真核表达肝药酶UGT1A9可溶重组蛋白方法探索.pdf

第 卷第期 年月杭州师范大学学报（自然科学版）（）收稿日期：修回日期：基金项目：国家自然科学基金项目（）通信作者：童骏森（），男，副研究员，博士，主要从事结构生物学研究 ：犱 狅 犻：真核表达肝药酶犝 犌 犜 犃 可溶重组蛋白方法探索尹鑫俐，戚旭丹，涂予溪，陆茜，杨元，陈侠斌，童骏森（杭州师范大学药学院，浙江 杭州 ）摘要：葡萄糖醛酸基转移酶（）是人体重要的肝脏药物代谢酶，其底物选择性、催化机制等研究因难以获得可溶性全酶而受到限制本研究以制备 可溶重组蛋白为研究目标，通过筛选重组蛋白表达体系、融合标签种类及 长度，优化重组蛋白表达纯化条件和方法，实现了重组 的大量制备 细胞分泌表达的 （氨基酸 ）重组蛋白经 亲和纯化介质从培养基上清液中分离，洗脱产物经 、及 检测鉴定为目的蛋白，通过 法测得重组蛋白最终产量为，纯度达到 以上本研究建立了一种人源药物代谢酶 的可溶重组蛋白表达纯化方法，为 及 同工酶的药物代谢、催化机制及结构解析研究奠定基础关键词：药物代谢酶；真核表达；蛋白纯化中图分类号：文献标志码：文章编号：（）尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（，）是一类重要的代谢酶家族，在动物、植物以及微生物体内都有广泛分布人源 是人体二相代谢中的关键酶，具有糖基化功能，能将糖基供体如尿苷二磷酸葡萄醛酸（）上的糖基转移到外源或内源亲脂化合物上，使这些化合物的水溶性增强易于排出 不仅代谢花生四烯酸等内源性脂肪酸，还参与多种处方药如阿片类药物、抗癫痫药和抗病毒药物的糖醛酸化代谢，因此被认为是主要的药物代谢酶然而，人 是具有 个同工酶的超家族，同工酶之间序列相似、结构相近，对代谢底物的特异性情况复杂 代谢活性已被证实与高胆红素血症等代谢类疾病及多种癌症 密切相关，但其催化机制和底物选择性等研究一直因缺乏酶结构域的结构信息而难以深入人源 通过羧基端跨膜肽段定位于光滑内质网（）上 ，氨基端存在内质网信号肽，使其全酶结构域可溶重组蛋白的获得十分困难 ，尚未有完整 酶结构域全长三维结构被报道 通过 从头计算、同源建模等方法预测发现，人 酶结构域的氨基端柔性较强，构象不稳定，可能是造成可溶重组 制备困难的主要原因目前对 功能研究主要以研究肝微粒体（）重组蛋白原位表达的形式进行，尚未见到通过添加融合蛋白标签稳定三维构象提高溶解度的方法制备重组蛋白的研究报道而融合蛋白标签如 等，已被证实具有提高蛋白表达量和溶解度，增强稳定性的作用，因此，通过筛选优化表达系统并添加促溶标签对重组 的可溶蛋白制备具有积极意义人源 属于 同工酶超家族中的 家族 ，在人类肝脏和肾脏中大量表达 药物代谢酶 参与内源性雌激素 和甲状腺激素 的代谢，以及恩他卡朋、异丙酚和霉酚酸等多种治疗药物的代谢 对 及其家族 的重组蛋白功能研究，主要以肝微粒体形式进行，尚无 全酶结构域重组蛋白的表达纯化方法报道，导致无法通过结构生物学等手段明确其底物选择性的结构基础和催化反应的关键机制，以及准确测定对药物代谢的酶动力学常数本研究通过合成人源药物代谢酶 关键结构域基因，采用单酶切结合同源重组的方法，利用 和融合蛋白 进行修饰后，插入真核表达载体构建重组质粒 通过优化融合蛋白 和 之间 长度及蛋白纯化条件，成功建立一种高效的人源药物代谢酶 的真核表达及纯化方法，蛋白表达量可达 ，蛋白纯度在 以 上本研 究 为 后续 蛋白的药物代谢选择性研究及催化分子机制研究奠定基础材料与方法 实验材料 细胞及质粒大肠杆菌犈犮 狅 犾 犻 购于北京擎科生物科技有限公司对数生长期的 细胞购自永联生物科技（上海）有限公司目的基因 （：）由北京擎科生物科技有限公司合成质粒 是由本实验室改造并构建，所含抗性为氨苄青霉素抗性 主要试剂及仪器分子克隆过程中所用 购自日本 公司，限制性内切酶犅 犪 犿 购于美国 公司，限制性内切酶犖 犺 犲购于碧云天生物技术公司 细胞基础培养基购自永联生物科技（上海）有限公司；无血清培养基购自美国 公司；聚乙烯亚胺（）购自美国 公司 购自江苏亲科生物研究中心有限公司；购自杭州宝科生物科技有限公司 、凝胶回收试剂盒及质粒抽提试剂盒均购于南京诺唯赞生物科技有限公司核苷酸引物合成和 测序由北京擎科生物科技有限公司完成亲和层析介质 购自生工生物工程（上海）股份有限公司酶标仪为 公司仪器；接触成像仪为 公司仪器；质谱仪为 公司仪器 实验方法 蛋白的生物信息学预测分析根据美国生物技术信息中心（）数据库 ，获得 蛋白的氨基酸全长序列（位氨基酸），使用 （：）预测蛋白的相对分子质量、等电点、的消光系数等基本理化性质用 软件同源建模得到 的全长三维结构，在软件 （：）中分析蛋白结构特点 目的基因 的 扩增及 质粒线性化根据 上 氨基酸序列，人工合成哺乳动物细胞密码子优化的基因序列，用该基因序列设计克隆 引物含犅 犪 犿 酶切位点（）的上游引物序列：；下 游 引 物 序 列：含犖 犺 犲酶切位点（）的上游引物序列：；下游引物序列：以人工合成的全长 的 为模板，进行 扩增，反应条件：预变性 ；变性，退火，延伸，共 个循环；再延杭州师范大学学报（自然科学版）年伸 质粒 分别使用犖 犺 犲、犅 犪 犿 单酶切线性化，反应条件：水浴锅反应酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，进行切胶回收 重组质粒的构建、转化与表达鉴定将 扩增得到的目的基因片段和线性化载体用犇 狆 狀酶消化去除模板 后，参照 重组酶（）的说明书构建重组 质 粒，反 应条 件 为 ，目的 蛋白 的 末端用个组氨酸标签、融合蛋白 及 蛋白酶裂解位点（）依次标记转入酶连产物的大肠杆菌 感受态细胞涂布在含有氨苄青霉素（）的 平板上，培养过夜次日挑取单个菌落接种到 含有氨苄青霉素的 液体培养基中，震荡培养至 为 后进行菌落 验证重组质粒，并通过菌液测序进一步确定序列的正确性 蛋白表达及纯化采用聚乙烯亚胺（）为转染试剂（质量浓度：），与质粒的比例为 将重组真核表达载体转染 ，转染时用无血清培养基稀释转染试剂和质粒，后开始收集细胞上清液将上清液与 介质混合并于孵育，然后用倍柱体积的裂解缓冲液（，咪唑）清洗介质以除去杂蛋白用洗脱缓冲液（，咪唑）洗脱目的蛋白浓缩目的蛋白，采用 法测定蛋白浓度，目的蛋白经 电泳，用考马斯亮蓝染色法鉴定其位置大小与纯度，用于后续研究 目的蛋白 鉴定蛋白经 电泳分离后，电转至聚偏二氟乙烯（）膜（电转条件为 ，）脱脂奶粉室温封闭；弃封闭液，加入 抗体（小鼠单抗），于摇床孵育过夜；封闭过夜的 膜用 缓冲液洗涤次，次加入 抗体室温孵育，弃二抗液体，用 缓冲液洗涤次，次 膜上均匀滴加 发光液，用 接触式化学发光成像系统进行扫描成像 目的蛋白 鉴定蛋白样品采用 胶进行电泳分离，将目的蛋白的胶条切下溶解后采用胰蛋白酶酶切质谱仪扫描所有生成的肽段离子并记录各级质谱的质荷比（）和丰度序列数据库搜索软件以实验质谱数据与计算机模拟的理论酶切质谱数据相比较，通过计算机模拟理论酶切并设置过滤参数从而得到目标序列搜库软件比对实验谱图和理论谱图之后给出带有打分值的覆盖率（）以及肽段谱图匹配（，）数据，其打分值标识出实验数据的可信度结果与分析 犝 犌 犜 犃 蛋白生物信息学分析 蛋白全长 个氨基酸，计算可知其相对分子质量约为 ，等电点为 ，波长下的消光系数为 实验表明，全长重组蛋白在大肠杆菌表达体系中以不溶的包涵体形式存在，该结果与文献调研结果一致用 软件同源建模得到 的全长三维结构，并在软件 （：）中分析蛋白结构特点 全长序列信息如图所示，实验克隆人源 关键结构域部分（氨基酸：）进行研究，该部分包含其结合不同底物及糖基供体的功能口袋图人源犝 犌 犜 犃 全长序列信息犉 犻 犵 犎 狌 犿 犪 狀犝 犌 犜 犃 犳 狌 犾 犾 犾 犲 狀 犵 狋 犺狊 犲 狇 狌 犲 狀 犮 犲 犻 狀 犳 狅 狉 犿 犪 狋 犻 狅 狀第期尹鑫俐，等：真核表达肝药酶 可溶重组蛋白方法探索 重组质粒设计图重组质粒信息犉 犻 犵 犚 犲 犮 狅 犿 犫 犻 狀 犪 狀 狋狆 犾 犪 狊 犿 犻 犱 犻 狀 犳 狅 狉 犿 犪 狋 犻 狅 狀 融合蛋白不仅促进了重组 的表达，并且能够较好地稳定 的氨基端区域通过酶切去除 后，部分快速降解，失去三维构象因此，研究通过优化融合蛋白 与目的蛋白 之间 长度，来提高目的蛋白表达量实验利用单酶切结合 同 源 重 组 的 方 法，利 用 载 体 上犖 犺 犲、犅 犪 犿 酶切位点，分别成功构建质粒 （犖 犺 犲）及 （犅 犪 犿）二者区别在于限制性内切酶犖 犺 犲构建的质粒中 与目的蛋白之间 长度为个氨基酸，而限制性内切酶犅 犪 犿 构建的质粒中 与目的蛋白之间 长度为 个氨基酸，设计构建的重组质粒信息见图 重组质粒构建利用特异性引物，以哺乳动物细胞 密码子优化的 全长序列为模板，分别完成以犖 犺 犲、犅 犪 犿 为酶切位点的 （氨基酸：）基因扩增质粒 分别使用犖 犺 犲、犅 犪 犿 单酶切线性化（图）扩增产物及线性化的载体经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，利用同源重组法（，）进行连接成功转化大肠杆菌 感受态细胞后次日挑取单克隆，菌落 验证重组质粒（图），琼脂糖凝胶电泳胶图可见 基因的片段长度（）与预期一致，说明重组质粒构建成功完成测序结果比对后，将构建成功的重组质粒进行蛋白表达及纯化使用限制性内切酶犖 犺 犲；标准相对分子质量；使用限制性内切酶犅 犪 犿 质粒 线性化 标准相对分子质量；基因片段（犖 犺 犲）；基因片段（犅 犪 犿）阳性单克隆菌落 结果图重组质粒构建结果犉 犻 犵 犚 犲 犮 狅 犿 犫 犻 狀 犪 狀 狋狆 犾 犪 狊 犿 犻 犱犮 狅 狀 狊 狋 狉 狌 犮 狋 犻 狅 狀狉 犲 狊 狌 犾 狋 狊 重组人源犝 犌 犜 犃 蛋白纯化对重组人源 进行蛋白纯化，结果如图所示培养基泳道中未见目的蛋白条带，说明培养基杭州师范大学学报（自然科学版）年中蛋白表达量较低；洗脱液泳道中可见明显目的蛋白条带（箭头指向），可知蛋白纯度大于 且相对分子质量符合预期（），说明目的蛋白与介质 亲和能力较好对比融合蛋白 与 之间 长度为 个氨基酸（图）及个氨基酸（图）时的结果，发现 长度为 个时，洗脱液中目的蛋白存在一定的降解现象利用 法对浓缩后的洗脱液分别进行浓度测定，对比两种不同质粒的蛋白产量，可知 长度为 个氨基酸时，蛋白表达量约为 ；而 长度为个氨基酸时，蛋白表达量约为 实验结果表明，减小融合蛋白 与目的蛋白 之间 长度更有利于目的蛋白的表达及稳定蛋白质标准相对分子质量；细胞上清；细胞；流穿；洗脱液转染质粒为 （犅 犪 犿）；转染质粒为 （犖 犺 犲）图人源犝 犌 犜 犃 蛋白纯化及各组分鉴定犉 犻 犵 犘 狌 狉 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱 犻 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犺 狌 犿 犪 狀犝 犌 犜 犃 狆 狉 狅 狋 犲 犻 狀狑 犻 狋 犺犲 犪 犮 犺犮 狅 犿 狆 狅 狀 犲 狀 狋 重组人源犝 犌 犜 犃 蛋白犠 犲 狊 狋 犲 狉 狀犫 犾 狅 狋鉴定蛋白纯化过程中各组分利用鼠源 单克隆抗体及辣根过氧化酶（）标记的鼠二抗，进行 鉴定从结果可知，两个质粒的细胞上清中均未检测到目的蛋白，而洗脱液中均可见相对分子质量约 的目的蛋白条带（图）结果表明洗脱液中的 蛋白带有 标签且相对分子质量大小与预期一致蛋白质标准相对分子质量；细胞上清；细胞；流穿；洗脱液转染质粒为 （犅 犪 犿）；转染质粒为 （犖 犺 犲）图人源犝 犌 犜 犃 犠 犲 狊 狋 犲 狉 狀犫 犾 狅 狋鉴定犉 犻 犵 犐 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犺 狌 犿 犪 狀犝 犌 犜 犃 狆 狉 狅 狋 犲 犻 狀狌 狊 犻 狀 犵犠 犲 狊 狋 犲 狉 狀犫 犾 狅 狋 重组人源犝 犌 犜 犃 蛋白质谱鉴定纯化所得的药物代谢酶 经 电泳及 验证后，进一步采取质谱检测方法对其进行验证从质谱检测结果可知（表），通过质谱打出的肽段的测量数据和质谱里本身具有的一个肽段和片段的数据库比对，给出的 值为 ，说明质谱数据和数据库中的数据十分吻合，该质谱打出的片段是数据库中记录的片段的可能性极高同时，搜库软件通过数据库里的多肽和质谱图进行比对之后给的 值为 ，值越高表明结果的可信度相对越高因此，经质谱验证后，纯化所得的第期尹鑫俐，等：真核表达肝药酶 可溶重组蛋白方法探索目的蛋白确实为重组人源药物代谢酶 表质谱验证重组蛋白犝 犌 犜 犃 犜 犪 犫 犞 犲 狉 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 狉 犲 犮 狅 犿 犫 犻 狀 犪 狀 狋狆 狉 狅 狋 犲 犻 狀犝 犌 犜 犃 狌 狊 犻 狀 犵犕 犛蛋白名称蛋白得分覆盖率总肽段数独特肽段数肽匹配图谱 讨论人源尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶 作为人体二相代谢过程中的关键酶，能代谢多种进入人体的药物，包括恩他卡朋、异丙酚和霉酚酸等全长 蛋白本身含有两个不同的发挥功能的区域，氨基端部分发挥与底物结合的功能，结构上存在不稳定性；而其羧基端部分发挥与糖基供体 结合的功能，结构上相对稳定目前，由于缺乏人源药物代谢酶 可溶重组蛋白，限制了对其底物进行准确酶活性测定的方法，同时也制约了其结构解析、药物代谢选择性以及催化分子机制的研究本研究通过克隆人源 基因，利用单酶切结合同源重组的方法完成重组质粒构建并进行相应优化，同时采用融合蛋白 与其共表达的方式，最终成功在哺乳动物细胞 中获得可溶的人源重组 蛋白，蛋白表达量可达，蛋白纯度大于 所获目的蛋白经 验证及质谱鉴定，鉴定结果准确无误近年来，清楚了解药物与靶标的作用模式成为新药开发的重点，而可溶重组蛋白的获得是其至关重要的一步本研究将继续致力于人源药物代谢酶 与不同药物相互作用的研究，为其结构、功能及应用研究奠定基础参考文献：，（）：?，?，?，（）：，（），：，：，（），（）：，：（），（）：，：，：，：，（）：，（）：，：，：，：，：，（）：，（）：，杭州师范大学学报（自然科学版）年 ，（）：，犻 狀狏 犻 狋 狉 狅 犻 狀狏 犻 狏 狅 ，：，：，（）：，犻 狀狏 犻 狋 狉 狅 ，：，（），（）：，（）：，：（）（），（）：，?，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：犈 狓 狆 犾 狅 狉 犪 狋 犻 狅 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