生物学层析法.pptx

层析分离分类（1）n按溶质分子与固定相相互作用机理n吸附层析（范德华力，氢键，静电力，共价力）n分配层析（溶质在两液相间分配系数不同）n凝胶过滤（分子大小与形状）n实验技术分类n低压（小于0.5 Mpa)n中压(0.5-5 Mpa)n高压(5-40 Mpa)n电泳(溶质在电场中移动）层析分离分类（2）n根据固定相形状分类n柱层析n纸层析n薄层层析n根据流动相分类n气相层析n液相层析n超临界流体层析n按操作方式分类n迎头法（frontal analysis)n顶替法（displacement analysis)n洗脱分析（elution analysis)基本概念基本概念（1）分配系数）分配系数 溶质在固定相与流动相浓度比值（2）解离常数）解离常数 吸附质浓度与吸附剂浓度乘积与吸 附复合物浓度比值（3）分离因素）分离因素某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数(4)阻滞因子阻滞因子分配层析溶质移动速度与理想流动 相移动速度（距离）比值(5)溶出体积溶出体积在柱色层分离中，使溶质从柱中流 出时所通过的流动相体积(6)分辨率分辨率两峰之间的距离与两峰宽的平均什之比(7)理论塔板理论塔板流动相与固定相平均浓度达传质平衡 时的一段柱高（8）溶量因子）溶量因子固定相中溶质总量与流动相中溶质总之比 分配系数n Kd=C1/C1nK d为分配系数nC1，C2为两液相中的溶质浓度。n应用条件：温度一定n 低浓度分离度 Rf=洗脱容积理论塔板r n E/(E+1)时 r max n E/(E+1)最大浓度塔板r max n E/(E+1)思考题n1 想解概念：解离常数，分离因素，阻滞因子，理论塔板高度，洗胶体积，分辨率n2 不同的层析分类方法各有何意义？层析分离法（第二讲）层析介质n要求：n（1）不溶于流动相n（2）化学稳定n（3）机械强度n（4）大的表面积n（5）粒度均匀n层析介质种类n无机（氧化铝，硅胶，活性碳）有机（琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺）常用层析介质氧化铝：（活性氧化铝）它是一种多孔性、高分散度固体n（1）有很大的比表面积，其微孔表面具有吸附性能。n（2）分子式AI2O3简单，空间形态复杂，8种以上的形态n（3）同一形态宏观结构性质如密度、孔隙率、孔径 分布、比表 面积等存在差异 （4）吸附量与含水量关系很大制备：由氢氧化铝加热脱水得到的。吸附基团：铝离子种类：n碱性：由氢氧化铝高温脱水，用于碱性稳定的溶质n酸性：碱性氧化铝经盐酸洗涤，用于在酸性稳定的溶质n中性：碱性氧化铝经水洗后活化制得应用：有机溶剂中分离天然成分硅胶n硅胶是由多聚硅酸经分子间脱水而形成的一种多孔性物质n（1）化学组成 SiO2.XH20，n（2）属于无定形结构，基本结构质点为Si一O四面体，相互堆 积形成硅胶的骨架。质点间的空间即为硅胶的孔隙。n（3）硅胶中的水以羟基的形式和硅原子相连而覆盖于硅胶表面。n硅胶的分类（常以孔径大小来分），n(1)特细孔硅胶(0.8nm以下)。(2)细孔硅胶（1.52.0nm)n(3)中孔硅胶 (4.0一5.0nm)n(4)粗孔硅胶 (10.nm以上)n应用：吸附层析剂与分配层析剂 优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物，用于天然产物分离，可用在水溶液中或有机溶剂中琼脂糖n由海洋生物琼脂提取得到的主要成分 n（1）中性不带电n（2）水溶性线状多糖n（3）高亲水性，含大量羟基n（4）能制成多孔性凝胶，分离大分子n制备：n（1）去除带电琼胶成分n（2）将溶化的琼脂糖采用悬浮,乳化或喷珠的方法制 得珠状介质。n（3）采用交联剂增加介质的机械强度 琼脂糖的基本结构单位和亲水性凝胶结构a 琼脂糖结构 b 亲水性凝胶结构 琼脂糖（2）n介质商品种类nSepharose 2B,nSepharose 4B,nSepharose 6B。n 经过交联而增加机械强度的琼脂糖nSepharose CL-2B,nSepharose CL-4B,nSepharose CL-6B n应用 水溶液中分离蛋白质葡聚糖 n-1,6 相连的葡萄糖聚合物，由环氧氯丙烷交联得到珠粒n性质：n（1）亲水性比琼脂糖高（羟基数多）n（2）化学稳定性及热稳定性好n（3）孔度与机械强度与交联度有关n（4）用于凝胶过滤分子筛n应用：水溶液中分离蛋白质等纤维素n-1,4 相连的D-葡萄糖（偶而有1，6 键合）线性天然高聚物n（1）亲水n（2）微晶与无定型两部分组成，缺乏孔度n大孔珠状纤维素n（1）高孔度n（2）高机械强度n（3)亲水性强 n应用：离子交换分离蛋白质介质聚丙烯酰胺性质：（1）丙烯酰胺与交联剂N,N-甲叉双丙烯酰 胺共聚n（2）烷烃骨架与酰胺侧链n（3）控制交联剂比例可控制网格孔度n（4）亲水好，但不如多糖介质n (5)机械强度差应用：（1）凝胶过滤n （2）电泳介质亲和层析亲和层析 n亲和层析(Affinity Chromatography)是利用生物体内存在的特异性相互作用的分子对而设计的层析方法。n生物体内相互作用的分子对：n(1)酶底物或抑制剂n(2)抗原抗体。n(3)激素受体。n(4)糖蛋白与凝集素,n(5)生物素生物素结合蛋白等 基质活化方法与配基偶联基质活化方法与配基偶联 n活化(activation):基质（matrix）上的化学基团是不活泼的,无法与配基直接偶联,通过化学反应使介质上化学基团处于活化状态。n(1)大分子配基如蛋白质等可与活化基质直接偶联。n(2)小分子配基,在基质与配基之间插入若干碳原子手臂(spacer),然后再与配基偶联。n(3)环氧氯丙烷,1,4丁二醇缩水甘油醚本身是活化剂亦具有手臂作用。活化方法（1）nA溴化氰法溴化氰法n溴化氰在碱性条件下与多糖上的羟基反应导入氰酯键或亚氨碳酸酯到基质上,进而与配基偶联n优点优点:（1）适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质（2）用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶联（3）操作步骤简单,重现性好。（4）偶联条件温和,特别适用于偶联敏感性生物大分子。n缺点：缺点：（1）形成的异脲键易产生非特异性吸附,（2）共价键不稳定,配基容易脱落,（3）活化操作危险性大，反应后的残余液需经处理再排放 溴化氰活化与配基偶联化学反应式 活化方法（2）nB环氧氯丙烷活化环氧氯丙烷活化 n（1）所形成的共价键稳定,配基不易落脱n（2）自动引入手臂,n（3）有更小的非特异性吸附,n（4）活化操作简单易行,危险性相对较小n缺点：在强碱性条件反应，不适用于碱敏感物质。环氧氯丙烷活化反应式 环氧基的氨化及偶联配基反应 思考题n1 常用的层析介质有哪些？各适用于何种状况下的分离？n2 亲和层析的机理是什么？层析法（第三讲）活化方法（3）nC对甲苯磺酰氯活化对甲苯磺酰氯活化 n（1）用于活化含羟基基质,将羟基转化为磺酰 基,在配基偶联后容易脱落,不引入电荷。n（2）配基与羟基间形成稳定化学键。n（3）活化操作需在无水丙酮环境中进行。偶联 配基根据情况,既可在有机相中进行,亦可在水相中进行对甲苯磺酰氯活化反应式手臂（spacer)n作用：减少亲和作用空间位阻n 连接：通过化学反应与活化基团连接n手臂化合物：乙二胺 NH2-CH2-CH2-NH2n已二胺 NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2n6-氨基已酸NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOHn环氧氯丙烷 n1，4-丁二醇缩水甘油醚D残余电荷的掩蔽残余电荷的掩蔽目的：防止产生非特异性吸附原理：通过化学反应消除基团上的电荷方法：（1）自发水解（2）氨基：醋酸酐（3）羧基：水溶性碳二亚胺手臂氨末端的掩蔽 残留羧基掩蔽反应 E活化基团与配基密度测定活化基团与配基密度测定n方法：n（1）氨基或羧基可用酸碱滴定。n（2）有紫外吸收特征的,可用紫外分光法测定。n（3）通过测定反应余液中配基残留量推算（偶 联率较高的情况）n（4）某些情况下需将亲和胶样品分解破坏测定F亲和介质吸附容量测定亲和介质吸附容量测定 方法：（1）流出曲线法：流出液中目标蛋白浓度达到进 口浓度的90%（2）Langmiur 吸附等温线法 层析装置与操作n装置 1 普通 2 高级n柱操作n（1）装柱：均匀，无气泡n（2）平衡（equilibrium)：缓冲液,pH,盐浓度n（3）上样(loading)：蛋白浓度，pH,盐浓度，缓冲液n（4）洗涤(washing)：pH,盐浓度，洗涤剂，缓冲液n（5）洗脱(elution)：条件与吸附相反n（6）清洗(cleaning)：弱酸，弱碱，蛋白质变性剂（尿 素，盐酸胍，硫氰酸盐n（7）再生：与平衡条件相同柱层析分离法的有关装置 Pharmacia KTA 层析系统层析系统 装置n泵n混合器n层析柱n检测器n记录仪n分部收集器装柱n调糊：50%n一次连续加入悬胶液n打开出口阀：层析剂沉降n排除空气n检查均匀度上样n样品处理：n(1）溶解nA 调整浓度nB 盐nC pH n(2)过滤：除去不溶物n流速：根据样品浓度与吸附速度而定n上样量：80%吸附容量淋洗n盐浓度npH n表面活性剂（0.1-0.5%)n淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定n防止产物丢失又要除去杂质洗脱方法n按操作方式na 恒定洗脱(isocraticelution)nb 分步洗脱(stageelution)c 梯度洗脱(gradientelution)按洗脱机理专一性洗脱（specificelution）非专一性洗脱（nonspecificelution）添加剂：乙二醇,NaCNS、脲素、盐酸胍 洗脱体积：5倍床体积怛定洗脱 分步洗脱 (c)梯度洗脱清洗与再生n弱酸：HACn碱：氨水n促溶剂：1-3M KCNS，6-8 M 尿素，6 M盐酸胍n极性溶剂：20%乙醇n表面活性剂：吐温-80n缓冲液平衡思考题n1 配基偶联后残留电荷对分离有何影响？如何消除？n2 小分子配基为何需插入手臂？n3 层析柱洗脱方式有几种？各适用于何种情况？层析分离法（第四讲）无机吸附剂n羟基磷辚石(hydroxyapatite,Ca10(PO4)6(OH)2)n（1）纯化蛋白质的无机介质。n（2）廉价，易于大规模应用，n（3）使用后易于清洁 n吸附机理与规律：偶极离子作用而不是离子交换作用n(1)每一个正电荷区周围都有负电荷区，反之亦然.（2）蛋白质在中性pH范围具有最大的形成毗邻正负离子的可能性。工艺条件n吸附：n(1)pH在69之间（2）低浓度缓冲液离子（通常是磷酸盐）（3）低盐浓度 洗脱：（1）增加缓冲液浓度（2）高盐浓度中进行（3）盐可以采 用恒定或梯度形式应用。(1)光合作用中重要的辅助色素n(2)可作为荧光探针n(3)天然色素n(4)调节和激活免疫反应n吸附：1mm,PH 6.8磷酸缓冲液(I.8cm4cm)层析柱n上样量:2mLn洗脱：磷酸盐缓冲液1、5、50、l00、200mm，PH 6.8，+0.1M NaCl溶液n洗脱速度:18mL/hn分步收集洗脱液(每管约4mL)疏水层析n 将疏水性基团如丁烷、辛烷、苯固定化到介质上,这些基团会与蛋白质生物大分子上的疏水区亲和 n介质制备：琼脂糖在有机溶剂中用CDI(羰基二咪唑)活化后再与芳胺或烷胺形成酰胺键得到疏水层析介质 n介质配基密度:4080mol/ml胶,n吸附容量：牛血清蛋白(BSA)大于40mg/ml疏水层析介质制备过程示意图 工艺条件n吸附：n(1)盐浓度：高盐，12M(NH4)2SO4 或NaCln(2)pH:中性或偏酸性n淋洗：0.52%表面活性剂n洗脱:n(1)低盐，0.10.5M NaCl,再配合pH变化。n(2)低浓度促溶剂,0.10.5%NaSCN,或2040%乙二醇n疏水层析实验方案：固定化金属离子亲和层析固定化金属离子亲和层析（ImmobilizedMetalIonAffinityChromatography）n亚氨二醋酸盐与环氧活化的琼脂糖偶合,可以形成一种带有双羧甲基氨基琼脂糖,进而与过渡金属离子(Cu2+,Zn2+Ni2+)牢固螯合,形成稳定的吸附活性中心 n吸附机理：金属螯合介质能与蛋白质中的组氨酸上的咪唑基及半胱氨酸上的巯基结合 工艺条件n吸附：n(1)pH 中性n(2)低盐n(3)金属离子n洗脱：n(1)降低pHn(2)提高盐浓度n(3)缓冲液中加入螯合剂EDTA n基因蛋白质的组氨酸插入n吸附：Ni2+亲和 npH:7.5 n洗脱：7.5-4.0 梯度共价层析n共价层析是根据巯基化合物与层析剂上二硫键的共价化学反应而设计的 谷胱甘肽型二硫键层析剂与巯丙基型二硫键层析剂(a)谷胱甘肽二硫键层析剂 （b）巯丙基型二二硫键层析剂靠巯基二硫键作用的共价层析分离过程吸附过程 （b）洗脱过程 （c）再生过程 苯基硼酸盐与1，2顺二元醇化合物的反应层析分离（第五讲）谷胱甘肽巯基转移酶（GST）共价层析n（1）将GST基因结合到目标蛋白基因上制成 表达融合蛋白n（2）用谷胱甘肽亲和介质吸附GST目标蛋白n（3）用酶切除GST，得到纯化目标蛋白苯硼酸共价层析n利用硼原子与邻二羟基结构的糖形成共价五元环结构n吸附：n（1）pH 8-9 n（2）高盐促进苯基吸附n洗脱：npH 3-4,nTris 缓冲液，甘露醇n应用：糖蛋白，核苷酸，多糖苯基硼酸盐与1，2顺二元醇化合物的反应蛋白质的离子交换层析n层析介质：DEAE-纤维素，CM-纤维素n吸附条件：n (1)缓冲液pHn (2)蛋白浓度控制（5mg/ml)n（3）离子强度n (4)道南效应(Donnan effect)介质内外盐浓度及 pH 不同 (5)上样量：1-5%BV，高径比20:1,L：100cm(恒定洗胶）；5-10%qm,柱长度20-40cm,高径比5：1（分步或梯度）洗脱：恒定，分步，梯度pH 梯度：a 缓冲量大；b 离子强度变化；c pH 变化大 染料亲和层析n活性染料常有蒽醌或萘衍生物,含有一个或多个氨基或磺酸基。其结构类似某些酶的底物（NAD 中ADP核酸的结构类似物）n特点:n(1)蛋白结合容量大,是天然配基的10100倍n(2)廉价易得。n(3)具有普遍适用性。n(4)配基的偶联方法简单,易于操作,可大规模应用。n(5)染料的光谱特征可用来检测柱中染料浓度。n(6)蛋白质洗脱容易，n(7)染料配基在使用中有可能水解从基质上脱落而残留 到产品中。机理n（1）NAD 中ADP核酸的结构类似物n（2）离子交换（磺酸基，氨基）n（3）疏水作用（芳香基团）n（4）金属离子，染料和蛋白质之间形成三元 络合物工艺条件n吸附：n（1）低的PH时结合更为牢固n（2）配体浓度 调整染料配体的浓度可以改变纯化因子n洗脱 n（1）洗脱方式：可用脉冲、分段、梯度n（2）洗脱剂的选择：磷酸盐、辅酶和核苷酸、底物、多元醇、表面活性剂及pH等应用n染料的选择 nCibacron B1ue F3GA(CB)染料可用来纯化NAD依赖的脱氢酶:na核苷酸依赖的脱氢酶，nb各种激酶，包括水解酶，乙酰基转移酶，磷酸水解转移酶，RNA和DNA核酸酶和限制性核酸内切酶等，nc肌球蛋白，各种血蛋白及干扰素等nProcion Red HE3B，适于纯化对NADP依赖的脱氢酶则更有亲和性n吸附n20mM,PH 7.0 磷酸缓冲液n洗脱：含盐缓冲液、n洗脱液进一步用凝胶层析n回收率45%凝胶层析法（凝胶层析法（GelFiltrationChromatography）n又称凝胶排阻层析,分子筛层析法,凝胶过滤法等。是根据溶质分子的大小进行分离的方法 n特点：n（1）操作方便,不会使物质变性。n（2）层析介质不需再生,可反复便用n（3）容量比较低n（4）一般在最后的处理中被使用。n原理：不同大小分子在多孔凝胶中阻滞力不同葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶(Sephadex)的理化性质的理化性质 n(1)排阻极限(exclusion limit)是指不能扩散到凝胶基质内部中去的最小分子的分子量 n(2)分级范围(Fractionation range)它指出了当溶液通过凝胶柱时,能够为介质阻滞并且分离的溶质分子量范围(Sephadex G50,它的分级范围为150030000)n(3)吸水量(Water regains)1g干凝胶所吸收的水分称为吸水量G-50的吸水量为5.00.3g n(4)凝胶粒径 凝胶颗粒一般为球形 100-200目(50-150m)n(5)床体积(Bed volume)表示1g干胶在溶胀后所具有的最后体积(Sephadex G-50的床体积为911ml/g 干凝胶)n(6)空隙体积(Void volume)表示填充柱中凝胶粒子周围的总空间(蓝色葡聚糖测出)凝胶层析操作凝胶层析操作 nA凝胶选择：凝胶选择：n 选型：脱盐：G-10,G-15,G25，分级：G-50，G-100，G-150n 粒度：分粗(相当于50目),中(100目),细(200目),极细(300目)四种粗,中用于生产上层析,细者用于科研 n溶胀:干燥凝胶加水或缓冲液在烧杯浸泡吸水,静置，筛选。nB装柱装柱n(1)柱长选择：细长柱，脱盐：柱高50cm；分级:100cm。n(2)装柱:n均匀性:a 蓝色葡聚糖T2000溶液过柱，观察色带均匀下降。a对光检查nC加样加样 n(1)除去不溶物n(2)样品浓度：浓度大些为好n(3)上样体积：分析1-2%床体积;制备20-30%n(4)样品自然流进凝胶后，加洗脱液，防止返混nD洗脱洗脱 n(1)洗脱液：洗脱液成份应与膨胀胶所用的液体相同n(2)操作压：Sephadex G-100，2.49.4kPa,而G200凝胶则为0.40.6kPa。n(3)洗脱液分步收集 nE凝胶再生和保养凝胶再生和保养n(1)多次使用后后重新填装。n(2)短期不用,加0.02%叠氮化钠(NaN3)n(3)长期不用,酒精浸泡脱水需然后6080烘干。n(4)离子交换葡聚糖凝胶：阴离子凝胶0.5mol/L HCl 溶液 水洗 0.5mol/L NaOH 水洗。阳离子凝胶处理次序相反。应用n（1）脱盐n（2）分级分离n（3）分子量测定nlgMW与Ve 成线性关系思考题n1 苯硼酸亲和介质用于分离哪些目标物？原理是什么?n2 道南效应对离子交换树脂产生怎样的影响?n3 凝胶层析分离机理是什么?n4 染料亲和层析的分子机制是什么?电泳电泳(electrophoresis)n特点：特点：n（1）分辩率高）分辩率高n（2）电场作用）电场作用n（3）多用于分析）多用于分析n双电层的形成双电层的形成电泳与电渗电泳与电渗n电电渗渗（electroosmosis）:在在电电场场作作用用下下，液液体体n对毛细管表面电荷作相对运动。对毛细管表面电荷作相对运动。n电泳电泳(electrophoresis):在电场作用下，带电在电场作用下，带电颗粒在溶液中的运动。颗粒在溶液中的运动。电渗示意图离子在毛细管周围的分布运动电泳理论基础电泳理论基础n迁移率迁移率：单位电场强度下，粒子的泳动速度：单位电场强度下，粒子的泳动速度n影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素n(1)颗粒性质颗粒性质n(2)电场强度电场强度n(3)溶液的性质溶液的性质na溶溶液液的的pHb离离子子强强度度(0.05-0.1M)c溶溶液液的的粘度粘度n(4)焦耳效应焦耳效应n(5)电渗电渗区带电泳时影响离子迁移率的因素凝胶电泳凝胶电泳n利利用用分分子子筛筛作作用用使使分分子子大大小小不不同同的的电电解质得到分离。解质得到分离。n凝胶电泳与凝胶过滤的区别：凝胶电泳：样品中各分子的运动速度是小分子快于大分子 凝胶过滤：大分子运动快于小分子(凝胶电泳中,系统里没有空隙体积,只有网状骨架。大分子物质不及小分子物质容易移动。不连续电泳不连续电泳原理示意操作操作n(1)配制试剂配制试剂n(2)制胶制胶n(3)聚合聚合n(4)样品处理样品处理n(5)电泳电泳n(6)染色染色n(7)脱色脱色n(8)扫描扫描n(9)保存保存十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳泳 SDSPAGE n原理：利用十二烷基硫酸钠(SDS)和二硫苏糖醇（DTT）或巯基乙醇使蛋白质解体成为多肽带上大量负电荷，粒子在电场中运动只与分子大小有关 n大多数蛋白质在SDS浓度大于1mM时,以1.4克SDS/克蛋白质的比例结合n应用：用于分析测量生物大分子分子量 等等 电电 点点 聚聚 焦焦（Isoelectricfocusing,IEF）n1原原理理：利利用用蛋蛋白白质质和和氨氨基基酸酸等等两两性性电电解解质质具具有有等等电电点点，在在等等电电点点的的pH下下呈呈电电中中性性，不不发发生生泳动的特点进行电泳分离。泳动的特点进行电泳分离。n2特点特点(1)消除分子扩散引起的分离率度下降消除分子扩散引起的分离率度下降(2)两性电解质污染产品两性电解质污染产品(3)pH梯度不稳定梯度不稳定(4)操作中易脱水起皱操作中易脱水起皱等电聚焦电泳双双 向向 电电 泳泳（Two dimensionalelectrophoresis）n1等电点聚焦等电点聚焦n2凝脱电泳凝脱电泳毛毛 细细 管管 电电 泳泳（Capillaryelectrophoresis）n内径：内径：15200m,长度长度100cm，壁厚，壁厚200mn特点：特点：n(1)毛毛细细管管电电泳泳管管道道微微细细，抑抑制制混混合合，分分离离精精度高度高n(2)毛细管的比表面积大，易冷却毛细管的比表面积大，易冷却n(3)速度快速度快(分钟分钟)n(4)样品量小样品量小(nl)思考题：思考题：n1理解概念：电泳迁移率，电渗，电泳，理解概念：电泳迁移率，电渗，电泳，nSDS-PAGE，双向电泳，等电聚焦。双向电泳，等电聚焦。n毛细管电泳。毛细管电泳。n2不连续电泳与连续电泳有何区别？不连续电泳与连续电泳有何区别？n3十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDS）在）在SDS-聚丙烯聚丙烯n酰胺电泳中起什么作用？酰胺电泳中起什么作用？