总RNA的提取和RT-PCR.ppt

总总RNA的提取、定量与的提取、定量与RT-PCR南方医科大学南方医科大学南方医科大学南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心pp完整完整完整完整RNARNA的提取和纯化的提取和纯化的提取和纯化的提取和纯化,是进行是进行是进行是进行RNARNA 方面的研究工作如方面的研究工作如方面的研究工作如方面的研究工作如NothernNothern杂交杂交杂交杂交、mRNAmRNA分离分离分离分离、RT-PCRRT-PCR、定量定量定量定量PCRPCR、cDNAcDNA合成合成合成合成及体外翻译等的前提。及体外翻译等的前提。及体外翻译等的前提。及体外翻译等的前提。pp掌握从细胞中提取总掌握从细胞中提取总掌握从细胞中提取总掌握从细胞中提取总RNARNA的方法的方法的方法的方法pp熟悉紫外吸收法检测熟悉紫外吸收法检测熟悉紫外吸收法检测熟悉紫外吸收法检测RNARNA浓度与纯度的原理及测定方法浓度与纯度的原理及测定方法浓度与纯度的原理及测定方法浓度与纯度的原理及测定方法pp掌握掌握掌握掌握RT-PCRRT-PCR基因扩增的原理和过程基因扩增的原理和过程基因扩增的原理和过程基因扩增的原理和过程目目 的的实实 验验 流流 程程提取原理提取原理提取原理提取原理操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤逆转录原理逆转录原理逆转录原理逆转录原理操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤提提提提 取取取取总总总总RNARNA定定定定 量量量量合成合成合成合成cDNAcDNA第一链第一链第一链第一链原理体系原理体系原理体系原理体系引物选择引物选择引物选择引物选择PCRPCR电泳原理电泳原理电泳原理电泳原理电泳步骤电泳步骤电泳步骤电泳步骤电电电电 泳泳泳泳计算方法计算方法计算方法计算方法操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤第一部分第一部分 细胞总细胞总RNA的提取及定量的提取及定量原原 理理pp1010-5-5 g RNA/g RNA/细细细细胞胞胞胞 ppmRNA3mRNA3端存在端存在端存在端存在20-25020-250个多聚腺苷酸个多聚腺苷酸个多聚腺苷酸个多聚腺苷酸(polyA)(polyA)结构，结构，结构，结构，可用可用可用可用oligo(dT)oligo(dT)亲和层析柱分离亲和层析柱分离亲和层析柱分离亲和层析柱分离mRNAmRNA。ppRNARNA分离的方法分离的方法分离的方法分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍酸胍酸胍酸胍-有机溶剂法，氯化锂有机溶剂法，氯化锂有机溶剂法，氯化锂有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶尿素法，蛋白酶尿素法，蛋白酶尿素法，蛋白酶K-K-细胞质细胞质细胞质细胞质RNARNA提取法等、提取法等、提取法等、提取法等、异硫氰酸胍异硫氰酸胍异硫氰酸胍异硫氰酸胍-酚酚酚酚-氯仿一步法等氯仿一步法等氯仿一步法等氯仿一步法等。pp目前常用的是目前常用的是目前常用的是目前常用的是TrizolTrizol法法法法。rRNA 80-85%rRNA 80-85%：28S 18S 5S28S 18S 5StRNA,snRNA 10-15%tRNA,snRNA 10-15%mRNA 1-5%mRNA 1-5%Trizol的主要成分的主要成分ppTrizolTrizol是一种新型总是一种新型总是一种新型总是一种新型总 RNARNA抽提试剂抽提试剂抽提试剂抽提试剂pp主要成分是主要成分是主要成分是主要成分是异硫氰酸胍异硫氰酸胍异硫氰酸胍异硫氰酸胍和和和和酚酚酚酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是。异硫氰酸胍属于解偶剂，是。异硫氰酸胍属于解偶剂，是。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白裂解细胞，使细胞中的蛋白裂解细胞，使细胞中的蛋白裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。核酸物质解聚得到释放。核酸物质解聚得到释放。核酸物质解聚得到释放。pp酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNARNA酶酶酶酶活性，因此活性，因此活性，因此活性，因此TrizolTrizol中还加入了中还加入了中还加入了中还加入了8-8-羟基喹啉、羟基喹啉、羟基喹啉、羟基喹啉、-巯基乙醇等巯基乙醇等巯基乙醇等巯基乙醇等来抑制内源和外源来抑制内源和外源来抑制内源和外源来抑制内源和外源RNaseRNase。pp在加入在加入在加入在加入氯仿氯仿氯仿氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，离心后，溶液分为水相和有机相，离心后，溶液分为水相和有机相，离心后，溶液分为水相和有机相，RNARNA在在在在上层水相中。上层水相中。上层水相中。上层水相中。pp取出水相用取出水相用取出水相用取出水相用异丙醇沉淀异丙醇沉淀异丙醇沉淀异丙醇沉淀可回收可回收可回收可回收RNARNA；用乙醇沉淀中间；用乙醇沉淀中间；用乙醇沉淀中间；用乙醇沉淀中间层可回收层可回收层可回收层可回收DNADNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。原原 理理所有所有所有所有RNARNA的提取过程中都有五个关键点：的提取过程中都有五个关键点：的提取过程中都有五个关键点：的提取过程中都有五个关键点：1.1.样品细胞或组织的有效破碎；样品细胞或组织的有效破碎；样品细胞或组织的有效破碎；样品细胞或组织的有效破碎；2.2.有效地使核蛋白复合体变性；有效地使核蛋白复合体变性；有效地使核蛋白复合体变性；有效地使核蛋白复合体变性；3.3.对内源对内源对内源对内源RNARNA酶的有效抑制酶的有效抑制酶的有效抑制酶的有效抑制；4.4.有效地将有效地将有效地将有效地将RNARNA从从从从DNADNA和蛋白混合物中分离；和蛋白混合物中分离；和蛋白混合物中分离；和蛋白混合物中分离；5.5.对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。关关 键键 点点RNARNA酶污染来源酶污染来源ppRNARNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。等。等。等。pp严格控制外源性严格控制外源性严格控制外源性严格控制外源性RNARNA酶的污染酶的污染酶的污染酶的污染：外源性的：外源性的：外源性的：外源性的RNARNA酶存在于酶存在于酶存在于酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。种试剂的污染。种试剂的污染。种试剂的污染。pp最大限度地抑制内源性的最大限度地抑制内源性的最大限度地抑制内源性的最大限度地抑制内源性的RNARNA酶酶酶酶：而各种组织和细胞中：而各种组织和细胞中：而各种组织和细胞中：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的则含有大量内源性的则含有大量内源性的则含有大量内源性的RNARNA酶。酶。酶。酶。防止防止RNARNA酶污染的措施酶污染的措施 1.1.所有的玻璃器皿均应在使用前于所有的玻璃器皿均应在使用前于所有的玻璃器皿均应在使用前于所有的玻璃器皿均应在使用前于180180的高温下干烤的高温下干烤的高温下干烤的高温下干烤6h6h或更长时间。或更长时间。或更长时间。或更长时间。2.2.塑料器皿可用塑料器皿可用塑料器皿可用塑料器皿可用0.1%DEPC0.1%DEPC水浸泡水浸泡水浸泡水浸泡12h12h以上，高压灭菌。以上，高压灭菌。以上，高压灭菌。以上，高压灭菌。3.3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在泡在泡在泡在3%H2O23%H2O2室温室温室温室温10min10min，然后用，然后用，然后用，然后用0.1%DEPC0.1%DEPC水冲洗，晾干。水冲洗，晾干。水冲洗，晾干。水冲洗，晾干。4.4.配制的溶液应尽可能用配制的溶液应尽可能用配制的溶液应尽可能用配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC0.1%DEPC在在在在3737处理处理处理处理12h12h以上。然后用高压灭菌除以上。然后用高压灭菌除以上。然后用高压灭菌除以上。然后用高压灭菌除去残留的去残留的去残留的去残留的DEPCDEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用。不能高压灭菌的试剂，应当用。不能高压灭菌的试剂，应当用。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPCDEPC处理过的无菌双蒸水处理过的无菌双蒸水处理过的无菌双蒸水处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。配制，然后经滤膜过滤除菌。配制，然后经滤膜过滤除菌。配制，然后经滤膜过滤除菌。5.5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换实验过程中手套要勤换实验过程中手套要勤换实验过程中手套要勤换。6.6.设置设置设置设置RNARNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。操作专用实验室，所有器械等应为专用。操作专用实验室，所有器械等应为专用。操作专用实验室，所有器械等应为专用。加加样样枪枪的的使使用用操作步骤步骤 样品处理样品处理样品处理样品处理pp提取组织提取组织提取组织提取组织RNARNA时，每时，每时，每时，每5050100mg100mg组织用组织用组织用组织用1mlTrizol1mlTrizol试剂对组织进试剂对组织进试剂对组织进试剂对组织进行裂解；行裂解；行裂解；行裂解；pp悬浮细胞先离心沉淀，每悬浮细胞先离心沉淀，每悬浮细胞先离心沉淀，每悬浮细胞先离心沉淀，每5-10105-10106 6个细胞加个细胞加个细胞加个细胞加1mlTrizol1mlTrizol后，反复后，反复后，反复后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。pp培养贴壁细胞不须消化，可直接用培养贴壁细胞不须消化，可直接用培养贴壁细胞不须消化，可直接用培养贴壁细胞不须消化，可直接用TrizolTrizol进行消化、裂解，进行消化、裂解，进行消化、裂解，进行消化、裂解，TrizolTrizol体体体体积按积按积按积按10cm10cm2 2/ml/ml比例加入。比例加入。比例加入。比例加入。(注意：注意：注意：注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量匀浆一定要彻底，是提取高质量匀浆一定要彻底，是提取高质量匀浆一定要彻底，是提取高质量RNARNA的前提的前提的前提的前提；细胞数量与；细胞数量与；细胞数量与；细胞数量与TrizolTrizol的比例，细胞的数量不能过多。的比例，细胞的数量不能过多。的比例，细胞的数量不能过多。的比例，细胞的数量不能过多。)实验材料实验材料实验材料实验材料：HEK293HEK293人胚肾细胞人胚肾细胞人胚肾细胞人胚肾细胞 操作步骤操作步骤1.1.细胞中加入细胞中加入细胞中加入细胞中加入1mlTrizol1mlTrizol（RNAisoPlusRNAisoPlus）用移液枪反复吹吸直无明显沉）用移液枪反复吹吸直无明显沉）用移液枪反复吹吸直无明显沉）用移液枪反复吹吸直无明显沉淀后，室温放置淀后，室温放置淀后，室温放置淀后，室温放置5min5min，使其充分裂解。，使其充分裂解。，使其充分裂解。，使其充分裂解。（注意：此时可放入（注意：此时可放入（注意：此时可放入（注意：此时可放入-70-70长期保持。长期保持。长期保持。长期保持。）2.2.按按按按200200u ul l氯仿氯仿氯仿氯仿/mlTrizol/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置加入氯仿，振荡混匀后室温放置加入氯仿，振荡混匀后室温放置加入氯仿，振荡混匀后室温放置2-3min2-3min。(注意：此步一定要振荡混匀，使氯仿和注意：此步一定要振荡混匀，使氯仿和注意：此步一定要振荡混匀，使氯仿和注意：此步一定要振荡混匀，使氯仿和TrizolTrizol不分层。不分层。不分层。不分层。)3.3.4 412,000g12,000g离心离心离心离心15min15min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。相，上层为无色水相和一个中间层。相，上层为无色水相和一个中间层。相，上层为无色水相和一个中间层。RNARNA主要在水相中，水相体积约为主要在水相中，水相体积约为主要在水相中，水相体积约为主要在水相中，水相体积约为所用所用所用所用TrizolTrizol试剂的试剂的试剂的试剂的6060。（此步开始组长负责组织各组同步进行离心）（此步开始组长负责组织各组同步进行离心）（此步开始组长负责组织各组同步进行离心）（此步开始组长负责组织各组同步进行离心）4.4.吸取上层水相，至另一新的离心管中。吸取上层水相，至另一新的离心管中。吸取上层水相，至另一新的离心管中。吸取上层水相，至另一新的离心管中。一般一般一般一般400-450ul400-450ul就足够了，千就足够了，千就足够了，千就足够了，千万不要贪多！万不要贪多！万不要贪多！万不要贪多！（注：千万不要吸取中间界面；（注：千万不要吸取中间界面；（注：千万不要吸取中间界面；（注：千万不要吸取中间界面；若同时提取若同时提取若同时提取若同时提取DNADNA和蛋白质，则保留下层和蛋白质，则保留下层和蛋白质，则保留下层和蛋白质，则保留下层酚相存于酚相存于酚相存于酚相存于4 4冰箱，若只提冰箱，若只提冰箱，若只提冰箱，若只提RNARNA，则弃下层酚相。），则弃下层酚相。），则弃下层酚相。），则弃下层酚相。）操作步骤操作步骤5.5.加入等体积异丙醇后，上下颠倒混匀，加入等体积异丙醇后，上下颠倒混匀，加入等体积异丙醇后，上下颠倒混匀，加入等体积异丙醇后，上下颠倒混匀，4 4放置放置放置放置5min5min。6.6.4 412,000g12,000g离心离心离心离心10min10min，弃上清，弃上清，弃上清，弃上清，离心后在管侧和管底出现胶状沉离心后在管侧和管底出现胶状沉离心后在管侧和管底出现胶状沉离心后在管侧和管底出现胶状沉淀淀淀淀。7.7.加入加入加入加入1ml75%1ml75%乙醇乙醇乙醇乙醇，（切勿触及沉淀！）（切勿触及沉淀！）（切勿触及沉淀！）（切勿触及沉淀！）温和振荡离心管，悬浮沉淀。温和振荡离心管，悬浮沉淀。温和振荡离心管，悬浮沉淀。温和振荡离心管，悬浮沉淀。8.8.4 412,000g12,000g离心离心离心离心5min5min，尽量弃上清。，尽量弃上清。，尽量弃上清。，尽量弃上清。9.9.室温晾干或真空干燥室温晾干或真空干燥室温晾干或真空干燥室温晾干或真空干燥5min5min。（注：（注：（注：（注：RNARNA样品不要过于干燥，否则很样品不要过于干燥，否则很样品不要过于干燥，否则很样品不要过于干燥，否则很难溶解。）难溶解。）难溶解。）难溶解。）10.10.加入加入加入加入1010u ul l无无无无RNaseRNase的水，的水，的水，的水，充分震荡混匀充分震荡混匀充分震荡混匀充分震荡混匀。原原原原 理：理：理：理：1.1.1.1.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应物质在光的照射下会产生对光的吸收效应物质在光的照射下会产生对光的吸收效应物质在光的照射下会产生对光的吸收效应 2.2.2.2.而且物质对光的吸收是具有选择性的而且物质对光的吸收是具有选择性的而且物质对光的吸收是具有选择性的而且物质对光的吸收是具有选择性的3.3.3.3.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱 因因因因此此此此不不不不同同同同波波波波长长长长的的的的单单单单色色色色光光光光通通通通过过过过溶溶溶溶液液液液时时时时其其其其光光光光的的的的能能能能量量量量就就就就会会会会被被被被不不不不同同同同程程程程度度度度的的的的吸吸吸吸收收收收，光光光光能能能能量量量量被被被被吸吸吸吸收收收收的的的的程程程程度度度度和和和和物物物物质质质质的的的的浓浓浓浓度度度度有一定的比例关系有一定的比例关系有一定的比例关系有一定的比例关系.紫外光吸收法紫外光吸收法紫外吸收检测紫外吸收检测RNARNA的浓度的浓度ppRNARNA在在在在260nm260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用波长处有最大的吸收峰。因此，可以用波长处有最大的吸收峰。因此，可以用波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm260nm波长分光测定波长分光测定波长分光测定波长分光测定RNARNA浓度，浓度，浓度，浓度，ODOD值为值为值为值为1 1相当于大约相当于大约相当于大约相当于大约 40g/ml40g/ml的单的单的单的单链链链链RNARNA。用双蒸水稀释。用双蒸水稀释。用双蒸水稀释。用双蒸水稀释RNARNA样品样品样品样品n n倍并以双蒸水为空白对照，倍并以双蒸水为空白对照，倍并以双蒸水为空白对照，倍并以双蒸水为空白对照，根据此时读出的根据此时读出的根据此时读出的根据此时读出的OD260OD260值即可计算出样品稀释前的浓度值即可计算出样品稀释前的浓度值即可计算出样品稀释前的浓度值即可计算出样品稀释前的浓度:RNA(mg/ml)=40OD260RNA(mg/ml)=40OD260读数读数读数读数稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数(n)/1000(n)/1000dsDNA(双链DNA)1OD260=50ug/mlssDNA(单链DNA)1OD260=33ug/mlRNA1OD260=40ug/mlppRNARNA纯品的纯品的纯品的纯品的OD260/OD280OD260/OD280的比值为的比值为的比值为的比值为2.02.0，故根据，故根据，故根据，故根据OD260OD260/OD280/OD280的比值可以估计的比值可以估计的比值可以估计的比值可以估计RNARNA的纯度。的纯度。的纯度。的纯度。pp若若若若OD260/OD280OD260/OD280小于小于小于小于2 2，说明可能有，说明可能有，说明可能有，说明可能有DNADNA片段污染，可以考虑用无片段污染，可以考虑用无片段污染，可以考虑用无片段污染，可以考虑用无RNaseRNase的的的的DNaseDNase处理样品，若小于处理样品，若小于处理样品，若小于处理样品，若小于1.81.8，说明样品中还可能含有蛋白，说明样品中还可能含有蛋白，说明样品中还可能含有蛋白，说明样品中还可能含有蛋白质或酚，应再用酚质或酚，应再用酚质或酚，应再用酚质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化RNARNA。若比值太高。若比值太高。若比值太高。若比值太高（大于（大于（大于（大于2.22.2），则提示），则提示），则提示），则提示RNARNA有降解。有降解。有降解。有降解。紫外吸收检测紫外吸收检测RNARNA的纯度的纯度RNARNA完整性检测完整性检测pp完整的完整的完整的完整的RNARNA的甲醛电泳可明显地观的甲醛电泳可明显地观的甲醛电泳可明显地观的甲醛电泳可明显地观察到察到察到察到28S28S和和和和18S18S两条带，并且两条带，并且两条带，并且两条带，并且28S28S大约是大约是大约是大约是18S18S的两倍宽。的两倍宽。的两倍宽。的两倍宽。pp若两条带不明显若两条带不明显若两条带不明显若两条带不明显,则说明则说明则说明则说明RNARNA部分部分部分部分降解降解降解降解,可能的原因是污染了可能的原因是污染了可能的原因是污染了可能的原因是污染了RNaseRNase。常见问题分析常见问题分析ppRNARNA得率低：得率低：得率低：得率低：A.A.样品裂解或匀浆处理不彻底。样品裂解或匀浆处理不彻底。样品裂解或匀浆处理不彻底。样品裂解或匀浆处理不彻底。B.RNAB.RNA沉淀未完全溶解。沉淀未完全溶解。沉淀未完全溶解。沉淀未完全溶解。ppA260/A2801.65A260/A2801.65：A.RNAA.RNA应使用应使用应使用应使用TEBufferTEBuffer稀释后再进行吸光度值的测定。稀释后再进行吸光度值的测定。稀释后再进行吸光度值的测定。稀释后再进行吸光度值的测定。低离子浓度和低低离子浓度和低低离子浓度和低低离子浓度和低pHpH值条件下值条件下值条件下值条件下A280A280值偏高。值偏高。值偏高。值偏高。B.B.样品匀浆时加的试剂量太少。样品匀浆时加的试剂量太少。样品匀浆时加的试剂量太少。样品匀浆时加的试剂量太少。C.C.匀浆样品时未在室温放置匀浆样品时未在室温放置匀浆样品时未在室温放置匀浆样品时未在室温放置5 5分钟。分钟。分钟。分钟。D.D.吸取水相时混入了有机相。吸取水相时混入了有机相。吸取水相时混入了有机相。吸取水相时混入了有机相。E.RNAE.RNA沉淀未完全溶解。沉淀未完全溶解。沉淀未完全溶解。沉淀未完全溶解。ppRNARNA降解降解降解降解A.A.组织取出后没有马上处理或冷冻。组织取出后没有马上处理或冷冻。组织取出后没有马上处理或冷冻。组织取出后没有马上处理或冷冻。B.B.待提取待提取待提取待提取RNARNA的样品没有保存于的样品没有保存于的样品没有保存于的样品没有保存于-60-60至至至至-70-70，而保存在了，而保存在了，而保存在了，而保存在了-5-5至至至至-20-20。C.C.细胞在用胰酶处理时过度。细胞在用胰酶处理时过度。细胞在用胰酶处理时过度。细胞在用胰酶处理时过度。D.D.溶液或离心管未经溶液或离心管未经溶液或离心管未经溶液或离心管未经RNaseRNase去除处理。去除处理。去除处理。去除处理。E.E.电泳时使用的甲醛电泳时使用的甲醛电泳时使用的甲醛电泳时使用的甲醛pHpH值低于了值低于了值低于了值低于了3.53.5。ppDNADNA污染污染污染污染A.A.样品匀浆时加的试剂量太少样品匀浆时加的试剂量太少样品匀浆时加的试剂量太少样品匀浆时加的试剂量太少B.B.样品中含有有机溶剂样品中含有有机溶剂样品中含有有机溶剂样品中含有有机溶剂(如乙醇，如乙醇，如乙醇，如乙醇，DMSODMSO等等等等)，强缓冲液或碱性溶液，强缓冲液或碱性溶液，强缓冲液或碱性溶液，强缓冲液或碱性溶液常见问题分析常见问题分析第二部分第二部分逆转录逆转录-聚合酶链反应聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)pp提取组织或细胞中的总提取组织或细胞中的总提取组织或细胞中的总提取组织或细胞中的总RNARNA，以其中的以其中的以其中的以其中的mRNAmRNA作为模板作为模板作为模板作为模板，采用，采用，采用，采用OligoOligo（dTdT）或随机引物利用逆转录酶反转录成）或随机引物利用逆转录酶反转录成）或随机引物利用逆转录酶反转录成）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNAcDNA。再以。再以。再以。再以cDNAcDNA为模板进行为模板进行为模板进行为模板进行PCRPCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。扩增，而获得目的基因或检测基因表达。扩增，而获得目的基因或检测基因表达。扩增，而获得目的基因或检测基因表达。ppRT-PCRRT-PCR使使使使RNARNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量量量量RNARNA样品分析成为可能。样品分析成为可能。样品分析成为可能。样品分析成为可能。pp该技术主要用于：该技术主要用于：该技术主要用于：该技术主要用于：分析基因的转录产物分析基因的转录产物分析基因的转录产物分析基因的转录产物、获取目的基因获取目的基因获取目的基因获取目的基因、合成合成合成合成cDNAcDNA探针探针探针探针、构建构建构建构建RNARNA高效转录系统高效转录系统高效转录系统高效转录系统。原原 理理1.1.鼠白血病病毒鼠白血病病毒鼠白血病病毒鼠白血病病毒（MMLVMMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，反转录酶：有强的聚合酶活性，反转录酶：有强的聚合酶活性，反转录酶：有强的聚合酶活性，RNARNA酶酶酶酶HH活性相活性相活性相活性相对较弱。对较弱。对较弱。对较弱。最适作用温度为最适作用温度为最适作用温度为最适作用温度为3737。在长时间的逆转录过程中，不会造成模板在长时间的逆转录过程中，不会造成模板在长时间的逆转录过程中，不会造成模板在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得的降解，获得的降解，获得的降解，获得cDNAcDNA的几率大，适用于较长的的几率大，适用于较长的的几率大，适用于较长的的几率大，适用于较长的cDNAcDNA链的合成。链的合成。链的合成。链的合成。2.2.禽成髓细胞瘤病毒禽成髓细胞瘤病毒禽成髓细胞瘤病毒禽成髓细胞瘤病毒（AMVAMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和反转录酶：有强的聚合酶活性和反转录酶：有强的聚合酶活性和反转录酶：有强的聚合酶活性和RNARNA酶酶酶酶HH活性。活性。活性。活性。最适作用温度为最适作用温度为最适作用温度为最适作用温度为4242。3.3.ThermusthermophilusThermusthermophilus、ThermusflavusThermusflavus等嗜热微生物的等嗜热微生物的等嗜热微生物的等嗜热微生物的热稳定性反热稳定性反热稳定性反热稳定性反转录酶转录酶转录酶转录酶：在：在：在：在MnMn2+2+存在下，允许高温反转录存在下，允许高温反转录存在下，允许高温反转录存在下，允许高温反转录RNARNA，以消除，以消除，以消除，以消除RNARNA模板的二级模板的二级模板的二级模板的二级结构。结构。结构。结构。4.4.MMLVMMLV反转录酶的反转录酶的反转录酶的反转录酶的RNaseH-RNaseH-突变体突变体突变体突变体：商品名为：商品名为：商品名为：商品名为SuperscriptSuperscript和和和和SuperScriptSuperScript。此种酶较其它酶能多将更大部分的。此种酶较其它酶能多将更大部分的。此种酶较其它酶能多将更大部分的。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNARNA转换成转换成转换成转换成cDNAcDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNAmRNA模板合成较长模板合成较长模板合成较长模板合成较长cDNAcDNA。（一）反转录酶的选择（一）反转录酶的选择 1.1.随机六聚体引物随机六聚体引物随机六聚体引物随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有：用此种方法时，体系中所有：用此种方法时，体系中所有：用此种方法时，体系中所有RNARNA分子全部充当分子全部充当分子全部充当分子全部充当了了了了cDNAcDNA第一链模板，通常用此引物合成的第一链模板，通常用此引物合成的第一链模板，通常用此引物合成的第一链模板，通常用此引物合成的cDNAcDNA中中中中96%96%来源于来源于来源于来源于rRNArRNA。2.2.Oligo(dT)Oligo(dT)：是一种对：是一种对：是一种对：是一种对mRNAmRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞特异的方法。因绝大多数真核细胞特异的方法。因绝大多数真核细胞特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNAmRNA具有具有具有具有33端端端端Poly(A+)Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅尾，此引物与其配对，仅尾，此引物与其配对，仅尾，此引物与其配对，仅mRNAmRNA可被转可被转可被转可被转录。由于录。由于录。由于录。由于Poly(A+)RNAPoly(A+)RNA仅占总仅占总仅占总仅占总RNARNA的的的的1-4%1-4%，故此种引物合成的，故此种引物合成的，故此种引物合成的，故此种引物合成的cDNAcDNA比随机六聚体作为引物和得到的比随机六聚体作为引物和得到的比随机六聚体作为引物和得到的比随机六聚体作为引物和得到的cDNAcDNA在数量和复杂性方面在数量和复杂性方面在数量和复杂性方面在数量和复杂性方面均要小。均要小。均要小。均要小。3.3.特异性引物特异性引物特异性引物特异性引物：是用含目标：是用含目标：是用含目标：是用含目标RNARNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，的互补序列的寡核苷酸作为引物，的互补序列的寡核苷酸作为引物，的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的用此类引物仅产生所需要的用此类引物仅产生所需要的用此类引物仅产生所需要的cDNAcDNA，导致更为特异的，导致更为特异的，导致更为特异的，导致更为特异的PCRPCR扩增。扩增。扩增。扩增。（二）引物的选择（二）引物的选择 （三）内参的设定（三）内参的设定pp为了保证实验结果的可靠与准确，可在为了保证实验结果的可靠与准确，可在为了保证实验结果的可靠与准确，可在为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因扩增目的基因扩增目的基因时，加入一对内参照基因的特异性引物，同时扩增内参时，加入一对内参照基因的特异性引物，同时扩增内参时，加入一对内参照基因的特异性引物，同时扩增内参时，加入一对内参照基因的特异性引物，同时扩增内参DNADNA，作为对照。，作为对照。，作为对照。，作为对照。pp常用的内参有常用的内参有常用的内参有常用的内参有GAPDHGAPDH（3-3-磷酸甘油醛脱氢酶）磷酸甘油醛脱氢酶）磷酸甘油醛脱氢酶）磷酸甘油醛脱氢酶）、-ActinActin（-肌动蛋白）肌动蛋白）肌动蛋白）肌动蛋白）等。其目的在于避免等。其目的在于避免等。其目的在于避免等。其目的在于避免RNARNA定量误差、定量误差、定量误差、定量误差、加样误差以及各加样误差以及各加样误差以及各加样误差以及各PCRPCR反应体系中扩增效率不均一、各孔间反应体系中扩增效率不均一、各孔间反应体系中扩增效率不均一、各孔间反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温度差等所造成的误差。的温度差等所造成的误差。的温度差等所造成的误差。的温度差等所造成的误差。仪器和主要试剂仪器和主要试剂1.1.基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超薄基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超薄基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超薄基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超薄PCRPCR反应反应反应反应管管管管2.2.总总总总RNARNA3.3.第一链第一链第一链第一链cDNAcDNA合成试剂盒合成试剂盒合成试剂盒合成试剂盒（含有逆转录酶、（含有逆转录酶、（含有逆转录酶、（含有逆转录酶、RNARNA酶抑制剂、缓冲液）酶抑制剂、缓冲液）酶抑制剂、缓冲液）酶抑制剂、缓冲液）4.4.dNTPmixdNTPmix：含：含：含：含dATPdATP、dCTPdCTP、dGTPdGTP、dTTPdTTP各各各各2mmol/L2mmol/L操作步骤操作步骤采用采用采用采用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit 合成合成合成合成cDNAcDNA第一链第一链第一链第一链按下列组分配制按下列组分配制按下列组分配制按下列组分配制RTRT反应液反应液反应液反应液1.1.5X PrimeScrip Buffer 2 5X PrimeScrip Buffer 2 l l2.2.PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 l l3.3.Oligo dT Primer(50Oligo dT Primer(50 M)0.5 M)0.5 l l4.4.Random 6mers(100Random 6mers(100 M)M)0.5 0.5 l lTotal RNA 6.5 Total RNA 6.5 l l反转录反应条件如下反转录反应条件如下反转录反应条件如下反转录反应条件如下3737 60min 60min （反转录反应）（反转录反应）（反转录反应）（反转录反应）8585 5sec 5sec （反转录酶失活反应）（反转录酶失活反应）（反转录酶失活反应）（反转录酶失活反应）注：反转录步骤在注：反转录步骤在注：反转录步骤在注：反转录步骤在PCRPCR仪中进行仪中进行仪中进行仪中进行第一链第一链第一链第一链cDNAcDNA2 2 l lPerfectShot Taq(PerfectShot Taq(绿色绿色绿色绿色)1010 l l上游引物上游引物上游引物上游引物(10(10 M)M)1 1 l l下游引物下游引物下游引物下游引物(10(10 M)M)1 1 l lRNase free H2O RNase free H2O 6 6 l l总体积总体积总体积总体积2020 l l取取取取0.2 ml PCR0.2 ml PCR0.2 ml PCR0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头注意每换一种试剂换一个新吸头注意每换一种试剂换一个新吸头注意每换一种试剂换一个新吸头)：如配好的反应液较多沾到管壁上，可将如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCRPCR反应管置台式离反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后然后然后然后将反应管放到将反应管放到基因扩增仪基因扩增仪(PCR(PCR仪仪)上上.PCR反应体系反应体系 94949494预变性预变性预变性预变性5 5 5 5分钟后开始以下循环分钟后开始以下循环分钟后开始以下循环分钟后开始以下循环 94 30 94 30 94 30 94 30 秒秒秒秒 60 30 60 30 60 30 60 30 秒秒秒秒 30 30 30 30 循环循环循环循环 72 40 72 40 72 40 72 40 秒秒秒秒 72 5 72 5 72 5 72 5 分钟分钟分钟分钟 4 4 4 4 保温保温保温保温实验过程约实验过程约实验过程约实验过程约1 1 1 1小时小时小时小时30303030分钟分钟分钟分钟PCR参数设置参数设置pp琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度凝胶孔径的大小决定于琼