动物肝脏DNA提取和鉴定ppt课件.ppt

实 验 五五动物肝物肝脏中中DNA的制的制备和和鉴定定学学时：6 61.1 1、掌握、掌握动物物组织总DNADNA的提取方法及其原理。的提取方法及其原理。2 2、掌握、掌握琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。泳分离核酸的原理和方法。3 3、学、学习核酸染色的方法。核酸染色的方法。一、一、实验目的：目的：2.二、二、实验原理原理:要要获得得纯的的DNADNA样品，必品，必须考考虑以下几点：以下几点：如何如何选材，如何破碎材，如何破碎组织细胞？胞？如何除去蛋白如何除去蛋白质？(在真核在真核细胞内，胞内，DNADNA与蛋白与蛋白质结合成核蛋合成核蛋白的形式存在。因此，分离白的形式存在。因此，分离DNADNA时必必须使其与蛋白使其与蛋白质解离，并除去蛋解离，并除去蛋白白质。)设法除去法除去RNARNA的的污染；染；防止防止DNADNA酶的降解作用；的降解作用；（一）（一）动物肝物肝脏DNA制制备原理原理3.选材材 要提取要提取动物物组织DNADNA，一般，一般选择细胞膜胞膜较脆弱，容易破碎的脆弱，容易破碎的动物物脏器，如器，如胸腺、肝胸腺、肝脏、脾、脾脏、胰、胰脏等。等。4.研磨：研磨：将剪碎的将剪碎的动物物组织置于研置于研钵或匀或匀浆器中，加入少量石器中，加入少量石英砂研磨或匀英砂研磨或匀浆，破碎，破碎细胞。胞。这种方法温和，适合种方法温和，适合实验室使室使用。用。组织捣碎器：碎器：较剧烈的破碎烈的破碎细胞的方法，胞的方法，为了防止了防止发热和升和升温温过高，通常是高，通常是转1010秒秒2020秒，停秒，停1010秒秒2020秒，可反复多次。秒，可反复多次。压榨法：榨法：在在1000101000105 5PaPa2000102000105 5Pa Pa 的高的高压下使几十毫升下使几十毫升的的细胞胞悬液通液通过一个小孔突然一个小孔突然释放至常放至常压，细胞将胞将彻底破碎。底破碎。温和的、温和的、彻底破碎底破碎细胞的方法，但胞的方法，但仪器器费用用较高。高。细胞破碎方法胞破碎方法机械物理法：5.反复反复冻融法：融法：将待破碎的将待破碎的细胞冷至胞冷至1515到到2020，然后放于室温，然后放于室温(或或40)40)迅速融化，由于迅速融化，由于细胞内形胞内形成冰粒使剩余胞液的成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起度增高而引起细胞溶胞溶胀破破碎。碎。超声波超声波处理法：理法：借助超声波的振借助超声波的振动力破碎力破碎细胞壁和胞壁和细胞器。使用胞器。使用时注意降温，防止注意降温，防止过热。冷冷热交替法：交替法：在在9090左右左右维持数分持数分钟，立即放入冰，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分大部分细胞可以胞可以被破碎。被破碎。细胞破碎方法胞破碎方法机械物理法6.有机溶有机溶剂处理法：理法：利用利用氯仿、甲苯等脂溶性溶仿、甲苯等脂溶性溶剂或或SDSSDS（十二（十二烷基硫酸基硫酸钠）等表面活性）等表面活性剂处理理细胞，胞，可将可将细胞膜溶解，从而使胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与胞破裂，此法也可以与研磨法研磨法联合使用。合使用。溶溶胀法：法：细胞膜胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀度的稀盐溶液中，由于存在渗透溶液中，由于存在渗透压差，溶差，溶剂分子分子大量大量进入入细胞，将胞，将细胞膜胞膜胀破破释放出放出细胞内含物。胞内含物。细胞破碎方法胞破碎方法化学方法7.(三三)除去除去RNA的方法的方法 脱氧核糖核蛋白脱氧核糖核蛋白在在浓NaClNaCl（1-2mol1-2molL L）溶液中）溶液中溶解度很大，但在溶解度很大，但在0.14mol0.14molL NaClL NaCl溶液中溶解度很低，溶液中溶解度很低，而而核糖核蛋白核糖核蛋白则溶于溶于0.14mol0.14molL NaClL NaCl溶液中，利用溶液中，利用这一性一性质可将脱氧核糖核蛋白与可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白大部分核糖核蛋白分离开来。分离开来。8.(四四)除去蛋白除去蛋白质的方法的方法用用氯仿一异成醇混合液振仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白核蛋白溶液，使蛋白质变性，然性，然后离心除去后离心除去变性蛋白性蛋白质，此，此时蛋白蛋白质凝胶停留在水相及凝胶停留在水相及氯仿仿相中相中间，而，而DNADNA溶于上溶于上层水相。用两倍体水相。用两倍体积 9595乙醇溶液可乙醇溶液可将将DNADNA钠盐沉淀出来。沉淀出来。用十二用十二烷基硫酸基硫酸钠（SDSSDS）等去）等去污剂使蛋白使蛋白质变性，可以直接性，可以直接从生物材料中提取从生物材料中提取DNADNA。9.纯的的DNA样品的品的获得得为了防止了防止DNADNA酶的降解，提取的降解，提取时可加入适量可加入适量EDTAEDTA（乙二胺四乙酸）、（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低檬酸，以降低DNADNA酶的活性。的活性。加入加入RNARNA酶降解剩余的降解剩余的RNARNA，获得得纯的的DNADNA。保保存存：将将DNADNA于于滤纸上上干干燥燥，溶溶于于1mlTE1mlTE中中低低温保存。温保存。10.（二）（二）琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：泳分离核酸的原理：l琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳是用泳是用琼脂糖凝胶脂糖凝胶作作为支持介支持介质的一种的一种电泳分离方法，是一种泳分离方法，是一种简便、快速分离便、快速分离鉴定核酸的方法，已定核酸的方法，已成成为分子生物学及基因工程研究中常用分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。方法之一。l琼脂糖脂糖英文名英文名agarose，是从是从琼脂脂中提取出来的，由中提取出来的，由半半乳糖乳糖和和3.6-3.6-脱水脱水-L-L-半乳糖半乳糖相互相互结合的合的链状多糖状多糖。琼脂糖脂糖和和琼脂脂都可在不同都可在不同浓度的水溶液下可形成度的水溶液下可形成多孔的凝胶多孔的凝胶，电泳中具有泳中具有分子分子筛效效应。但。但琼脂糖含硫酸根比脂糖含硫酸根比琼脂少脂少，电渗渗作用作用降低，因而分离效果明降低，因而分离效果明显提高。提高。11.lDNADNA分子分子在在pH高于其等高于其等电点的溶液中点的溶液中带负电荷，在荷，在电场中向正极移中向正极移动（电荷效荷效应）。lDNA分子泳分子泳动速率的大小除与速率的大小除与DNA分子的分子的带电量有关量有关外，外，还与与DNA分子的大小和空分子的大小和空间构象有关（构象有关（琼脂糖凝胶脂糖凝胶的的分子分子筛效效应）。）。l电泳泳时，用，用溴酚溴酚蓝做前沿指示做前沿指示剂，用，用溴化乙溴化乙啶（ethidiumbromide，EB）指示指示DNA样品在凝胶中的品在凝胶中的确切位置。确切位置。l溴化乙溴化乙啶是一种是一种荧光染料，可插入光染料，可插入DNA双螺旋双螺旋结构的构的两个碱基两个碱基对之之间，与，与DNA分子形成分子形成络合物，在紫外光的合物，在紫外光的激激发下下发出橙黄色的出橙黄色的荧光。光。12.l荧光光来自两方面，一是核酸吸收来自两方面，一是核酸吸收260260nmnm的紫外光，并的紫外光，并将能量将能量传给EB；二是二是EB本身吸收波本身吸收波长为302302nmnm和和360360nmnm的紫外光。的紫外光。这两方面的能量最两方面的能量最终激激发EB发出出波波长为590590nmnm的的红橙色橙色荧光。光。l溴化乙溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶泳后，将凝胶放在含放在含EB的溶液中浸泡的溶液中浸泡.l溴化乙溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可的灵敏度很高，可检出出10ng甚至甚至更少的更少的DNA。13.琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素泳分离核酸的影响因素（1）核酸大小与核酸大小与琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳分离的关系泳分离的关系凝胶中，凝胶中，DNA片段迁移率与片段迁移率与DNA分子大小分子大小(碱基碱基对的的对数数)成反比成反比(20kb)，因此通因此通过已知大小的已知大小的标准物移准物移动的距离与未知片段的移的距离与未知片段的移动距离距离时行比行比较，便可，便可测出未知片段的大小。出未知片段的大小。（2）核酸构型与核酸构型与琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳分离的关系泳分离的关系不同构型不同构型DNA的移的移动速度次序速度次序为：闭环DNA直直线DNA开开环的双的双链环状状DNA.（3）不同大小的不同大小的DNA需要用不同需要用不同浓度的度的琼脂糖凝胶脂糖凝胶进行行电泳泳分离。分离。琼脂糖脂糖浓度度/%/%0.30.60.70.91.21.52.0线状状DNADNA大小大小/kbkb60-520-110-0.87-0.56-0.43-0.22-0.1注：注：DNADNA片段在片段在5-5005-500bpbp之之间时，一般用聚丙，一般用聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳（泳（PAGEPAGE）进行行电泳分离。泳分离。14.琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳具有以下泳具有以下优点：点：（1 1）操作）操作简单、制、制备容易快速、凝胶机械性能好、容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度泳速度快、分离快、分离DNADNA片段范片段范围广、广、样品不需事先品不需事先处理就可以理就可以进行行电泳。泳。（2 2）凝胶）凝胶结构均匀，构均匀，对样品吸附小，品吸附小，电泳泳图谱清晰，分辨率清晰，分辨率高，重复性好。高，重复性好。（3 3）琼脂糖透明无紫外吸收，脂糖透明无紫外吸收，电泳泳过程和程和结果可直接用紫外果可直接用紫外光光检测及定量及定量测定。定。（4 4）电泳后区泳后区带易染色，易染色，样品极易洗脱，便于定量品极易洗脱，便于定量测定。制定。制成干膜可成干膜可长期保存。期保存。因此，因此，琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳已成泳已成为分子生物学及基因工程研究分子生物学及基因工程研究中常用中常用实验方法之一，方法之一，DNADNA样本的分离、本的分离、纯化、化、鉴定以及相定以及相对分子分子质量量测定常用定常用琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳。泳。15.荧光染料光染料EB染色染色后，在紫外灯后，在紫外灯(305nm)下下观察到的察到的电泳泳结果：果：16.*荧光染料光染料EBEB染色的原理和染色的原理和优点是什么？点是什么？1 1、原理：、原理：EBEB：即即3,8-3,8-二二氨氨基基-5-5-乙乙基基-6-6-苯苯基基菲菲锭溴溴盐(Ethidium Ethidium Bromide)Bromide)。EBEB是是一一种种扁扁平平分分子子，它它可可以以嵌嵌入核酸的碱基之入核酸的碱基之间，在紫外，在紫外线激激发下，下，发出出红橙色橙色荧光。光。激激发的的荧光光的的能能量量来来源源于于两两个个方方面面：一一是是核核酸酸吸吸收收2 260nm60nm的的紫紫外外线后后将将能能量量传递给EBEB，二二是是EBEB本本身身吸吸收收302302nmnm和和360360nmnm的的紫紫外外线的的能能量量。这两两方方面面的的能能量量最最终激激发EBEB发射波射波长为590590nmnm的可的可见光（光（红橙区）。橙区）。17.2 2、优点：点：（1 1）染色比）染色比较简便、快捷，一般在便、快捷，一般在10101515minmin就可反就可反应。（2 2）EBEB对核酸分子无破坏作用，核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做是其它染料所不能做 到的。到的。（3 3）EBEB灵敏度高，可灵敏度高，可检测出出1010ngng或更少的或更少的DNADNA含量。含量。（4 4）既可用于）既可用于DNADNA也可用于也可用于RNARNA的的检测。（5 5）EBEB可加到可加到样品中，也可加到凝胶中，可随品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外用紫外 灯灯检测电泳的泳的进程和效果。程和效果。（6 6）EB-DNAEB-DNA复合物中的复合物中的EBEB发出的出的荧光比游离的光比游离的EBEB强1010倍，倍，因此不需洗因此不需洗净凝胶中游离的凝胶中游离的EBEB也可也可检测出出DNADNA的条的条带。18.3 3、缺点：、缺点：溴溴化化乙乙啶是是一一种种强的的致致突突变剂，在在操操作作和和配配制制试剂时应戴戴手手套套。含含溴溴化化乙乙啶的的溶溶液液不不能能直直接接倒倒入入下下水水道道，应进行行处理。理。（1 1）每）每100100mlml溶液中加入溶液中加入100100mgmg粉状活性炭；粉状活性炭；（2 2）室温下放置）室温下放置1 1小小时，不，不时的的摇动；（3 3）用新）用新华一号一号滤纸过滤，弃，弃滤液；液；（4 4）用塑料袋封装）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作和活性炭，作为有害有害废物物处理。理。*溴溴化化乙乙啶在在260260分分解解，在在标准准条条件件下下进行行焚焚化化后后不不会会有有危危险性。性。19.(一一)材料：材料：动物肝物肝脏(二二)试剂：（1）0.14molLNaCl0.15molLEDTA-Na溶液：溶液：（2）20SDS溶液：溶液：（3）氯仿一异戊醇仿一异戊醇(24:1)混合液：混合液：（4）95乙醇溶液。乙醇溶液。（5）80乙醇溶液乙醇溶液。（6）pH8.0TE缓冲冲液液：10mmolLTrisHCI，lmmolLEDTANa，其中含其中含RNA酶20ugmL。二、二、实验材料、材料、试剂和和仪器器:20.（7）电泳泳缓冲液：冲液：Tris-硼酸硼酸EDTA（50TBE）pH8.0。（8）加加样缓冲液：冲液：0.25%溴酚溴酚蓝（BPB）40%蔗糖。蔗糖。（9）溴化乙溴化乙啶（EB）溶液：溶液：10g/ml。（10）琼脂糖凝胶：脂糖凝胶：浓度度为0.7%。(三三)仪器器（1）稳压稳流流电泳泳仪（2）可可调微量移液器微量移液器（3）水平水平电泳槽泳槽（4）暗箱紫外透射暗箱紫外透射仪等。等。21.移液器的使用移液器的使用自动取液器的构造自动取液器的使用吸入液体吸入液体排出液体排出液体使用注意事使用注意事项：不超量程使用；不倒置；使用完：不超量程使用；不倒置；使用完毕调至最大刻度上。至最大刻度上。22.三、三、实验步步骤：1 1取新取新鲜动物肝，称取物肝，称取1g1g，切成小切成小块，加，加入入2ml 0.14mol2ml 0.14molL NaClL NaCl0.15mol0.15molL L EDTAEDTA溶液，于研溶液，于研钵中研磨至匀中研磨至匀浆，再加，再加2ml2ml清洗清洗转入离心管中入离心管中，以以40004000r rminmin的的转速速离心离心 10 10minmin。23.2 2在上述沉淀物中加入在上述沉淀物中加入2mL2mL 0.14 0.14molmolL NaClL NaCl0.15mol0.15molL EDTAL EDTA溶液，然后在溶液，然后在6060下，滴加下，滴加 20 20SDSSDS溶液溶液3 35 5滴滴，边加加边摇动，再，再摇动 10 10minmin，使核酸与蛋白使核酸与蛋白质分离。分离。3.3.加加固固体体氯化化钠0.0.2g2g混混匀匀，使使其其最最终浓度度达达到到l.4moll.4molL L，水浴水浴3030minmin。24.4 4加等体加等体积的的氯仿一异仿一异戊醇，混匀，戊醇，混匀，摇动5 5minmin，以，以40004000r rminmin的的转速离心速离心1010minmin。离心管内的物离心管内的物质分分为三三层，上，上层为含含DNADNA的水的水相相层，下，下层为氯仿一异成醇仿一异成醇混合物，中混合物，中间层为变性蛋白性蛋白凝胶。凝胶。25.5 5吸出上清液，加入吸出上清液，加入2 2倍体倍体积9595乙醇溶液（乙醇溶液（预冷），冷），产生沉淀。生沉淀。6.6.再再以以40004000r rminmin的的转速速离离心心溶溶液液1010minmin，弃弃去去上清液上清液(沉淀用沉淀用8080乙醇溶液离心洗乙醇溶液离心洗涤)。7 7将沉淀置于吸水将沉淀置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然上，除尽乙醇，室温自然干燥后，加入干燥后，加入200200ul ul 电极极缓冲液冲液，使使DNADNA充分溶解，充分溶解，待用。待用。26.8.8.凝胶板的制凝胶板的制备：（1 1）取取琼脂脂糖糖0.7 0.7 g g，加加11TBETBE缓冲冲溶溶液液100100mlml，于于沸沸水水浴浴中中至熔化，制成至熔化，制成0.7%0.7%的的琼脂糖胶液。脂糖胶液。（2 2）胶胶床床两两头贴上上防防水水胶胶带，形形成成8 8mmmm高高的的挡墙，压紧胶胶带，置水平台面上。置水平台面上。（3 3）插入梳子，梳插入梳子，梳齿下端离板底下端离板底0.50.51 1mmmm。（4 4）在胶床上滴加在胶床上滴加2 23 3滴滴 0.5 0.5g/mLg/mL的的EBEB溶液。溶液。（5 5）将将6060凝凝胶胶不不间断断倒倒入入胶胶床床，高高3 34 4mmmm，避避免免气气泡泡，摇匀，室温下凝固。匀，室温下凝固。（6 6）完完全全凝凝固固后后，撕撕掉掉胶胶带，置置于于电泳泳槽槽中中，加加入入电泳泳缓冲冲液液，高高于于胶胶面面1 12 2mmmm，从从一一头轻轻斜斜拉拉出出梳梳子子，除除去去产生生的气泡。的气泡。27.9.9.加加样：将将样品品DNADNA溶溶液液与与加加样缓冲冲液液以以5 5：1 1的的体体积比比混混合合，用用微微量量移移液液器器加加样，每每加加完完一一个个样品品，冲冲洗洗三三次次。加加样量量151520 20 l l（加加样时应防防止止碰碰坏坏样品品孔孔周周围的的凝凝胶胶面面以以及及穿穿透透凝凝胶底部）。胶底部）。10.10.电泳：泳：为了了获得得电泳泳分分离离DNADNA片片段段的的最最大大分分辨辨率率，电场强度度不不应高高于于5 5V/cmV/cm（两两电极极间的的距距离离）开开始始时用用较高高电压(80(80V)V)，样品品一一进入入胶胶内内则将将电压调至至5 5V/cm V/cm。当当染染料料前前沿沿移移至至底底边1-21-2mmmm时，电泳泳毕。11.11.观察察 关关闭电源源，取取出出胶胶床床，在在紫紫外外检测仪下下观察察凝凝胶胶中中的的DNADNA（红橙色橙色荧光）。光）。28.五、思考五、思考题：1 1、用用荧光光染染料料EBEB染染色色的的原原理理和和优缺缺点是什么？点是什么？2 2、绘制制DNADNA电泳泳图谱。29.核酸提取核酸提取过程中的注意事程中的注意事项：（1 1）避避免免过酸酸过碱碱或或高高温温环境境，合合适适的的T T：0 044，pH4-9pH4-9；（2 2）防止机械力的切割作用，避免防止机械力的切割作用，避免剧烈振烈振荡；（3 3）防防止止核核酸酸酶的的降降解解作作用用，可可加加入入抑抑制制剂EDTAEDTA，柠檬檬酸酸钠；（4 4）整整个个操操作作步步骤应尽尽量量简化化，缩短短实验过程程，减减少少核核酸酸变性、降解、机械切割的机会。性、降解、机械切割的机会。30.后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料仅供参考，实际情况实际分析31.主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、图文设计制作、发布广告等秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求32.感感谢您的您的观看和下看和下载The user can demonstrate on a projector or computer,or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field33.