彗星实验SCGE和微核试验在土壤生态毒理学中的应用及其进展.doc

精选资料彗星实验(SCGE)和微核试验在土壤生态毒理学中的应用及其进展摘要：单细胞凝胶电泳技术又称为彗星实验，是最近几年发展起来的一种快速、简单、灵敏、可靠的检测细胞核DNA损伤的技术。目前采用的彗星实验有多种，可以检测诸如DNA双链断裂、单链断裂、碱不稳定位点等多种类型的DNA损伤。碱性彗星实验因其高灵敏度而被广泛采用。目前彗星实验广泛应用于各个研究领域，近年来开始用于环境污染的基因毒性研究和生物监测，并取得了迅速发展。微核试验是一种以染色体断裂及纺锤丝损伤等为测试终点的监测方法，有毒物质造成的微核形成，作用时间是细胞分裂期间的DNA和染色体复制合成过程中。因此，微核试验在对外来化合物(如药品、食品添加剂、农药、化妆品、环境污染物等)遗传毒性检测方面，得到了广泛应用。关键词：彗星实验；微核试验；多环芳烃；土壤吸附1 彗星实验及其进展11 引言环境污染对生物遗传物质的影响已经成为人们关心的环境问题之一，一些化学物质能够直接或间接作用于生物体DNA，干扰或破坏DNA的复制过程，引起DNA的损伤，进而引发严重后果。过去大量采用Allium试验、染色体断裂(CA)、微核试验(MCN)等研究手段研究化学物质对植物DNA的损伤，但是这些方法都是在大量实验的基础上建立起来的，工作量大且耗时长，不利于广泛采用1。单细胞凝胶电泳技术(single cell gel elec-trophoresis，SCGE)又称为彗星试验(comet assay)，是最近几年发展起来的一种方法，可以在细胞水平上检验真核细胞DNA的损伤与修复。植物或动物的细胞或细胞核分离后，与低熔点琼脂糖混合，铺于显微镜载玻片上电泳后，根据DNA在琼脂糖中的迁移来研究DNA损伤的程度。因为其具有简单、快速、灵敏的特点，而广泛应用于毒理学、生物学、医学、环境生物监测等领域2。12 发展SCGE是在核沉淀和光环测试等检测方法基础上发展起来的。1978年，Rydberg等第1次直接检测DNA损伤的程度，把单细胞包埋于凝胶中，在碱性条件下使其部分解旋，中和后以吖啶橙染色，用光度计测量红色荧光(代表单链DNA)和绿色荧光(代表双链DNA)的比例来表示DNA损伤的程度。为了提高实验灵敏度，1984年Ostling等3采用微电泳技术，检测射线对细胞的伤害。在他们的实验中，将细胞固定于载玻片的凝胶上，用去污剂(SDS)和高浓度盐溶液使其裂解，自由DNA在中性条件下电泳，电泳结束后以荧光染料(EB)染色，在荧光显微镜下观察DNA的伤害程度。该方法只能检测双链DNA片段，不能检测单链DNA片段4。单细胞凝胶电泳自产生后就处在不断发展和完善中，以适应不同的实验需要。Singh等5于1988年首先提出碱性彗星实验，用于研究X射线和过氧化氢所造成的DNA伤害，检测的敏感性大大提高。目前我们所说的单细胞凝胶电泳技术(SCGE)就是指该方法。其后不久，Olive等6开始了中性电泳技术和半碱性电泳技术，即细胞经碱解处理后在中性或半碱性(pH1213)条件下电泳。根据实验所采用的电泳胶板的不同，单细胞凝胶电泳可分为单层凝胶、双层凝胶和三层凝胶电泳技术。现在最常用的是采用三层凝胶的碱性单细胞凝胶电泳，简单地讲，就是使细三层琼脂糖的中间层，形成类似“三明治”的结构。13 实验原理彗星实验中，镶嵌于琼脂糖中的细胞核经过碱性溶液处理，DNA解螺旋且变性为单链，在电场力的作用下DNA因带负电而向阳极移动，分子量小的DNA片断移动速度相对较快，而细胞核移动相对较慢，形成类似彗星状的图像，因此该实验被称为“彗星实验”。DNA受到的伤害愈严重，产生的断链和碱易变性片段愈多，且DNA片断愈小，在相同条件下DNA迁移量愈多，迁移的距离愈长。因此，DNA迁移的距离(拖尾长度)和拖尾部分DNA的含量(尾部荧光强度)，可以作为细胞核损伤的表征参数。通过测定DNA迁移长度或迁移部分的光密度(代表拖尾部分DNA的含量)可以定量DNA的损伤程度，确定外界作用因素和DNA损伤之间的“剂量-效应”关系78。14 实验方法目前采用的多种彗星实验的基本原则和实验操作都类似，主要包括单细胞悬浮液的获得、电泳胶板制备、细胞裂解、DNA变性解旋、电泳、中和、染色和观察等步骤。141 单细胞悬浮液制备从理论上讲SCGE技术适合于一切真核细胞，样品细胞需要量少，细胞可以是培养的细胞系或体细胞组织分离的细胞，目前已经用过的细胞有人体淋巴细胞、表皮细胞、血细胞、成纤维细胞、睾丸细胞、肿瘤细胞、动物肝细胞、血细胞、植物的根细胞和叶片以及酵母细胞等2。前人的研究中根据细胞来源和种类的不同，所采用的制备方法也不完全相同，但是无论采用什么方法，都要确保在细胞分离和制备过程中不要产生额外的DNA伤害或修复。酶处理方法是获得植物原生质体或细胞核最常用方法之一，将蚕豆根尖以蒸馏水冲洗干净后以剪刀剪碎放入小离心管，加入2%的纤维素酶和果胶酶混合液，于28处理3h9，获得细胞核的悬浮液并用于彗星实验也可采用机械分离方法分离植物细胞核10：植物组织放入预冷的培养皿中，冰上冷冻10min，加入一定体积缓冲液，机械分离叶片细胞核，以缓冲液充分冲洗叶片使细胞核游离，并倾斜培养皿使细胞核聚集，吸取30L细胞核的悬浮液加入一定的溴化乙锭染色后于荧光显微镜下观察或进行彗星实验。142 胶片制备胶片制备即是将获得的细胞悬浮液与低熔点琼脂糖混合并铺于载玻片，这是SCGE技术中最关键的步骤。三层琼脂糖的“三明治”式结构是目前最常用的实验方法，即在按照一定顺序在显微镜载玻片上铺三层琼脂糖，使低熔点琼脂糖和细胞核悬浮液的混合物夹在中间。有人推荐采用磨砂的载玻片，以增加低熔点琼脂糖和细胞核悬浮液与载玻片间的结合力11。在三层琼脂糖的“三明治”式结构中，第1层为正常熔点的琼脂糖(NMA)层，它的作用是使第2层和第3层琼脂糖牢固地附着于载玻片上。143 细胞裂解细胞裂解的具体作用是使细胞膜、核膜和其它的生物膜受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA及其它的成分扩散并通过凝胶进入裂解液，只有DNA保留在原来的位置8。细胞裂解的时间对实验结果也有很大的影响。一般来讲，裂解时间越长，慧尾也越长，但如裂解时间过长，会因慧尾太长，光密度过小，而看不到慧尾。144 DNA解旋和电泳在进行电泳前要先使细胞核中的DNA变性解旋，即将玻片浸没于电泳液中放置一定时间。碱性彗星实验中采用的电泳液成分是1mmolL-1Na2EDTA，300mmolL-1NaOH。解旋时间的长短取决于细胞的类型和DNA损伤的程度和检测目的。中性电泳中为了使DNA和结合的蛋白质分开，需要1h以上的时间，碱性电泳一般需要几十分钟的时间。解旋时间的长短和中慧尾的长度12。检测的灵敏度也有一定的关系。提高解旋时间，一方面提高了检测的灵敏度，但也增加了对照。145 中和、染色和观察电泳结束后，以Tris HCl(pH75)中和玻片，再以无水乙醇浸埋一定时间，吸去乙醇后晾干或室温下过夜。中和时间的长短对实验结果也有很大的影响。中和时间增加，能降低观察时背景光强度7。制备好的玻片以荧光染料染色后采用荧光显微镜进行观察。一般根据自己的仪器设备和研究的需要选择合适的荧光染料，常用的染料有溴化乙锭，吖啶橙和DAPI和YOYO21等。观察常用的显微镜放大倍数一般为160400倍，要根据细胞的类型和大小选择合适的放大倍数。利用显微镜上的标尺虽然可以测量DNA迁移的长度，但是不能测量慧尾中DNA的含量，所以其使用上有一定的限制。近年来发展的一些图像分析系统可以有效地解决这些问题，如英国的KIAS系统11。15 SCGE在土壤生态毒理学中的应用近年来，在工农业生产实践中，大量的污染物质进入了土壤，通过多种途径影响环境，并最终影响人类的身体健康。早期关于土壤毒理学的研究多是通过测定土壤中污染物质的浓度来表现的，但是因为土壤本身组成的复杂性，单纯用污染物质的浓度是很难代表其潜在的毒性，只有生物毒性评价的结果可以提供复杂条件下多种污染物质的综合毒性13。早期土壤生态毒理学常采用植物种子发芽率、根伸长和蚯蚓毒性等，这些指标虽能综合反映土壤的污染状况，但敏感性较低，检测的是动植物个体对污染物的反映，受个体差异和环境(尤其是温度)影响较大。SCGE从细胞水平阐述污染物对环境的影响，敏感性很高，已广泛应用于医学、环境监测等研究领域中，用于检测物质对DNA的损伤，但在环境监测中，主要是用于水环境的监测，很少应用到土壤毒理研究中，而且目前研究多是采用溶液或土壤浸提液处理动物细胞或人体细胞。植物是生态环境的重要组成部分，近年来有研究者将植物用于SCGE，拓展了SCGE的研究对象。Gichner等10以烟草为材料研究了电离辐射和烷化剂的基因毒性，结果表明电离辐射和烷化剂都可以引起烟草DNA的双链和单链断裂，这些断裂在4d后方可修复。Moretti等14以人体血液外围淋巴细胞为材料，采用姊妹染色体交换、微核试验和彗星实验研究豆田除草剂特丁净的基因毒性。姊妹染色体交换、微核试验和彗星实验结果一致，都表明与S9混合后特丁净不引起DNA的伤害，但不与S9混合则引起细胞DNA的伤害。Ribas等15用彗星实验方法研究了甲草胺、莠去津、百草枯、氟乐灵等除草剂引起的DNA伤害。研究结果表明，彗星实验可以有效地检测除草剂的基因毒性，所有除草剂处理中都引起细胞拖尾的增长；这些除草剂都具有基因毒性，代谢过程影响除草剂本身的基因毒性。1996年Koppen第一次报道了利用植物为实验材料进行彗星实验16。植物毒性评价系统是进行环境污染原位监测的最好方法之一10，利用植物彗星实验可以进行环境致突变物的检测，而且植物彗星实验和动物细胞彗星实验一样可靠，所以有必要进一步拓展植物彗星实验的研究，建立环境污染引起植物DNA损伤的监测系统，及时有效地进行环境污染风险评价。近年来植物彗星实验有了较大发展1217，但并非所有植物都可以应用于彗星实验。2005年林爱军等19应用彗星实验研究了镉对小麦叶片DNA的伤害。2006年林爱军等18利用不同植物进行DNA损伤彗星实验，结果得出蚕豆、菠菜、洋葱、菜豆、大蒜等植物的根尖和叶片都可以应用于植物彗星实验，但利用水稻组织进行彗星试实验并没有获得明显的彗星图像。16 SCGE的展望和发展趋势单细胞凝胶电泳是一种可以检测细胞水平上基因伤害程度的手段，具有敏感、简单、快速的优点，已经取得了广泛的应用。因细胞的种类不同、所处的阶段不同，其敏感性和修复能力不同，在操作中要考虑多种因素的影响，以使实验结果更具可比性。今后对“彗星”的形成机制需要进一步研究。2微核试验及其研究进展2 微核试验及其进展21 微核试验微核是指位于细胞浆中独立于主核的核小体，主要由外界损害因素(生物的、物理的、化学的)作用细胞后，导致细胞染色体丢失或断裂，从而在胞浆中形成1个或数个小核20。微核试验是一种以染色体断裂及纺锤丝损伤等为测试终点的监测方法，有毒物质造成的微核形成，作用时间是细胞分裂期间的DNA和染色体复制合成过程中。因此，微核试验在对外来化合物(如药品、食品添加剂、农药、化妆品、环境污染物等)遗传毒性检测方面，得到了广泛应用。同时，该方法在职业暴露人群遗传损害监测和现场生态环境检测方面，也得到了大量的应用。微核试验最大的优点是经济、简单、快速，而国内外大量的对比试验研究，比较一致的看法是该方法在敏感性、特异性和准确性方面，与经典的染色体畸变分析方法基本相当21。因而，特别适合作为大量化合物和现场人群初筛的实验方法。微核试验创建于20世纪70年代中期(19731975)2223目前许多国家和国际组织，已将其规定为新药、食品添加剂、农药、化妆品等毒理安全性评价的必做试验。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展和渗透到微核研究中，大大拓展了微核试验的检测和应用范围，已发展成为能同时检测染色体断裂、丢失、分裂延迟、不分离、DNA损伤修复障碍、Hprt基因突变、凋亡、细胞分裂不平衡等多种遗传损害终点，因而近年来国际上有人提出了新微核试验(new micro nu-cleus test)概念24，从而使微核试验焕发出新的生机。22 植物微核试验微核试验不要求中期相细胞，几乎所有的细胞都能观察到微核25，所用的材料可以是植物或动物组织和细胞。植物微核测定常用根尖和四分体。动物微核测定技术常采用大、小鼠骨髓细胞和人的外周血淋巴细胞。随着微核形成机理和意义的阐明以及检测手段和实验技术的不断改进和完善，微核试验特别植物微核试验，在水体(三致性)监测得到广泛应用，植物微核试验在土壤生态毒理学中的应用则较少，有待进一步研究与发展。在目前应用最多的植物微核试验是紫露草微核技术(Tradescant ia paludosa MCN Test)(也称紫露草四分体微核监测法)和蚕豆根尖细胞微核技术(Viciafaba MCN Test)。221 蚕豆根尖微核试验蚕豆(Vicia faba)根尖细胞的染色体数目少(2n=12)，染色体大，DNA含量多，有长的中间着丝粒染色体一对，其它5对是较短的近端着丝粒染色体，便于观察，对诱变物反应敏感，可常年使用，适用于水质致突变性污染的常规监测，蚕豆根尖微核试验不仅能发现有机化学物的致突变性，而且也能了现有机化学物的植物化谢产物的致突变性，其代谢产物类似于完整动物的代谢产物。因此，蚕豆根尖微核试验被列入国家环保局编制的生物监测技术规范(水环境部分)受到广泛应用。孔志明等研究表明被监测毒物或污染物不能严重阻碍细胞的生长分裂，否则不能正确反映被检测目标。222 紫露草微核试验紫露草(Tradescantiap aludosa)品种本底微核率低；植株体较小，容易进行繁殖，载培适宜温度25左右，在我国大部分地区可在温室保种越冬载培，具有常年获取材料的优点。紫露草花粉母细胞的减数分裂，有高度的同步现象，各分裂期的敏感性又有不同，利用这两个特性，我们可以在高度敏感的分裂期中，诱导产生最大量的染色体的损伤，并且在同步的四分体中得到大量的微核，因此其特别适合于微核试验26，紫露草微核试验除具有一般微核试验的优点外，其优势是可以现场测受污染的水样27。紫露草微核试验是由美国马德修教授开创的，已广泛应用于环境监测28。23 植物微核试验应用于土壤生态毒理学中的测试方法应用植物微核试验测试土壤中污染物毒性一般采用浸提法和盆栽法。231 浸提法宋玉芳、周启星等29在用土壤溶液浸提法进行蚕豆根尖微核试验中采用以下方法。浸泡蚕豆种子2630h，25恒温培养1224h，将种子取出在25再培养3648h。种子初生根长23cm可做样品监测。称取过5mm筛土壤50g于500mL三角瓶中，加蒸馏水250mL(水土比5：1)，充分振荡混均后静止24h。取上清夜进行染毒试验。将终止染毒的幼苗置于烧杯中用蒸馏水冲洗并修复20h。25培养24h。切蚕豆根尖1cm，用诺卡氏液固定24h。固定根用水洗2次， 再用1mol/L HCl在60水浴浸泡8min使根尖软化。在暗处用Shiff试剂对上述软化的根尖在30染色24h。染色后将根尖用偏亚硫酸钠洗涤2次。将染毒处理根尖保存在4蒸馏水中待制片用。切去根尖顶部1mm，取根尖2mm，放置在玻片上，滴加45%醋酸1滴，用橡皮头轻轻的将根尖均匀压碎，在显微镜下观察，用计数器计数，并查出微核数，以1000个细胞中出现的微核数表示微核千分率( MCN103)：PI=样品实测微核数(1/1000)平均值对照中的微核数232 盆栽法将蚕豆种子按本室建立的常规方法浸种催芽，等初生根长至2 3cm时，将发芽的种子种人盛有不同土样的花钵中，待幼苗长出2 4片真叶时，将整株幼苗从土样中取出，用自来水冲洗干净，以终止染毒。再将幼苗置烧杯中，用 自来水没住根部，修复20h。整株幼苗用Carnoys液固定。每一处理选5株固定好的幼苗，按本室建立的常规程序分别制作根尖、叶尖细胞压片以。每片观察计数1000个细胞，统计微核千分率（MCN）30。24 植物微核试验在土壤生态毒理学中的应用及其进展1978年马德修先生以美国产紫露草(Tradeseantia paludosa)为材料，通过花粉母细胞四分体微核数量作为测定环境污染技术，取得了良好效果。1979年山东海洋学院与中科院海洋研究所和Te一HsiuMa教授三方合作，成立了中美合作研究用植物细胞MCN监测污染研究组，并取得初步结果。1980年Degrassi和Rizzoni建立了蚕豆次生根尖微核监测系统。1982年Degrassi提出利用微核千分率技术作为诱变剂的监测系统。此后越来越多的人采用各种植物微核技术进行不同领域的监测研究。利用植物微核监测技术监测水质污染、大气污染和土壤污染，是一种行之有效的方法 。1991年金波、陈光荣等30利用蚕豆叶尖和根尖细胞微核技术，监测湖北省洪湖、应城两市近郊农业土壤污染的情况 ，获得明显效果。宋玉芳，周启星等进行土壤整体质量的生态毒性评价，其中生态毒性试验之一用土壤溶液浸提法进行蚕豆根尖微核试验参考文献1 Navarrete M H，Carrera P，Miguel M，et alA fast comet assay variant for solid tissue cellsThe assessment of DNA damage in higher plants J Mutation Research，1997，389 ： 2712772 林爱军、耿春女、朱永官等单细胞凝胶电泳技术及在土壤生态毒理学中的应用 J 生态学杂志，2005，24(8)：975979 3 Rojas E，Lopez MC，Valverde MSingle cell gel electrophoresis assay：Methodology and applications JJChromB，1999，722：2252544 Ostling O，Johanson KJMicroelect rophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells JBiochemBiophysResCom，1984，123：2912985 Singh NP，McCoy MT，Tice RR，et alA simple techniquefor quantization of low levels of DNA damage in individual cells J ExpCell Res，1988，175 (1)：1841916 Olive PL，Banath J P，Durand RE Heterogeneity in radiation induced DNA damage and repair in tumor and normal cellsmeasured using the“comet”assay JRadiatRes，1990，122 (1)：86947 孟紫强，张连珍单细胞微凝胶电泳技术在人血淋巴细胞DNA损伤研究中的应用J遗传学报，1998，25 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