中药材甘草与远志的体外抑菌试验.pdf

化学与材料科学研究中药材甘草与远志的体外抑菌试验赵琴，惠瑞敏，杨改琴，刘晓燕，林颜博，雷晗露，马婷婷（咸阳师范学院 化学与化工学院，陕西 咸阳 712000）摘要：为研究中药材甘草与远志的体外抑菌活性，以大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌为供试菌，采用试管二倍稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)。结果显示，甘草对嗜水气单胞菌的抑菌效果最好，对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的MIC同为1 mg/mL。两个不同产地的远志药材抑菌效果有所差异，其中神木远志对金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌的抑菌效果比延安远志要好。甘草与远志对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌均有良好的抑菌活性，其中甘草可考虑应用于嗜水气单胞菌所引起的淡水养殖鱼疾病。关键词：甘草；远志；抑菌试验中图分类号：R282文献标识码：A文章编号：1672-2914（2023）04-0038-03In VitroAntibacterialActivity of GlycyrrhizaUralensis and Polygala TenuifoliaZHAO Qin,HUI Ruimin,YANG Gaiqin,LIU Xiaoyan,LIN Yanbo,LEI Hanlu,MA Tingting(School of Chemistry and Engineering,Xianyang Normal University,Xianyang 712000,Shaanxi,China)Abstract：In order to study the in vitro antibacterial activity of G.uralensis Fisch and P.tenuifoliaWilld,E.coli,S.aureus and A.hydrophila were used as test bacteria,and the minimum inhibitory con-centration(MIC)was determined by in vitro double dilution method.The results showed that G.uralen-sis Fisch had the best bacteriostatic effect on A.hydrophila,and the MIC value of G.uralensis Fisch onE.coli and S.aureus were both 1 mg/ml.There were some differences in the bacteriostatic effect of thetwo P.tenuifolia Willd from different locations.The bacteriostatic effect of the P.tenuifolia Willd fromShenmu on S.aureus and A.hydrophila was better than that from Yanan.G.uralensis Fisch and P.tenui-folia Willd have good antibacterial activities against E.coli,S.aureus and A.hydrophila.G.uralen-sis Fisch can be considered for use in freshwater aquaculture fish diseases caused byA.hydrophila.Key words：G.uralensis;P.tenuifolia;bacteriostatic effect收稿日期：2023-04-16基金项目：陕西省教育厅科研计划项目（21JK0965，20JK0973）。作者简介：赵 琴（1987），女，湖北荆州人，咸阳师范学院化学与化工学院讲师，博士，陕西高校青年创新团队“黄土高原道地药材品种选育与生态栽培创新团队”成员，研究方向为中草药。E-mail：。2023年7月咸阳师范学院学报Jul.2023第38卷 第4期Journal of Xianyang Normal UniversityVol.38 No.4从天然植物中去找寻杀菌和抑菌活性物质，是目前开发新型杀菌剂的一个方向。许多药理实验证明，中药材在抑菌方面具有良好效果1-3。抗生素是目前临床上治疗细菌感染的首选药物，但抗生素的滥用导致多重耐药菌的出现，中药材则在使用中较少产生耐药性，不易出现药物残留及毒副作用，更加安全可靠，具有抗生素所没有的优点4。近年来有关于植物源杀菌剂方面的研究越来越多，如麻黄和细辛中挥发油对植物病原真菌有较强抑制作用5，苦皮藤和白果中也分离出具有杀菌活性的化合物6-7。甘草（G.uralensis Fisch）是豆科、甘草属植物，在中国分布于东北、华北、西北各省区及山东，根和根状茎供药用。甘草除了补脾益气、润肺止咳、清热解毒和调和诸药等功效外，还用于咽喉肿痛、脾胃虚寒、消化性溃疡、中毒等症状8-9。远志（P.tenuifoliaWilld）产自我国东北、华北、西北和华中地区，为多年生草本，主根粗壮，韧皮部肉质，具有安神益智、祛痰、消肿等功效，可用于失眠多梦、健忘惊悸，咳痰不爽，疮疡肿毒，乳房肿痛10。本研究选取药材甘草和远志，研究其乙醇提取物体外抗大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌的效果。大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌分别为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的代表，嗜水气单胞菌是淡水鱼类常见致病菌11，通过对这三种细菌的抑菌试验，可以为开发天然抗菌药物提供线索。1 试验部分1.1 材料1.1.1试验菌种金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、大肠埃希氏菌（ATCC25922）、嗜水气单胞菌（ATCC35654）购自北京保藏生物科技有限公司。1.1.2 药材远志药材分别种植于陕西省神木市高家堡镇和延安市安塞区，甘草药材种植于陕西省商洛市洛南县。1.1.3主要试剂琼 脂 粉、酵 母 粉、胰 蛋 白 胨、二 甲 基 亚 砜（DMSO）、链霉素，购自陕西硕研化工科技有限公司；乙醇（分析纯）、氢氧化钠购自国药集团化学试剂有限公司。1.1.4主要仪器JFSD-100 粉碎机，上海淀久中药机械制造有限公司；JJ200型精密电子天平，美国双杰兄弟有限公司常熟双木测试仪器厂；HH-S数显恒温水浴锅，江苏省金坛市医疗仪器厂；RE-2000旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-III 型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂；生化培养箱SPX-250型，上海跃进医疗器械厂；ZKF035电热真空干燥箱，上海实验仪器厂有限公司；KQ5200B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；不锈钢手提式灭菌器，上海申安医疗器械厂；超净工作台，上海生物科技有限公司。1.2 药材提取物制备称取远志（神木）、远志（延安）、甘草（商洛）药材适量，使用粉碎机将药材粉碎至粉末状，过200目筛。称取以上药材粉末2 g，加入50 ml浓度为80%的乙醇浸泡4 h，放入超声仪中37 处理30 min，过滤，得滤液。将滤液用旋转蒸发器进行旋蒸，然后用70%DMSO溶液定容到50 ml，为药物原液，备用。1.3 试验菌的制备LB（Luria-Bertani）液体培养基：每1 L培养基含10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、10 g氯化钠。用5 mol/LNaOH调pH至7.0，121 高温灭菌20 min。LB固体培养基：每1 L培养基含10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、10 g氯化钠、15 g琼脂粉。用5 mol/L NaOH调pH至7.0，121 高温灭菌20 min。将大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌用LB液体培养基活化接种后，用LB固体培养基进行平板计数，根据计数结果将菌液浓度调整为105CFU/mL，用于试管二倍稀释法试验。1.4 试管二倍稀释法取无菌试管13支，在第1管加入1.6 mL LB液体培养基和抗菌药物原液0.4 mL混匀，然后依次二倍稀释至11管，第12管加入LB液体培养基1 mL，为不含药物的阴性对照，第13管加入LB液体培养基0.8 mL，250 g/mL氯霉素0.2 mL，为阳性对照。最后向13支试管中分别加入50 L供试菌液，将接种好的试管置37 摇床300 r/min培养20 h。试验结果以试管内澄清为无菌生长，试管内浑浊则为有菌生长，若某号试管澄清，其以下试管发生浑浊现象，则该试管的药液浓度为该药液对细菌的最小抑菌浓度（MIC）。2 结果与讨论2.1 对大肠埃希氏菌的抑菌试验试管二倍稀释法中各试管药物浓度最终见表1。试验结果如下：甘草药液对大肠埃希氏菌的MIC为1 mg/mL，神木远志和延安远志药液对大肠埃希氏菌的MIC相同，均为2 mg/mL。2.2 金黄色葡萄球菌的抑菌试验表2 是不同浓度中药对金黄色葡萄球菌生长情况影响的结果。由表2可知，甘草药液对金黄色葡萄球菌的MIC为1 mg/mL，神木远志药液对金黄色葡萄球菌的MIC为2 mg/mL，延安远志药液对金黄色葡萄球菌的MIC为4 mg/mL。药材远志（神木）远志（延安）甘草（商洛）中药提取液浓度/(mg/mL)8-4-2-1+-0.5+0.25+0.125+0.062 5+0.031 25+0.015 6+0.007 8+表1 不同浓度中药对大肠埃希氏菌生长情况影响的结果注：表示有细菌生成，试管内浑浊；-表示无细菌生成，试管内澄清。（下同）第4期赵琴，等：中药材甘草与远志的体外抑菌试验392.3 对嗜水气单胞菌的抑菌试验表3 是不同浓度中药对嗜水气单胞菌生长情况影响的结果。由表3可知，甘草药液对嗜水气单胞菌的MIC为0.5 mg/ml，神木远志药液对嗜水气单胞菌的MIC为4 mg/ml，延安远志药液对嗜水气单胞菌的MIC为8 mg/ml。从以上结果可以看出甘草抑菌效果强于远志。3 结论大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌为养殖生产中常见的病原菌，但由于抗生素的不规范使用造成病原菌耐药性的产生12-13，本试验为探求安全有效的抗生素替代药物，选择了甘草和远志药材，进行抑菌试验。总体上看，甘草的抑菌效果强于远志，在三种供试菌中，甘草对嗜水气单胞菌的抑菌效果最好，对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的MIC则相同。有研究表明甘草多糖、甘草酸和甘草中的一些黄酮类化合物是其抗炎、抗变应性炎症的活性成分14。根据本试验结果，甘草可应用于嗜水气单胞菌所引起的淡水养殖鱼疾病。为获得更好的防治效果，可将其与其他抗菌中药联合应用。远志选取了来自两个不同产地的药材，结果发现两种远志药材的抑菌效果有所差异，其中神木远志对金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌的抑菌效果比延安远志要好，两种远志药材对大肠埃希氏菌的MIC相同。可见药材产地对药材的药效会产生一定的影响，不同产地所特有的生态因子、栽培管理措施等与药材中化学成分的含量高低密切相关，从而对其抑菌能力造成影响。所以建立药材的规范化栽培，扩大道地产区对于药材的质量保证有重要意义。本研究结果为非抗生素治疗大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌所引起疾病的中草药筛选提供了一定的理论依据和参考。参考文献：1司红彬，吴永继，徐素萍，等.白头翁水提物与抗菌药联合对耐药大肠埃希菌作用研究J.动物医学进展，2015，36（11）：49-52.2王海娟，王利，苟小兰，等.中药复方对小肠结肠炎耶尔森菌的抑制作用及对其毒力基因ail的影响J.动物医学进展，2014，35（2）：41-44.3陈美安，甄汉深，裴渭静，等.抗畜禽支原体中草药筛选及细胞毒性研究J.动物医学进展，2014，35（4）：33-38.4芦亚君，程宁.3种中药方剂逆转大肠埃希菌耐药性的实验观察J.西北药学杂志，2007（6）：309-311.5张国珍，樊瑛，丁万隆，等.麻黄和细辛挥发油的抗真菌作用J.植物保护学报，1995，22（4）：373-375.6杨征敏，吴文君，王明安，等.苦皮藤假种皮的杀菌活性成分研究J.农药学学报，2001（2）：93-96.7孟召礼，董瑞端，高庆宵，等.白果提取液及抑菌作用J.农药，1987，10（6）：16-17.8张耀峰.甘草及其活性成分的药理活性研究进展J.中医临床研究，2019，11（9）：141-142.9于辉，李春香，宫凌涛，等.甘草的药理作用概述J.现代生物医学进展，2006，6（4）：77-79.10刘露，冯伟红，刘晓谦，等.中药远志的研究进展J.中国中药杂志，2021，46（22）：5744-5759.11陆承平.致病性嗜水气单胞菌及其所致鱼病综述J.水产学报，1992，16（3）：282-288.12ZAHRA R N，TAGHI Z S，IRADJ A T，et al.Evaluation ofantibiotic resistance and prevalence of common Salmonellaenterica serovars isolated from foodborne outbreaksJ.Mi-crochemical Journal，2020，155（3）：1-6.13OU C J，SHANG D Q，YANG J X，et al.Prevalence of mul-tidrug-resistant Staphylococcus aureus isolates with strongbiofilm formation ability among animal-based food in Shang-haiJ.Food Control，2020，112（C）：1-7.14杨洁红，张宇燕，万海同，等.附子生物碱与甘草活性物质组合抗大鼠佐剂性关节炎的实验研究J.中草药，2010，41（3）：439-444.药材远志（神木）远志（延安）甘草（商洛）中药提取液浓度/(mg/mL)8-4-2-+-1+-0.5+0.25+0.125+0.062 5+0.031 25+0.015 6+0.007 8+表2 不同浓度中药对金黄色葡萄球菌生长情况影响的结果药材远志（神木）远志（延安）甘草（商洛）中药提取液浓度/(mg/mL)8-4-+-2+-1+-0.5+-0.25+0.125+0.062 5+0.031 25+0.015 6+0.007 8+表3 不同浓度中药对嗜水气单胞菌生长情况影响的结果40咸阳师范学院学报第38卷