第三章毛细管电泳法.ppt

第三章第三章 毛毛细管管电泳法泳法Capillary Electrophoresis1.n第一第一节 毛毛细管管电泳概述泳概述n第二第二节 毛毛细管管电泳基泳基础理理论n第三第三节 毛毛细管管电泳泳仪n第四第四节 毛毛细管管电泳泳类型型n第五第五节 毛毛细管管电泳的泳的应用和用和进展展2.第一第一节 毛毛细管管电泳概述泳概述n毛毛细管管电泳（泳（CECE），），又称高效毛又称高效毛细管管电泳泳，是近，是近年来年来发展最快的高效分离分析技展最快的高效分离分析技术之一。之一。该技技术是是现代微柱分离技代微柱分离技术和和经典典电泳技泳技术结合的合的产物，物，是气相色是气相色谱(GC)(GC)、高效液相色、高效液相色谱(HPLC)(HPLC)等常用分等常用分离技离技术的重要的重要补充，充，在在诸多研究多研究领域得到了人域得到了人们广泛的接受和广泛的接受和认可。可。3.一、毛细管电泳发展历程n18081808年，俄国物理学家年，俄国物理学家 Pence Pence 发现电泳泳现象。象。n19371937年，瑞典年，瑞典TiseliusTiselius将蛋白将蛋白质混合液放在两段混合液放在两段缓冲溶冲溶液之液之间，两端施以，两端施以电压进行自由溶液行自由溶液电泳，泳，发现样品的品的迁移速度和方向由其迁移速度和方向由其电荷和淌度决定荷和淌度决定,第一次从人血清第一次从人血清提取的蛋白提取的蛋白质混合液中分离出白蛋白和混合液中分离出白蛋白和、球蛋球蛋白，但分离效率低；白，但分离效率低；n19811981年，年，JorgensonJorgenson在在75m75m毛毛细管内施加管内施加300 V/cm300 V/cm的高的高强度度电场，获得了理得了理论塔板数超塔板数超过400,000 plates/m400,000 plates/m的的高分离效率，高分离效率，轰动了整个分离界，成了整个分离界，成为CECE划划时代里程碑代里程碑n19891989年，毛年，毛细管管电泳泳仪问世。世。n19891989年，第一届年，第一届CECE国国际会会议的召开，的召开，标志着一志着一门新的分新的分析技析技术的的产生。生。4.二、毛二、毛细管管电泳的特点泳的特点n(1)(1)高效：每米理高效：每米理论塔扳数低塔扳数低则十几万，高十几万，高则几百万甚几百万甚至上千万；至上千万；n(2)(2)快速：可在十几分快速：可在十几分钟甚至几十秒内完成分离；甚至几十秒内完成分离；n(3)(3)低低样品消耗：只需品消耗：只需纳升甚至皮升升甚至皮升级样品量；品量；n(4)(4)低成本分析：只需低廉的分离毛低成本分析：只需低廉的分离毛细管和少量的运行管和少量的运行缓冲液；冲液；CE是现代微柱分离和经典电泳技术有机结合的产物，具有较HPLC和平板凝胶电泳更多的优点：5.n(5)(5)高度自高度自动化：化：CECE是目前自是目前自动化程度最高的分离分析化程度最高的分离分析方法之一；方法之一；n(6)(6)洁净：通常用水溶性：通常用水溶性缓冲液，冲液，对人体和人体和环境无害；境无害；n(7)(7)多分离模式：可根据需要在同一多分离模式：可根据需要在同一仪器上器上选用不同的用不同的样品分离模式；品分离模式；n(8)(8)应用范用范围广：具有广：具有“万能万能”分析的功能和潜力，既分析的功能和潜力，既可以分析无机离子、氨基酸、可以分析无机离子、氨基酸、药物等小分子，又可以物等小分子，又可以分析蛋白分析蛋白质等生物大分子等生物大分子,甚至整个甚至整个细胞和各种微粒。胞和各种微粒。6.第二节 毛细管电泳基础理论+7.一、一、电泳流泳流n电泳泳：在在电解解质溶液中，位于溶液中，位于电场中的中的带电离子离子在在电场力的作用下，以不同的速度向其所力的作用下，以不同的速度向其所带电荷荷相反的相反的电极方向迁移的极方向迁移的现象。象。n电泳泳时，不同离子在，不同离子在电场中具有不同的定向迁移中具有不同的定向迁移速度，速度，迁移速度与哪些因素有关？迁移速度与哪些因素有关？淌度淌度(）：单位位电场下的下的电泳速度。泳速度。绝对淌度淌度：在无限稀：在无限稀释溶液中溶液中测得的淌度。得的淌度。有效有效电泳淌度泳淌度：在：在实际溶液中溶液中测得的淌度。得的淌度。+8.n电场强度度：与所施加的与所施加的电压成正比，与两成正比，与两电极极间的距离（的距离（L）成反比）成反比 E=V/Ln电场力力：在溶液中，在溶液中，电场对带电离子作用力（离子作用力（F F）的大小等于）的大小等于带电离子所离子所带的的净电荷（荷（q q）与）与电场强度的乘度的乘积：F=qEn在在电泳迁移泳迁移过程中，介程中，介质粘滞力粘滞力（F F）必然会阻碍离子的迁移。必然会阻碍离子的迁移。n粘滞力的大小与离子大小、形状、粘滞力的大小与离子大小、形状、缓冲液粘度、甚至冲液粘度、甚至电泳介泳介质孔径均有关系，孔径均有关系，与与带电离子的移离子的移动速度更是直接相关。速度更是直接相关。对于于球形分子球形分子F的大小服从的大小服从Stokes定定律：律：F=6ref ：缓冲液粘度；冲液粘度；r：球形分子的半径；：球形分子的半径；ef：离子在：离子在电场中的迁移速度。中的迁移速度。9.当当带电离子以速度离子以速度 在在电场中移中移动时，受到大小相等、方向相反的，受到大小相等、方向相反的电场驱动力和平力和平动摩擦阻力的作用，此摩擦阻力的作用，此时F=F故：qE=6ref则离子在离子在电场中的迁移速度：中的迁移速度：即即带电离子的离子的电泳迁移速率（或称泳迁移速率（或称电泳淌度）泳淌度）:由此可知，球形由此可知，球形带电离子的迁移率，主要取决于自身状离子的迁移率，主要取决于自身状态，即与其所，即与其所带电量成正比，与其半径及介量成正比，与其半径及介质粘度成反比。粘度成反比。电泳泳过程中正是利用程中正是利用带电离子离子电泳迁移速度或迁移速率的差异来泳迁移速度或迁移速率的差异来实现分离的。分离的。10.二、二、电渗流渗流n在高在高电场的作用下，的作用下，带正正电荷的溶液表面及荷的溶液表面及扩散散层向阴极移向阴极移动，由于，由于这些些阳离子阳离子实际上是溶上是溶剂化的化的，故将引起柱中，故将引起柱中的溶液整体向的溶液整体向负极移极移动，形成形成电渗流。渗流。n n石英毛石英毛石英毛石英毛细细管柱，内壁大管柱，内壁大管柱，内壁大管柱，内壁大约约有有有有8.31 8.31 mol/mmol/m2 2的硅醇基的硅醇基的硅醇基的硅醇基（Si-OHSi-OH），其），其），其），其等等等等电电点点点点约为约为1.51.5，内充液，内充液，内充液，内充液pH3pH3时时，表，表，表，表面面面面电电离成离成离成离成SiOSiO-，管内壁管内壁管内壁管内壁带负电带负电荷，形成双荷，形成双荷，形成双荷，形成双电层电层。11.1.CE1.CE中中电渗流的大小与方向渗流的大小与方向 电渗流的大小可用渗流的大小可用电渗速度和渗速度和电渗淌度表示。渗淌度表示。（1 1）电渗流的大小渗流的大小n电渗流的大小与渗流的大小与电场强度、度、ZataZata电势及及缓冲液介冲液介电常常数有关，某一数有关，某一电泳体系内泳体系内电渗流的具体数渗流的具体数值可以用可以用Helmholtz-Smoluchowski 公式公式计算：算：式中，为电渗速度；为电渗淌度（EOF mobility）；为双电层的Zeta电位；为缓冲液介电常数；为电解液粘度；V为所施加的电压；为毛细管总长度。12.n在具体在具体实验中中，可根据需要，可根据需要选用不同的中性用不同的中性组分作分作为标记物（物（N,N-N,N-二甲基甲二甲基甲酰胺、二甲胺、二甲亚砜、甲、甲酰胺、苯酚、胺、苯酚、丙丙酮等等），），测定不同定不同缓冲条件下中性冲条件下中性标记物的迁移物的迁移时间，按下述公式按下述公式计算出算出电渗率：渗率：其中，t：中性标记物的迁移时间，ldet为毛细管电泳有效长度，ltot为毛细管电泳有效长度。13.（2 2）CECE中中电渗流的方向渗流的方向n石英毛石英毛细管管带负电荷，溶液荷，溶液带正正电荷，荷，电渗流渗流流向阴极；流向阴极；n改改变电渗流方向的方法：渗流方向的方法：毛毛细管改性：管改性：表面表面键合阳离子基合阳离子基团；加加电渗流反渗流反转剂:内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。14.2 2.CECE中中电渗流的流形渗流的流形n n液相色液相色液相色液相色谱谱中的溶液流中的溶液流中的溶液流中的溶液流动为层动为层流，流，流，流，抛物抛物抛物抛物线线流型流型流型流型，管壁管壁管壁管壁处处流速最慢，管中心流速最慢，管中心流速最慢，管中心流速最慢，管中心处处的速度的速度的速度的速度为为平均速度的平均速度的平均速度的平均速度的2 2 2 2倍（引倍（引倍（引倍（引起起起起谱带谱带展展展展宽较宽较大）。大）。大）。大）。n n在毛在毛在毛在毛细细管管管管电电泳中，泳中，泳中，泳中，电电荷均匀分布，整体移荷均匀分布，整体移荷均匀分布，整体移荷均匀分布，整体移动动，电电渗渗渗渗流的流流的流流的流流的流动为动为平流平流平流平流，塞式流塞式流塞式流塞式流动动（谱带谱带展展展展宽宽很小），故很小），故很小），故很小），故柱效柱效柱效柱效较较高。高。高。高。15.3 3.CECE中中电渗流的作用渗流的作用n电渗流的速度一般渗流的速度一般约等于离子等于离子电泳速度的泳速度的5 57 7倍；倍；n各种各种电性粒子在毛性粒子在毛细管柱中的迁移速度管柱中的迁移速度为：阳离子迁移速度阳离子迁移速度 =电渗流渗流+电泳流，阳离子运泳流，阳离子运动速度快于速度快于电渗流；渗流；阴离子迁移速度阴离子迁移速度 =电渗流渗流电泳流，阴离子运泳流，阴离子运动速度慢于速度慢于电渗流；渗流；中性粒子迁移速度中性粒子迁移速度 =电渗流，中性粒子运渗流，中性粒子运动速度与速度与电渗流一致。渗流一致。nCECE中中电渗流的作用：渗流的作用：可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；改改变电渗流的大小和方向可改渗流的大小和方向可改变分离效率和分离效率和选择性性电渗流的微小渗流的微小变化影响化影响结果的重果的重现性；性；在在CECE中，控制中，控制电渗流非常重要渗流非常重要。+16.4.CE4.CE中影响中影响电渗流的因素渗流的因素（1 1）电场强度的影响度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。（2 2）毛）毛细管材料的影响管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同。17.（3 3）电解解质溶液性溶液性质的影响的影响 溶液溶液pHpH的影响的影响 对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大。pHpH在在4-74-7之之间，电渗流增大渗流增大显著著；pH8pH8时电渗流增大速渗流增大速度度渐缓。当pH电泳泳时,阴离子在阴离子在负极极最后流出最后流出,在在这种情况下种情况下,不但可以按不但可以按类分离分离,同种同种类离子由于离子由于差速迁移差速迁移被被相互分离。相互分离。CZECZE是最基本、是最基本、应用广的分离模式；用广的分离模式；36.二、毛二、毛细管凝胶管凝胶电泳泳 Capillary gel electrophoresis，CGE 将聚丙将聚丙烯酰胺等在毛胺等在毛细管柱内交管柱内交联生成凝胶。生成凝胶。其具有多孔性，其具有多孔性，类似分子似分子筛的作用，的作用，试样分子按大小分离。分子按大小分离。能能够有效减小有效减小组分分扩散，所得峰型尖散，所得峰型尖锐，分离效率高。，分离效率高。蛋白蛋白质、DNADNA等的等的电荷荷/质量比与分子大小无关，量比与分子大小无关，CZECZE模式模式很很难分离，采用分离，采用CGECGE能能获得良好分离，得良好分离，DNADNA排序的重要手段。排序的重要手段。特点特点：抗抗对流性好，散流性好，散热性好，分离度极高。性好，分离度极高。无胶无胶筛分技分技术：采用低粘度的采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度性聚合物溶液代替高粘度交交联聚丙聚丙烯酰胺。柱便宜、易制胺。柱便宜、易制备。37.1.1.缓冲溶液中加入离子型表面活性冲溶液中加入离子型表面活性剂，其，其浓度达到度达到临界界浓度，度，形成一疏水内核、外部形成一疏水内核、外部带负电的胶束。的胶束。三、三、胶束胶束电动毛毛细管色管色谱（MECCMECC，MEKCMEKC）Micellar electrokinetic capillary chromatography,MEKC 在在电场力的作用力的作用下，胶束在柱中移下，胶束在柱中移动。38.2.2.电泳流和泳流和电渗流的方向相反，且渗流的方向相反，且电渗流渗流 电泳泳 ，负电胶束以胶束以较慢的速度向慢的速度向负极移极移动；5.5.色色谱与与电泳分离模式的泳分离模式的结合。合。3.3.中性分子在胶束相和溶液（水相）中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性分配，疏水性强的的组分与分与胶束胶束结合的合的较牢，流出牢，流出时间长；4.4.可用来分离中性物可用来分离中性物质，扩展了高效毛展了高效毛细管管电泳的泳的应用范用范围；39.1.1.根据等根据等电点差点差别分离生物大分子的高分辨率分离生物大分子的高分辨率电泳技泳技术；2.2.毛毛细管内充有两性管内充有两性电解解质（合成的具有不同等（合成的具有不同等电点范点范围的脂的脂肪族多胺基多肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流酸混合物），当施加直流电压（6 68 8.0.0 kVkV）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pHpH梯度；梯度；3.3.氨基酸、蛋白氨基酸、蛋白质、多、多肽等的所等的所带电荷与溶液荷与溶液pHpH有关，在酸性有关，在酸性溶液中溶液中带正正电荷，反之荷，反之带负电荷。在其等荷。在其等电点点时，呈，呈电中性，中性，淌度淌度为零；零；四、毛四、毛细管等管等电聚焦聚焦Capillary isoelectric focusing,CIEFCapillary isoelectric focusing,CIEF40.4.4.聚焦：具有不同等聚焦：具有不同等电点的生物点的生物试样在在电场力的作用下迁移，力的作用下迁移，分分别到达到达满足其等足其等电点点pHpH的位置的位置时，呈，呈电中性，停止移中性，停止移动，形成窄溶形成窄溶质带而相互分离；而相互分离；5.5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOHNaOH溶液；溶液；6.6.加加压将毛将毛细管内分离后的溶液推出管内分离后的溶液推出经过检测器器检测；7.7.电渗流在渗流在CIEFCIEF中不利，中不利，应消除或减小。消除或减小。41.1.1.将两种淌度差将两种淌度差别很大的很大的缓冲液分冲液分别作作为前前导离子离子(充充满毛毛细管管)和尾随离子，和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速，并以同一速度移度移动。2.2.负离子分析离子分析时，前，前导电解解质的淌度大于的淌度大于试样中所有中所有负离子的。离子的。所有所有试样都按前都按前导离子的速度等速向阳极前离子的速度等速向阳极前进，逐，逐渐形成各自独形成各自独立的区立的区带而分离。阴极而分离。阴极进样，阳极，阳极检测。五、毛五、毛细管等速管等速电泳泳 Capillary isotachophoresis Capillary isotachophoresis，CITPCITP42.3.3.不同离子的淌度不同，所形成区不同离子的淌度不同，所形成区带的的电场强度不同度不同(=E=E)，淌度大的离子区淌度大的离子区带电场强度小。度小。沿出口到沿出口到进口，将不同区口，将不同区带依次排序依次排序1 1、2 2、3 3、4 4 电场强度依次增大。假度依次增大。假设“2”2”号中离子号中离子扩散到散到“3”3”号，号，该区区电场强度度大，离子被加速，返回到大，离子被加速，返回到“2”2”区；当区；当“2”2”号中离子跑到号中离子跑到“1”1”号号区，离子被减速使之区，离子被减速使之归队；4.4.特点：界面明特点：界面明显，富集、，富集、浓缩作用。作用。43.在毛在毛细管壁上管壁上键合或涂合或涂渍高效液相色高效液相色谱的固定的固定液，以含有机物的液，以含有机物的缓冲液冲液为流流动相，以相，以电渗流渗流为驱动力，力，试样组分在两相分在两相间的分配的分配为分离机理的分离机理的电动色色谱过程；程；六、毛六、毛细管管电色色谱 Capillary electroosmostic chromatography Capillary electroosmostic chromatography，CECCEC44.一、离子分析一、离子分析阳离子分析阳离子分析 迁移方向和迁移方向和电渗流方向渗流方向一致；一致；4.5 min4.5 min内分离了内分离了2424种种金属离子；金属离子；阳极阳极进样，阴极，阴极检测；具有很高的灵敏度。具有很高的灵敏度。第五第五节 毛毛细管管电泳的泳的应用与用与进展展45.阴离子分析阴离子分析 阴离子阴离子电泳方向和泳方向和电渗流方渗流方向相反、速度接近，分析向相反、速度接近，分析时间长、效率低；、效率低；质量小、量小、电荷密度大的离子荷密度大的离子如：如：SOSO4 42-2-、ClCl-、F F-等，等，电泳速泳速率大于率大于电渗流，阳极端流出，渗流，阳极端流出，在阴极端无法在阴极端无法检测；加入加入电渗流改性渗流改性剂，十六，十六烷基三甲基溴化胺等，使基三甲基溴化胺等，使电泳方泳方向和向和电渗流方向一致，可在渗流方向一致，可在3.1 3.1 minmin内分离内分离3636种阴离子；阴极种阴离子；阴极进样，阳极，阳极检测；离子价离子价态及存在形及存在形态分析；分析；46.二、二、药物分析物分析 检测体液或体液或细胞中某胞中某些代些代谢产物的分析；物的分析；尿液中的氨基酸含量尿液中的氨基酸含量作作为临床床诊断糖尿病的断糖尿病的辅助手段；助手段；采用毛采用毛细管区管区带电泳泳方式，在方式，在11 min11 min内分离内分离1717种种药物；物；47.采用采用MEKCMEKC模式，模式，鉴定定违禁禁药物；物；效果效果优于于HPLCHPLC法法48.三、手性化合物分析三、手性化合物分析 合成合成获得得单一手性化合物相当困一手性化合物相当困难；528528种手性合成种手性合成药物，物，6161中以中以单一一对映体形式映体形式销售，其他售，其他为外消旋体；外消旋体；检测分析也分析也相当困相当困难；研究；研究热点；点；R-R-反反应停是安眠停是安眠药，S-S-式致胎儿畸形；式致胎儿畸形；HPCEHPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；形成配合物的形成配合物的稳定常数有差异，定常数有差异，结合合HPCEHPCE的高效率；的高效率；常用手性常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠糊精及其衍生物；手性冠醚；手性；手性表面活性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性、低聚糖等天然手性表面活性剂）49.四、氨基酸与蛋白四、氨基酸与蛋白质分析分析采用采用MEKCMEKC模式，在模式，在25 min25 min内分离了内分离了2323种丹种丹酰化氨基酸；化氨基酸；HPCEHPCE可取代可取代传统的氨基酸分析的氨基酸分析仪；问题：吸附和：吸附和检测；50.蛋白蛋白质分析分析51.五、核酸分析及五、核酸分析及DNADNA排序排序酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；52.六、新六、新进展展1.1.微型化微型化 整体化学分析系整体化学分析系统（TASTAS）及）及TASTAS微型化微型化 在硅片上光刻出矩形槽作在硅片上光刻出矩形槽作为毛毛细管管，理理论塔板数塔板数10105 5/m/m；2.2.联用用仪器器 CE-MS；3.3.阵列毛列毛细管凝胶管凝胶电泳泳 应用于人用于人类基因基因DNADNA测序；序；5 51010万个基因，万个基因，3030亿个碱基个碱基对，目前最有效的，目前最有效的DNADNA序列序列分析分析仪，1010小小时/次；可同次；可同时电泳泳2424个个样品；速度品；速度12001200碱基碱基对/小小时，提高速度！，提高速度！100100支毛支毛细管管阵列列电泳；速度泳；速度280280碱基碱基对/小小时/支支53.