 RBS)
（8） 抗性基因(Amp)
（9） 阻遏基因(lacIq)
（10）翻译增强子(translation enhancer)
（11）起始密码(ATG)
（12）终止密码(TAA,TAG,TGA)
大肠杆菌偏爱密码子与基因全合成
1、尽量不选择8个稀有密码子(AGA,AGG,CCC,CTA等)
2、大肠杆菌偏爱密码子表
3、基因全合成策略
选择大肠杆菌偏爱密码子，避免mRNA形成稳定的二级结构不利于表达，尽量降低GC含量，采用链延伸法和重叠PCR全合成基因
A C

B D

AB CD

二、原核基因工程下游技术
（一）、不同定位表达的蛋白具有不同的纯化路线
1、胞内可溶表达
离心收菌（溶菌酶、核酸酶） 超声破碎 离心收上清 过滤（0.45μm-0.22μm） 柱层析
2、用质空间分泌表达
收菌ddH2OOsmotic shock 离心收集上清 过滤（0.45μm-0.22μm） 柱层析
3包涵体表达
离心收菌（溶菌酶、核酸酶） 超声破碎 离心收沉淀（包涵体）
包涵体洗涤 变性（Gu.HCl、Urea等） 复性（稀释、透析等） 离心收集上清 过滤（0.22μm） 柱层析
（二）、利用各种蛋白不同性质进行纯化
INF——耐酸
Trx——耐热
Taq——耐热
（三）、层析的种类和填料的选择
（1） 离子交换、疏水层析、分子筛层析、亲和层析和反相层析
（2） 填料：
三个公司产品：Pharmacia Biotech
Millipore
Toso Haas
常用填料：
凝胶过滤Superdex30、75和200系列分别适用于小蛋白、重组蛋白和大蛋白。
Matrex Cellufine GH-25蛋白的快速脱盐和换液
离子交换：
阴离子交换
Q Sepharose DEAE Sepharose Source15Q
阳离子交换
SP Sepharose CM Sepharose Source15S
疏水层析
Pheny Sepharose 6 F.F(High sub)
Pheny Sepharose 6 F.F(Low sub)
Octyl Sepharose 4 F.F
Butyl Sepharose 4 F.F
Source 15PHE. ISO. ETH

Toyoperal Pheny1-650M
Toyoperal Butyl –650M
Toyoperal Ether-650M
亲和层析：
Chelating Sepharose F.F(6His-tag)
Glutathione Sepharose 4B(GST-tag)
Amylose(MBP-tag)
反相层析：一般选用预装小柱用于分析和多肽制备
层析纯化的不同阶段选用不同的填料
（1） 粗纯：流速快、载量大Sepharose F.F系列和Sepharose X L系列。
（2） 精纯：分辨率高Sepharose H P、Source系列、Superdex系列。
利用Hi Trap系列柱进行快速摸索纯化条件
Pharmacia Hi Trap柱
建议选5ml系列
Hi Trap Q X L Hi Trap Q FF
Hi TrapS P X L Hi Trap S P FF
Hi TrapS P H P Hi TrapDEAE FF
Hi TrapQ HP Hi TrapCM FF
Hi TrapANX FF

Hi Trap Phenyl FF (High sub)
Hi Trap Phenyl F.F(Low sub)
Hi Trap Phenyl HP
Hi Trap Butyl F.F
Hi Trap Octyl F.F

RESOURCE HIC Test Kit

Hi Trap Chelating Sepharose FF
（四）、除去大肠杆菌来源重组蛋白的热原
HIC
Superdex
Q-Sepharose
Buffer超滤
Prosep-Remtox除热原介质

（五）、如何优化下游纯化工艺
1、缓冲液和柱层析能相互结合，避免多次交换缓冲液
2、尽量选用不同性质的柱层析来纯化, 如离子交换、亲和层析、疏水层析和分子筛的组合
3、同一工艺中也可使用两次性质相同但分辨率不同的层析,如Q-Sepharose F F SourceQ
4、蛋白的纯度、活性和均一性
5、合理地组合各个操作单元
（六）、包涵体的下游工艺
1、 包涵体形成及其优缺点

蛋白质合成 折叠
新生的多肽链 活性蛋白
（零级反应） （一级反应）
聚集（二级反应）
聚集
形成包涵体
胞内还原环境、缺少折叠酶和分子伴侣、宿主排斥等因素。
有利：固体易于分离、抵御蛋白酶、对宿主毒性的封闭
2、 包涵体蛋白的分离、溶解（变性）和复性
高密度——离心得到
包涵体洗涤TritonX-100、脱氧胆酸盐 、berol185、低浓度尿素、低浓度盐酸胍、碱、TE等。
包涵体的溶解（变性）：Gu.HCl(6-8M)
Urea(6-8M)
膜蛋白（SDS、Tween-20、TritonX-100）
DTT、β-ME、EDTA。
包涵体蛋白的复性：稀释、透析相结合
二硫键形成：从还原环境到氧化环境
空气氧化 （Cu2+）
氧化交换系统GSH/GSSG Cysteamine/Cystamine等
还原型：氧化型=10：1—5：1
3、提高复性率和正确率的策略
（1） 稀释或透析复性
低温—减少聚集
升温—中间体快速折叠
（2） 通过小分子添加剂促进复性
0.5M-0.2M L-Arg
NDSBS(Non-detergent surlphobetains)
0.1%berol 185
glycerol，环状糊精
（3） 分子伴侣或折叠酶促进复性
Gro EL、DsbA、DsbC—固定到介质
（4） 通过形成融合蛋白促进复性
工艺举例：
（一）包涵体重组hGM-CSF
pEThGM-CSF（转化）——E.coli BL21(DE3)pLysS（37OC诱导表达）——发酵（20L）——离心收菌（溶菌酶、核酸酶）——超声破碎——离心取沉淀包涵体——TE洗涤——0.1%berol185洗涤——0.5M Urea洗涤——TE洗涤——8M GuHCl、100mMβ-ME、TE(PH8.0)溶解室温2-3hr——离心取上清——10倍体积复性液20mM、TE、GSH:GSSG=1mM:0.1mM、200mM L-Arg、0.1%berol185——静置对PH8.0TE透近4-8OC——换透析液20OC 2hrs——离心取复性上清——加硫酸铵——Phenyl Sepharose FF(High sub)HIC柱层析（去核酸、热原、协助复性、分离异构体和杂蛋白）——Q-Sepharose HP阴离子交换（去掉杂质）——Supdex75分子筛（去掉二聚体）（PBS）——半成品150mg
（二）、胞内可溶性融合蛋白GST-TEV-6Histag
pLPP-GST-TEV-6Histag（转化）——E.coli TOP10Fˊ(30OC诱导表达3hrs)——发酵（10L）——离心收菌（溶菌酶、核酸酶）超声破碎——离心上清——过滤——Chelating Sepharose FF柱层析（咪唑）——GST亲和层析（GSH）——Matrex Cellufine GH-25(100mMTris、2mMEDTA、10mMDTT、PH8.0)——添加50%甘油（-20OC保存）
200mg终产品，SDS-PAGE银染一条带。纯化总时间3hrs。
（三）、周质空间分泌蛋白MBP-INFconalfa
pLPPMBP INFcon alfa(转化)——E.coli TOP10Fˊ（23OC诱导表达5hrs）——10L发酵——离心收菌（20%Sucrose）——离心收菌(ddH2O)——Osmotic Shock——离心收集上清——过滤——Q-Sepharose FF 柱层析梯度洗脱（SDS-PAGE分析）——amylose亲和层析——Superdex200分子筛层析——MBP-INFcon alfa 比活性1×1010u/mg，SDS-PAGE银染一条带，高度稳定30mg。

Codon Usage for Enteric Bacterial Highly Expressed Genes
aa Codon Nrmber1 /10002 Fraction3 aa Codon Nrmber1 /10002 Fraction3
Gly GGG 13 1.89 0.02 Trp UGG 55 7.98 1.00
Gly GGA 3 0.44 0.00 stop UGA 0 0.00 (stop)
Gly GGU 365 52.99 0.59 Cys UGU 22 3.19 0.49
Gly GGC 238 34.55 0.38 Cys UGC 23 3.34 0.51
Glu GAG 108 15.68 0.22 stop UAG 0 0.00 (stop)
Glu GAA 394 57.20 0.78 stop UAA 0 0.00 (stop)
Asp GAU 149 21.63 0.33 Tyr UAU 51 7.40 0.25
Asp GAC 298 43.26 0.67 Tyr UAC 157 22.79 0.75
Val GUG 93 13.50 0.16 Leu UUG 18 2.61 0.03
Val GUA 146 21.20 0.26 Leu UUA 12 1.74 0.02
Val GUU 289 43.26 0.51 Phe UUU 51 7.40 0.42
Val GUC 38 5.52 0.07 Phe UUC 166 24.10 0.76
Ala GCG 161 23.37 0.26 Ser UCG 14 2.03 0.04
Ala GCA 173 25.12 0.28 Ser UCA 7 1.02 0.02
Ala GCU 212 30.78 0.35 Ser UCU 120 17.42 0.34
Ala GCC 62 9.00 0.10 Ser UCC 131 19.02 0.37
Arg AGG 1 0.15 0.00 Arg CGG 1 0.15 0.00
Arg AGA 0 0.00 0.00 Arg CGA 2 0.29 0.01
Ser AGU 9 1.31 0.03 Arg CGU 290 42.10 0.74
Ser AGC 71 10.31 0.20 Arg CGC 96 13.94 0.25
Lys AAG 111 16.11 0.26 Gln CAG 233 33.83 0.86
Lys AAA 320 46.46 0.74 Gln CAA 37 5.37 0.14
Asn AAU 19 2.76 0.06 His CAU 18 2.61 0.17
Asn AAC 274 39.78 0.94 His CAC 85 12.34 0.83
Met AUG 170 24.68 1.00 Leu CUG 480 69.69 0.83
lle AUA 1 0.15 0.00 Leu CUA 2 0.29 0.00
lle AUU 70 10.16 0.17 Leu CUU 25 3.63 0.04
lle AUC 345 50.09 0.83 Leu CUC 38 5.52 0.07
Thr ACG 25 3.36 0.07 Pro CCG 190 27.58 0.77
Thr ACA 14 2.03 0.04 Pro CCA 36 5.23 0.15
Thr ACU 130 18.87 0.35 Pro CCU 19 2.76 0.08
Thr ACG 206 29.91 0.55 Pro CCC 1 0.15 0.00