GA∕T 1914-2021 法庭科学 生物检材中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙检验 液相色谱-质谱法(公共安全).pdf

ICS 13.310 CCS A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙检验 液相色谱-质谱法 Forensic sciencesExamination methods for oleandrin and adynerin in biological samplesLC-MS -发布 -实施 中华人民共和国公安部 发 布 GA/T 1 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会(SAC/TC 179/SC1)提出并归口。 本文件起草单位：公安部物证鉴定中心、杭州市公安司法鉴定中心、中国人民公安大学。 本文件主要起草人：王芳琳、栾玉静、姚伊人、应剑波、何洪源。 GA/T 2 法庭科学 生物检材中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙检验 液相色谱-质谱法 1 范围 本文件规定了法庭科学领域生物检材（血液、尿液）中夹竹桃苷、夹竹桃苷乙的液相色谱-质谱（LC-MS）检验方法。 本文件适用于法庭科学领域生物检材（血液、尿液）中夹竹桃苷、夹竹桃苷乙的定性分析和定量分析。其他检材可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取、净化及浓缩，采用液相色谱-串联质谱法检测，以保留时间、质谱特征离子对和离子对丰度比作为定性判断依据；以峰面积为依据，采用外标法进行定量分析。 5 试剂及材料 5.1 试剂 实验用水应符合GB/T 6682 中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为色谱纯，试剂包括： a) 乙腈； b) 甲醇； c) 甲酸； d) 甲酸铵； e) 磷酸盐缓冲液（pH 值 6.0） ：称取磷酸二氢钠（分析纯）8.34g、磷酸氢二钠（分析纯）0.87g，于 1000mL 容量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度； f) 10mmoL/L 甲酸铵溶液（含 0.1%甲酸）：称取甲酸铵 0.62g，加水溶解后，再加入 100 L 甲酸，用水稀释至 1000mL； g) 标准物质溶液： GA/T 3 1) 1.0mg/mL 标准物质储备液：根据夹竹桃苷和夹竹桃苷乙标准物质的纯度，称取适量，用甲醇分别配制成 1.0mg/mL 夹竹桃苷、夹竹桃苷乙标准物质储备液，密封，04保存，有效期 6 个月。或采用市售标准溶液； 2) 10.0 g/mL 单一标准物质工作溶液：移取 1.0mg/mL 标准物质储备液，用甲醇配制成浓度为 10.0g/mL 的单一标准工作溶液，密封，04保存，有效期 3 个月。实验中所用其他浓度的单一标准工作溶液均由 10.0g/mL 单一标准物质工作溶液配制得到； 3) 0.1mg/mL 混合标准物质工作溶液：分别移取 1.0mg/mL 的夹竹桃苷、夹竹桃苷乙标准物质储备溶液，用甲醇配制成浓度为 0.1mg/mL 的混合标准物质工作溶液，密封，04保存，有效期 3 个月。实验中所用其他浓度的混合标准物质工作溶液均由 0.1mg/mL 混合标准物质工作溶液配制得到。 5.2 材料 材料包括： a) 一次性注射器； b) 液液支撑固相萃取柱：ISOLUTE SLE+液液支撑固相萃取柱； 注：ISOLUTE SLE+液液支撑固相萃取柱是 Biotage 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 c) 具盖离心管； d) 有机系微孔滤膜：0.22m。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 液相色谱-质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）和三重四极杆质量分析器； b) 电子天平：分度值 d0.01mg； c) 离心机； d) 振荡器； e) 移液器； f) 浓缩器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品前处理 7.1.1.1 液液萃取 移取血液等液体检材样品1.0mL于具盖离心管中， 加入乙酸乙酯5mL， 振荡10min， 不低于8000r/min离心 10min，分离有机相；重复提取一次，合并两次提取的有机相，置于浓缩器上 40下浓缩至干，残留物用初始流动相 0.5mL 溶解， 经 0.22 m 有机系微孔滤膜过滤， 作为检材样品提取液， 供仪器检测。注：检材样品取样量、提取溶剂体积可根据实际情况调整。 7.1.1.2 液液支撑固相萃取 移取血液等液体检材样品 0.5mL 于具塞试管中，加入磷酸盐缓冲液 0.5mL，混匀，将样品加入液液GA/T 4 支撑固相萃取柱中，用正压将样品压入柱中，静置 5min，乙酸乙酯 8mL 分两次加入到萃取柱中，流速控制为 0.5mL/min1.0mL/min；再将柱中残余的液体挤出。收集流出液，置于浓缩器上 40下浓缩至干，残留物用初始流动相 0.5mL 溶解，经 0.22m 有机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液，供仪器检测。 注：检材样品取样量和定容体积可根据实际情况调整。 7.1.1.3 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加标准物质工作溶液，使夹竹桃苷、夹竹桃苷乙浓度为20ng/mL，作为添加样品，与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液，供仪器检测。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱：kinetex C18 (3.0mm 50mm，2.6m）； 注： kinetex C18色谱柱是 Phenomenex 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 柱温：40； c) 流动相A：乙腈； d) 流动相B： 10mmoL/L甲酸铵溶液（含0.1%甲酸）； e) 流速：0.5mL/min； f) 进样体积：10L； g) 洗脱：梯度洗脱，梯度洗脱条件见表1； 表 1 流动相和梯度洗脱条件 时间 min 流动相 A 流动相 B 00.2 10% 90% 3.0 95% 5% 5.0 95% 5% 5.1 10% 90% 7.0 10% 90% h) 扫描方式：正离子扫描(ESI+)； i) 检测方式：多反应监测(MRM)； j) 离子源温度：550； k) 雾化气压力：55psi； l) 电喷雾电压：5500V； m) 气帘气压力：35psi； n) 辅助气压力：55psi； o) 定性、定量离子对和去簇电压、碰撞能量条件见表 2。 GA/T 5 表 2 定性、定量离子对和去簇电压、碰撞能量条件 目标物 定量离子对 m/z 定性离子对 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV 夹竹桃苷 577.5 373.3 577.5 373.3 105 19 577.5 433.3 105 13 夹竹桃苷乙 534.4 373.3 534.4 373.3 26 15 534.4 113.2 20 18 7.1.2.2 进样 分别吸取空白溶剂、添加样品提取液、空白样品提取液、检材样品提取液、标准物质工作溶液，按7.1.2.1仪器条件进行检测。进样顺序和进样次数应确保结果有效。 7.2 定量分析 7.2.1 样品前处理 移取血液等液体检材样品1.0mL两份，按7.1.1进行操作，得到空白样品提取液，供仪器检测。 取与检材样品等量的相似基质空白样品， 与检材样品平行操作， 得到空白样品提取液， 供仪器检测。 取与检材样品等量的相似基质空白样品两份，添加夹竹桃苷、夹竹桃苷乙标准物质工作溶液，作为添加样品，与检材样品平行操作，得到添加样品提取液，供仪器检测。检材样品中目标物含量应在添加样品中目标物含量的（100 50）%范围内。 注：检材样品取样量、提取溶剂体积等可根据实际情况调整。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 同 7.1.2.1。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材样品提取液、空白样品提取液、添加样品提取液，按 7.1.2.1 仪器条件进样分析。每份检材样品提取液和添加样品提取液各进样分析 23 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 记录检材样品提取液和添加样品提取液中目标物的保留时间和峰面积值，按公式（1）计算检材样品中目标物的含量。 . (1) 式中： 检材样品中目标物的含量； A检材样品提取液中目标物的峰面积的平均值； A添加样品提取液中目标物的峰面积的平均值； 添加样品中目标物的含量。 GA/T 6 7.2.2.3.2 计算相对相差 记录 7.2.3.1 中计算得到的检材样品中目标物的含量，按公式（2）计算相对相差： 12100%-RD=.（2） 式中： RD相对相差，用百分比（%）表示； 1、 2两份检材样品中目标物的含量； X两份检材样品中目标物含量的平均值。 8 分析结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时， 检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准物质工作溶液一致 （相对误差在 2.5%之内） 、目标物的两对定性离子与标准物质工作溶液一致，且离子对丰度比与浓度接近的标准物质工作溶液相比，相对偏差不超过表 3 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的相关谱图和检出限参见附录 A。 表 3 离子对丰度比的最大允许相对偏差范围 离子对丰度比 50% 20%50% 10%20% 10% 最大允许相对偏差 20% 25% 30% 50% 8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与目标物标准物质工作溶液一致的色谱峰， 且添加样品中出现与目标物标准物质工作溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 8.2 定量结果评价 检材样品中目标物含量的RD20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。检材样品中目标物含量的RD20%，定量数据不可靠，应按7.2重新提取检验。 夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的相关参考资料参见附录 B。 GA/T 7 A A 附 录 A （资料性） 夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的相关谱图及检出限 A.1 夹竹桃苷二级质谱图见图 A.1。 图A.1 夹竹桃苷质谱图 A.2 夹竹桃苷乙二级质谱图见图A.2。 图A.2 夹竹桃苷乙质谱图 GA/T 8 A.3 夹竹桃苷MS/MS色谱图见图A.3。 图A.3 夹竹桃苷MS/MS色谱图 A.4 夹竹桃苷乙MS/MS色谱图见图A.4。 图A.4 夹竹桃苷乙MS/MS色谱图 A.5 LC-MS/MS分析，夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的检出限均为0.5ng/mL。 GA/T 9 附 录 B （资料性） 夹竹桃参考资料 B.1 中毒症状 夹竹桃（Nerium indicum.Mill)为夹竹桃属常绿灌木。现代医学研究证明，夹竹桃味苦性寒,具有强心、利尿、抗癌、抗炎、镇静安神等作用，但是夹竹桃的叶、皮、根、花均有毒，日常生活当中，常因药用或误服过量夹竹桃而出现头痛、头晕、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、谵语、甚则汗出肢厥、心律失常、直至休克死亡。夹竹桃叶对小鼠的 LD50为 2278.3mg/kg。 夹竹桃苷(Oleandriin)，C32H48O9，CAS 号 465-16-7，结构式见图 B.1。 夹竹桃苷乙(Adynerin)，C31H46O6，CAS 号 35109-934，结构式见图 B.2。 图 B.1 夹竹桃苷结构式 图 B.2 夹竹桃苷乙结构式 _