中性粒细胞胞外诱捕网在肝移植术后并发症诊疗中的作用.pdf

综述中性粒细胞胞外诱捕网在肝移植术后并发症诊疗中的作用刘彦尧秦小琰吴忠均【摘要】肝移植术后并发症的防治对于维护移植肝功能，改善移植受者预后至关重要。中性粒细胞胞外诱捕网（NET）是由中性粒细胞激活后释放到胞外的一种以 DNA 为骨架，多种组蛋白和颗粒蛋白构成的纤维网状结构，研究表明肝移植术后供肝内中性粒细胞激活和 NET 的释放参与了包括缺血-再灌注损伤、急性排斥反应、急性肝衰竭和肝细胞癌复发在内的多种肝移植相关并发症的发生。本文将重点探讨 NET 对肝移植术后并发症的影响，详述 NET 作为肝移植术后并发症防治潜在靶点的研究进展，以期为肝移植受者术后并发症的防治提供参考，提高临床肝移植疗效，改善肝移植受者预后。【关键词】肝移植；中性粒细胞胞外诱捕网；缺血-再灌注损伤；急性排斥反应；急性肝衰竭；肝细胞癌；肽基精氨酸脱亚胺酶 4（PAD4）；髓过氧化物酶（MPO）【中图分类号】R617,R392.12【文献标志码】A【文章编号】1674-7445（2023）05-0015-09The role of neutrophil extracellular trap in the diagnosis and treatment of complications after liver transplantationLiu Yanyao*,Qin Xiaoyan,Wu Zhongjun.*Department of Hepatobiliary Surgery,the First Affiliated Hospital of Chongqing MedicalUniversity,Chongqing 400016,ChinaCorresponding author:Wu Zhongjun,Email:【Abstract】Prevention and treatment of complications after liver transplantation play a significant role inmaintaininglivergraftfunctionandimprovingclinicalprognosisoftherecipients.Neutrophilextracellulartrap(NET)arefibrousnet-likestructurescomposedofDNAastheskeletonandhistonesandgranularproteinsreleasedbyactivatedneutrophils.Studies have shown that the activation of neutrophils and the release of NET in donor liver after livertransplantationareinvolvedintheincidenceofmultiplelivertransplantation-relatedcomplicationsincludingischemia-reperfusioninjury,acuterejection,acuteliverfailureandrecurrenceofhepatocellularcarcinoma,etc.Inthisarticle,theeffectofNETonthecomplicationsafterlivertransplantationwasmainlyassessed,andresearchprogressonNETasapotentialtargetforthepreventionandtreatmentofcomplicationsafterlivertransplantationwasreviewed,aimingtoprovidereferenceforthepreventionandtreatmentofcomplicationsafterlivertransplantation,enhanceclinicalefficacyoflivertransplantationandimproveclinicalprognosisoftherecipients.【Key words】Livertransplantation;Neutrophilextracellulartrap;Ischemia-reperfusioninjury;Acuterejection;Acuteliverfailure;Hepatocellularcarcinoma;Peptideargininedeiminase4(PAD4);Myeloperoxidase(MPO)DOI:10.3969/j.issn.1674-7445.2023093基金项目：国家自然科学基金（82170666）；重庆医科大学附属第一医院博士后培育项目（CYYY-BSHPYXM-202303）作者单位：400016重庆，重庆医科大学附属第一医院肝胆外科（刘彦尧、吴忠均）；重庆医科大学附属儿童医院渝中院区普通创伤外科（秦小琰）作者简介：刘彦尧（ORCID：0000-0002-2130-2716），博士研究生，住院医师，研究方向为肝移植、肝移植术后免疫损伤，Email：通信作者：吴忠均（ORCID：0000-0002-1627-0633），博士研究生导师，主任医师，研究方向为肝移植、肝移植术后免疫损伤，Email:第 14 卷第 5 期器官移植Vol.14No.52023 年 9 月Organ TransplantationSep.2023肝移植是各种终末期肝病的唯一有效治疗手段1。随着肝移植术式逐渐成熟，移植效果不断提高，但包括缺血-再灌注损伤（ischemic-reperfusioninjury，IRI）、急性排斥反应、急性肝衰竭（acuteliverfailure，ALF）、肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）复发等在内的肝移植术后并发症仍是影响移植受者长期生存的重要原因之一，研究肝移植术后相关并发症的发生机制和防治策略是提高肝移植受者临床疗效的关键2-3。中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophilextracellulartrap，NET）是由中性粒细胞激活后释放到胞外的一种以 DNA 为骨架，多种组蛋白和颗粒蛋白构成的纤维网状结构，NET 一方面能够捕获和杀灭病原体并局限感染部位，是炎症和感染早期的关键免疫调节器，另一方面，NET 的过量产生和清除障碍能诱导多种肿瘤、炎症与免疫相关疾病的发生4-5。最新的研究表明，NET 在供肝中的异常沉积可能加重了肝移植术后的病理改变，并与多种肝移植术后并发症的发生密切相关6-7。本文将综述 NET 与肝移植术后并发症的最新研究进展，并探讨 NET 作为肝移植术后相关并发症防治靶点的潜力，为肝移植受者术后并发症的防治提供新思路、新见解。1NET 的形成、功能和检测1.1 NET 的形成早在 2004 年，Brinkmann 及其同事发现，中性粒细胞在受到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激后，染色质解聚，DNA 由胞内释放到胞外形成网状结构，该结构包裹大量颗粒蛋白和组蛋白，这种由 DNA、组蛋白和颗粒蛋白组成的细胞外网状结构被证实具有强大的诱捕和杀死细菌的能力，而中性粒细胞激活后形成 NET 的过程被称为网捕死亡（NETosis）8-9。此后的数十年随着 NET 相关研究的深入，对其功能和形成机制的研究已逐渐清晰，目前主流的观点认为 NET 的形成主要包括 3 种途径：自杀式 NETosis、非溶解性 NETosis 和线粒体NETosis10。自杀性 NETosis 的特点为中性粒细胞受到包括细菌、真菌、LPS 和佛波酯等刺激后，细胞内大量产生活性氧簇（reactiveoxygenspecies，ROS），肽基精氨酸脱亚胺酶 4（peptidylargininedeiminase4，PAD4）被激活，PAD4 随即将组蛋白上的精氨酸残基转化为瓜氨酸，诱导染色质解聚，与此同时中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophilelastase，NE）和髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）也从胞外移动到胞核内协助参与染色质解聚。中性粒细胞的细胞膜破裂，染色质解聚后形成的单链 DNA 包裹组蛋白并释放到胞外形成早期 NET。在此过程中烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamideadeninedinucleotidephosphate，NADPH）氧化酶活性和下游 ROS 的形成以及 PAD4 的激活对 NET 的形成至关重要11-13。非溶解性 NETosis 的特点为中性粒细胞膜受体 Toll 样受体（Toll-likereceptor，TLR）-2/TLR-4 被理化刺激激活后，PAD4 入核诱导组蛋白发生瓜氨酸化，继而解开 DNA 双链，中性粒细胞的细胞核和细胞膜均保持完整，细胞通过胞吐作用将包裹抑菌蛋白和组蛋白的 DNA 链释放到胞外发挥抗菌和免疫作用，此时中性粒细胞仍能在缺失细胞核 DNA 的情况下完成吞噬杀菌等一系列生理生化功能14-16。线粒体 NETosis 是近年来发现的一种 NET 形成的新途径，有研究表明中性粒细胞被激活早期存在不依赖 ROS 形成的线粒体内的 DNA 释放，但也有不同的观点认为线粒体来源的 NET 形成依赖于 ROS，采用 ROS 抑制剂可以抑制线粒体 NETosis，且目前尚不清楚 PAD4 激活和线粒体内 DNA 的释放是否存在相关性，线粒体NETosis 的具体机制仍有待进一步研究17-18。1.2 NET 的功能早期的研究表明 NET 的网状结构可以包裹细菌、病毒、真菌，并释放组蛋白和抗菌蛋白杀灭病原菌，限制感染范围19。尽管 NET 在感染早期展现出良好的抗感染能力，但越来越多的研究均发现NET 在体内的过度沉积和清除障碍可能导致胃肠道、肝脏、肺等实体器官不同程度的损伤20-21。一项中性粒细胞和结肠腺癌细胞共培养的体外研究表明，NET 可以通过与肠上皮细胞蛋白酶结合从而诱导细胞损伤22。另一项研究表明，肠道内的 NET 可以通过损伤肠黏膜屏障导致肠道致病菌的易位，从而引起肠道损伤23。研究人员还发现 NET 可以通过诱导肺内微血栓形成，加重炎症相关的急性肺损伤24。基于上述研究发现，目前主流的观点认为 NET 对于机体的免疫功能具有双向调节的作用，NET 的过度沉积可以导致靶器官的炎症反应和免疫损伤25。近年来的研究证据表明，手术应激，特别是肝切除和肝移植过程中固有免疫激活诱导的 NET 形成，加重了术后肝脏的免疫损伤26。Yazdani 等27的研究发现，白细胞第 5 期刘彦尧等中性粒细胞胞外诱捕网在肝移植术后并发症诊疗中的作用737 介素（interleukin，IL）-33 可以通过诱导 NET 形成加重肝 IRI 后的无菌性炎症反应。随着相关研究的深入，NET 在血栓形成过程中的关键作用也受到了广泛关注。研究指出，NET 在人类和啮齿类动物的血栓中广泛存在，NET 为纤维蛋白原、血小板和红细胞在血管内的沉积提供了结构支架28。也有观点认为 NET 不仅为血栓形成过程中的其他必要组分在血管内的沉积提供了结构支撑，NET 本身包裹的组蛋白等成分同样可以激活内源性和外源性凝血途径，诱导血栓形成29。NET 不仅与免疫损伤和血栓形成密切相关，大量证据表明 NET在肿瘤的复发和转移中也扮演了重要的角色30-31。NET 可以通过促进上皮细胞-间充质细胞转化加速肿瘤细胞远处转移，NET 的网状结构还能捕获循环系统中的肿瘤细胞，并协助肿瘤细胞远端定植32。1.3 NET 的检测随着相关研究的深入，NET 在免疫和炎症中的重要性已被逐渐揭示，但由于其胞外网状结构的特殊性，NET 的定位与检测仍是制约其相关研究的关键瓶颈之一，因此研发 NETosis 标志物并开发高灵敏度和特异度的定量检测策略至关重要33。免疫荧光染色共定位的方式检测 NET 的定位与相对表达量是目前NET 相关研究最常用的方法之一，多数团队建议至少对 3 个关键的 NET 成分（细胞外 DNA、NE 和组蛋白）进行共定位，这种定位方式有助于将 NET 和细胞死亡裂解后释放到胞外的 DNA 有效地区分开来34。有研究指出，SYTOXGreen 染色相较于 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色对细胞外 DNA 的检测特异性更好35。尽管免疫荧光染色实验方法简单，定位清晰，但对NET 的形成情况难以量化评估，有部分研究通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmuneabsorbentassay，ELISA）对 NET 的特异性标志物 瓜氨酸化组蛋白 H3（citrullinatedhistoneH3，H3Cit）、MPO、NE 进行检测，以此从一定程度上反映 NET 的表达量，但仍不能做到精确定量36。近年来流式细胞术被开发并应用于体外 NET 的检测，Zhao 等37使用多光谱成像流式细胞术通过标记 NET 形成过程中肿胀的中性粒细胞胞核，从而检测 NET 的形成。Gavillet 等38采用流式细胞仪检测 NET 表面 MPO 和 H3Cit 的共表达，从而对 NET 进行定量研究。在不断探索新的NET 检测方法的同时，对 NET 特异性染料的研究也在同步推进中。最新的报道称，一种新型的细胞染料 CDr15 不渗透入细胞膜并可以与 NET 胞外的DNA 特异性结合产生强烈的免疫荧光信号，相较于SYTOXGreen，该染料的背景荧光更低，与 NET 结合的特异性更高，有望为体内外 NET 的定位与定量提供帮助39。2NET 与肝移植术后并发症的诊断及治疗2.1 NET 与肝 IRI随着肝移植技术的不断成熟，肝移植受者的预后逐年提高，但 IRI 作为肝移植术后难以避免的重要并发症之一，是术后移植物失功甚至导致受者死亡的主要原因40。移植术中供肝缺血缺氧，供肝三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）合成减少，ROS、血管活性物质和促炎因子大量分泌，细胞内钙离子浓度上升，进一步诱导细胞凋亡和坏死。供肝再灌注后，富氧血液诱导 ROS 产生，中性粒细胞被激活并淤积于供肝内加重肝损伤41。随着 NET 在 IRI 中的作用被逐渐重视，多项研究均提示 NET 可能参与并加重了肝 IRI42-44。在肝 IRI 小鼠肝脏中存在中性粒细胞淤积和 NET 沉积，且 NET 的形成与富组氨酸糖蛋白表达呈负相关，给予小鼠口服补充富组氨酸糖蛋白治疗可以抑制肝脏中性粒细胞的浸润和 NET 形成45。另两项研究指出，NET 加重了小鼠的肝 IRI，羟氯喹和别嘌呤醇可以通过抑制 NET 形成缓解小鼠模型中的肝 IRI。最新的研究表明，靶向调控 NADPH 氧化酶（NADPHoxidase，NOX）2 和 P38/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）信号通路可以抑制 NET 的形成，改善术后肝脏的功能46-47。笔者团队前期研究发现，作为川芎的主要提取化合物之一的川芎嗪可以通过抑制 NOX 活性，减少肝移植大鼠供肝内 NET 形成，改善供肝功能，缓解肝移植术后 IRI48。笔者团队另一项研究发现，重组人凝血调节蛋白可以通过调控 TLR-4/MAPK 信号轴减轻肝移植术后中性粒细胞的浸润并抑制 NET 的形成，最终缓解肝移植术后 IRI49。尽管上述的研究均提示 NET 参与了肝移植术后 IRI，但其功能和具体分子机制仍有待进一步研究。2.2 NET 与肝移植急性排斥反应急性排斥反应是肝移植术后的常见并发症之一，25%50%的肝移植受者术后均发生过至少一次不同程度的急性排斥反应50。有证据表明，随着临床上免738器官移植第 14 卷疫抑制药的大量应用，急性排斥反应的发生率明显降低，但免疫抑制药的应用仍存在较多局限性，过量使用免疫抑制药可能导致严重的不良反应，例如肝肾损伤、代谢紊乱综合征和肿瘤复发等，严重影响受者的预后51-52。因此早期诊断肝移植急性排斥反应的发生，寻找新的、特异的肝移植急性排斥反应的防治靶点显得尤为重要。近期的研究发现，肝移植术后供者来源性细胞游离 DNA（donor-derivedcell-freeDNA，dd-cfDNA）因肝细胞受损被释放到血清中，成为一种新型的无创生物标志物用以评估供肝功能状态、预测急性排斥反应的发生风险53。Schtz 等54收集了107 例肝移植受者的血清并检测了其中 dd-cfDNA 的表达水平，发现与健康对照组相比，急性排斥反应受者的血清 dd-cfDNA 水平升高，且相较于传统的转氨酶对急性排斥反应诊断的特异性更好55。笔者团队围绕 NET 在肝移植急性排斥反应中的作用及具体机制进行了初步的探讨，通过分析肝移植受者血清中NET的表达水平发现，肝移植术后早期血清中 NET 表达水平明显升高，随着术后恢复时间的延长，NET 表达水平逐渐下降并趋于稳定。术后发生急性排斥反应的受者血清中 NET 的表达水平显著升高，且在使用免疫抑制药控制急性排斥反应后 NET 表达水平逐渐下降。在体外实验中发现，NET 一方面可以诱导Kupffer 细胞的 M1 型极化和胞内高迁移率族蛋白 1（highmobilitygroupbox1，HMGB1）的胞外易位，另一方面 HMGB1 可以激活中性粒细胞 TLR-4/MAPK 信号通路，诱导 NET 形成。在大鼠肝移植模型中，这种中性粒细胞和 Kupffer 细胞之间的正反馈环的存在进一步放大了供肝内的炎症信号，加重了急性排斥反应，NET 有望成为肝移植术后急性排斥反应诊疗的新靶点56。2.3 NET 与 ALFALF 是一种临床上常见的病死率极高的危急重症，约超过 25%的患者需要行肝移植治疗以挽救生命57。肝移植术后 ALF 更是严重危及患者生命，早期识别和预防 ALF 对于提高肝移植受者的预后至关重要。Ye 等58发现，在 ALF 小鼠模型肝脏中有大量中性粒细胞浸润和 NET 形成，使用 NE 蛋白抑制剂预处理可以通过减轻肝脏中性粒细胞淤积，抑制NET 形成，减轻肝脏氧化应激水平，减少肝细胞坏死，最终缓解小鼠 ALF。近期的一项研究发现，676 例 ALF 患者血浆中 dd-cfDNA 和 NET 的表达量分别是对照组的 7.1 倍和 2.5 倍，NET 的表达量越高患者的预后相对越差，需要紧急行肝移植术的ALF 患者，血浆中 NET 的表达量相较于一般 ALF 患者高出 30%，且在穿刺活组织检查的肝组织中明确发现大量 NET 沉积59。但另一项研究发现，ALF 患者30d 内病死率与血浆中 dd-cfDNA 的表达水平有关，与 NET 的表达水平无关，NET 作为 ALF 临床筛查标志物的灵敏度和特异度均不高60。两个独立的队列研究的结论相悖可能是因为研究队列样本量太小，且均局限于 ALF 患者血浆中 NET 表达量的相关研究，忽略了 NET 在肝脏中炎症反应和微血栓形成方面的功能及机制探索，未来需要更多相关基础与临床研究以提高我们对 NET 在 ALF 发病机制和进展中作用的理解，为进一步深入探索 ALF 的诊疗新靶点提供研究思路和实验基础。2.4 NET 与 HCC 的复发和转移HCC 是一类高病死率的原发性肝癌，占肝移植受者的 40%以上，HCC 肝移植术后复发是导致此类肝移植受者预后不佳和死亡的主要原因之一61-62。大量研究证实，甲胎蛋白浓度、肿瘤直径、大血管侵犯、边缘供肝的应用和扩大标准后的肝移植均是导致肝移植术后 HCC 复发的重要因素63。有报道指出，术前血清乙型肝炎病毒载量和术后营养指数均可用于预测肝移植术后的 HCC 复发，但相关研究均是小样本量的回顾性研究，缺乏分子生物学的证据，存在明显的局限性64-65。近年来 NET 在包括 HCC、胃癌、乳腺癌在内的各类肿瘤样本中被相继检出，进一步研究发现 NET 在肿瘤细胞免疫逃逸和肿瘤免疫微环境的形成与维持中发挥了至关重要的作用66-67。NET 可以通过激活休眠状态下的肿瘤细胞，并诱导癌组织与癌旁组织释放过量的促炎因子，加速肿瘤细胞的增殖与迁移，提高肿瘤细胞的侵袭性68。另有研究指出，NET 可以通过激活基质金属蛋白酶，激活肿瘤相关巨噬细胞释放多种促炎因子，最终导致免疫逃逸和肿瘤远处转移69。Najmeh 等70发现，整合素 1 能协助 NET 捕获循环系统中的肺癌细胞，导致肿瘤转移。另一项研究同样发现，在小鼠肺癌模型循环系统中存在被 NET 包裹的肺癌细胞，由此推测 NET 在肿瘤远处转移过程中可能扮演了“邮递包裹”的作用71。除此之外，一项 HCC 的回顾性研究发现，肝移植术后体内高水平的 NET 表达提示可能存在的较短的无复发生存期和总生存期。术前血清中 NET 的表达水第 5 期刘彦尧等中性粒细胞胞外诱捕网在肝移植术后并发症诊疗中的作用739 平有助于识别高风险的术后 HCC 复发患者，帮助临床医师提前制定更合理的治疗方案以提高患者的预后72。Cheng 等73通过水凝胶给药系统破坏NET 结构后发现，抑制 NET 表达可以预防肝切除或肝移植术后的 HCC 复发和转移。上述研究均证实，NET 在肿瘤侵袭、迁移中发挥了关键作用，相信随着 NET 与肝移植术后 HCC 复发和转移相关机制研究的深入，有望为缓解肝移植术后 HCC 复发提供新靶点、新思路。3NET 相关治疗靶点鉴于 NET 在众多炎症与免疫相关疾病中的驱动作用，越来越多的研究聚焦于以 NET 为治疗靶点防治相关疾病，但考虑到 NET 对于机体感染早期具有一定的保护作用，干预 NET 可能会增加机体感染的风险33。其次，NET 降解后包裹在 NET 中的组蛋白和颗粒蛋白大量释放，可能诱发机体的炎症级联反应，故主流的研究观点认为以 NET 为干预靶点的研究需要综合评估疾病类型和机体的免疫状态，合理选择靶向治疗方式74。目前针对 NET 的靶向治疗主要可分为两类：一类是对已生成的 NET 进行裂解，另一类是 NET 形成抑制剂。对已生成的 NET 进行 裂 解 的 研 究 最 为 广 泛，脱 氧 核 糖 核 苷 酸（deoxyribonuclease，DNase）是目前应用最广泛的 NET 裂解剂，研究发现 DNase能部分裂解NET，并且启动溶栓反应，使用 DNase干预小鼠模型可以有效预防复发性卒中、心肌梗死和深静脉血栓形成，也有报道指出低分子量肝素同样可以裂解NET，降低血栓形成风险75-76。近年来，以抑制NET 形成为研究策略的相关研究也在加速推进中，已有研究发现 Cl-amidine 是一类作用广泛的 PAD4 抑制剂，它可以通过抑制中性粒细胞内 PAD4 活性，降低组蛋白的瓜氨酸化水平从而抑制 NET 的形成，且有研究表明抑制小鼠体内的 PAD4 活性不会增加细菌的感染风险 7 7。由英国葛兰素史克公司研发的GSK484 和 BMS-P5 已在多项体内外实验中被证实对NET 形成的良好抑制作用，但其体内应用的安全性仍有待进一步验证78-79。作为 NET 形成关键组成蛋白的 NE 和 MPO 的抑制剂也在同步研发中，相信随着相关研究的深入，以 NET 为治疗靶点的研究可以为多种 NET 相关疾病的治疗提供新的治疗策略与药物靶点。4小结与展望肝移植术后相关并发症的防治是肝移植领域亟待解决的重点与难点，随着肝移植术后相关并发症的发病机制及防治靶点研究的不断深入，肝移植术后受者围手术期及术后中长期管理的逐渐规范，肝移植受者的预后有望进一步提高。大量的证据表明，NET 在供肝的过量沉积会加重肝移植术后 IRI、急性排斥反应和肿瘤复发与免疫逃逸，NET 有望成为肝移植术后相关并发症的诊断生物标志物和防治新靶点26,44,66。虽然中性粒细胞和 NET 在肝移植术后免疫损伤中发挥了关键作用，但以 NET 作为防治靶点的研究仍需谨慎评估 NET 抑制剂的治疗获益和风险，NET 在肝移植术后并发症中的诊疗作用仍需进一步研究。参考文献：庄莉,刘相艳.肝移植受者围手术期管理及并发症预防与治疗J.中华消化外科杂志,2021,20(10):1037-1041.DOI:10.3760/115610-20210915-00459.ZHUANG L,LIU XY.Perioperative management andcomplicationspreventionandtreatmentofrecipientsinlivertransplantationJ.ChinJDigSurg,2021,20(10):1037-1041.DOI:10.3760/115610-20210915-00459.1林鹏,游悦楷,刘建勇,等.补救性肝移植、再次肝切除和局部消融治疗肝癌术后复发的临床疗效及其预后危险因素J.中华肝脏病杂志,2023,31(2):155-160.DOI:10.3760/501113-20210727-00364.LINP,YOUYK,LIUJY,etal.Clinicalefficacyandprognostic risk factors of salvage liver transplantation,rehepatectomy,and local ablation in the treatment 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