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槐米中芸香苷（芦丁）的提取与鉴定
时间：2010-02-06 12:57:37 来源： 作者： 
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摘要： 芸香苷结构中含有酚羟基,具酸性,能溶于碱水,当加入酸溶液后,则芸香苷沉淀析出.芸香苷的精制是利用其可溶于热水,难溶于冷水的性质与杂质分离.

【实验目的】
1、学会运用碱溶酸沉法,从槐米中提取、精制芦丁,并进行水解.
2、学会用显色反应及纸色谱法检识黄酮类化合物.

【实验原理】
    采用碱溶酸沉法提取,其原理是芸香苷结构中含有酚羟基,具酸性,能溶于碱水,当加入酸溶液后,则芸香苷沉淀析出.芸香苷的精制是利用其可溶于热水,难溶于冷水的性质与杂质分离.

【实验材料】
    设备:电炉、托盘天平、500 ml烧杯、量筒、玻璃棒、移液管、纱布、温度计、滴管、抽滤装置、研钵、250 ml圆底烧瓶、冷凝管、水浴锅、pH试纸、新华色谱滤纸、紫外灯、展开筒、试管、试管架.
    药品:槐米粗粉、浓盐酸、蒸馏水、0.4%硼砂、石灰乳、2%硫酸、95%乙醇、氢氧化钡、葡萄糖标准品水溶液、鼠李糖标准品水溶液、正丁醇、醋酸、芦丁标准品、槲皮素标准品、氨水、三氯化铝、浓硫酸、α–萘酚、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、镁粉、苯胺-邻苯二甲酸、醋酸镁

【实验步骤】
1、芸香苷的提取:
    称取槐米粗粉20g,置500 ml烧杯中,加入0.4%硼砂沸水溶液200 ml,在搅拌下加石灰乳,调至pH8～9,加热微沸20分钟(注意保持pH8～9),并随时补充蒸发掉的水分,趁热用四层纱布滤过.滤渣同样操作再提取一次,合并两次滤液.滤液在60℃～70℃用浓盐酸调至pH5左右,静置过夜使沉淀完全,抽滤,沉淀用蒸馏水洗2～3次至中性,抽干,置空气中晾干,得芸香苷粗品.
2、芸香苷的精制:
    称一定重量的粗品,按约1∶200的比例悬浮于蒸馏水中,煮沸10分钟使其全部溶解,趁热抽滤,冷却滤液,静置析晶.抽滤,置空气中晾干或60℃～70℃干燥,得精制芸香苷,称重,计算得率.
3、芸香苷的水解:
    取芸香苷1g,研细后置于250 ml圆底烧瓶中,加入2%硫酸溶液100 ml,直火微沸回流约40分钟,至析出鲜黄色沉淀不再增加为止,放冷抽滤,滤液保留作糖检查,沉淀用少量水洗去酸,抽干水分,晾干称重,得粗制槲皮素,然后用乙醇(95%乙醇约15 ml)重结晶即得精制槲皮素.
4、鉴定:
  (1)糖的纸色谱鉴定:
    样品:取上述滤去槲皮素的水解母液20ml,搅拌加饱和的氢氧化钡水溶液中和至pH7,滤去沉淀,滤液浓缩至1～2ml得样品液
    对照品:葡萄糖标准品水溶液、鼠李糖标准品水溶液
    支持剂:新华色谱滤纸(中速15cm×7cm)
    展开剂:正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)上层液
    显色剂:苯胺-邻苯二甲酸试剂喷雾,105℃烘10分钟,显棕色或棕红色斑点
  (2)芸香苷、槲皮素的纸色谱鉴定:
    样品:1)自制芸香苷乙醇液
         2)自制槲皮素乙醇液体
    对照品:1)芸香苷标准品乙醇液
           2)槲皮素标准品乙醇液
展开剂:1)正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)上层液
           2)15%醋酸水溶液
    显色剂:1)先在可见光下观察斑点颜色,然后在紫外灯下观察斑点颜色
           2)经氨气熏后再观察
           3)喷三氯化铝试剂后再观察
  (3)Molish反应:
    取芸香苷少许置小试管中,加乙醇0.5 ml,加10%α萘酚溶液1 ml振摇使溶解,沿管壁徐徐加入浓硫酸约0.5 ml,静置.观察两层溶液的界面变化,出现紫色环者为阳性.以同法试验槲皮素,比较二者的不同.
  (4)酸性实验:
    取小试管四支为一组,共二组,第一组每管中加入芸香苷1mg,第二组每试管中加入槲皮素1mg,每组分别加稀氨水、5%碳酸氢钠溶液、5%碳酸钠溶液和1%氢氧化钠溶液各2ml,振摇后,观察各管溶解情况,溶解的溶液应呈黄色.再加盐酸数滴,黄色应褪去或变浅,并有沉淀或浑浊析出.
  (5)镁粉-盐酸反应:
    取芸香苷1mg,加乙醇1～2 ml在水浴上加热溶解,加镁粉约50mg,滴加几滴浓盐酸,溶液由黄色渐变红色者,表示有黄酮类化合物.以同法试验槲皮素.
  (6)三氯化铝反应:
    取芸香苷1mg,加甲醇1～2 ml在水浴上加热溶解,加入1%三氯化铝甲醇溶液2～3滴,呈鲜黄色,以同法试验槲皮素.
  (7)醋酸镁反应:
    取芸香苷1mg,加甲醇1～2 ml水浴中加热溶解,加1%醋酸镁甲醇溶液2～3滴,呈黄色荧光反应.以同法试验槲皮素.

【实验说明】
1、硼砂的作用,芸香苷分子中因含有邻二酚羟基,性质不太稳定,暴露在空气中能缓缓氧化变为暗褐色,在碱性条件下更容易被氧化分解.硼酸盐能与邻二酚羟基结合,达到保护的目的.但其价格较高,工业上用较大量的石灰加少量硼砂,同样达到提高质量要求.
2、加入石灰乳,使pH8～9,既可以达到碱溶解芸香苷的目的,又可以除去槐米中含有的大量多糖黏液质.但pH不能过高,碱处理时间尽短,以减少酚类氧化分解.
3、用浓盐酸调pH4～5,pH过低会使芸香苷降低得率.
4、提取时也可以不加碱,直接用沸水提取,得率也比较高.

【实验思考】
1、芸香苷经硫酸溶液水解后得到槲皮素沉淀,试分析其水解母液加饱和的氢氧化钡水溶液的目的是什么？
2、为什么用碱溶酸沉法提取芸香苷【参考文献】
  　　［1］郭丽冰. 芸香苷的提取、分离和鉴定［M］//李嘉蓉.天然药物化学实验.北京：中国医药科技出版社，1998：45.

　　［2］罗集鹏.生药学［M］.北京：中国医药科技出版社，1996：222.

　　［3］张浩义，江泉，金辉，等.微波法提取槐花米中芦丁［J］. 华西药学杂志，2004，19（1）：37.

　　［4］舒晓宏，冯梅，陈华，等.槐花米中芦丁提取最佳pH值的实验研究［J］. 大连医科大学学报，2005，27（2）：91.

时,要注意pH的控制[1】 张宝善，陈锦屏，吴丽．红枣芦丁提取工艺的研究．陕西师
嘲 瓣
范大学学报(自然科学版)，2003，31(1)：89—94
[2】 蔡锦山，于正英．从荞麦中提取 芦丁一vp．生物学杂志，
1999，16(2)：53-55
[3】 张朝燕，等．芦丁提取工艺的研究．基层中药杂志，2002，16
(4)：92-93
[4】 张来新．槐花米中芦丁的提取．山西化工，2002，22(1)：70—
72
[5】 贾冬英，等．苦荞麦茎及籽壳中黄酮类化合物(芦丁)的提
取及其鉴定．食品科学，1998，19(9)：46—47
[6】 胡敏，等．银杏叶中黄酮类化合物最佳提取工艺研究．食
品工业科技，1997，(5)：49—51？