SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量.ppt

SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量定蛋白质分子量 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动物聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动物生物化学实验技术教学中一个重要实验之生物化学实验技术教学中一个重要实验之一。一。能够带动生化实验技术综合型能够带动生化实验技术综合型实验项目的开设。实验项目的开设。如：蛋白质盐析沉淀提取如：蛋白质盐析沉淀提取 葡聚葡聚糖凝胶层析分离糖凝胶层析分离 DEAE-纤维素分离纤维素分离提纯蛋白质提纯蛋白质 蛋白质纯度鉴定、蛋白蛋白质纯度鉴定、蛋白质分子量测定等。质分子量测定等。一、实验目的一、实验目的l通通过过该该实实验验使使学学生生掌掌握握SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理；测定蛋白质分子量的原理；l掌掌握握该该技技术术的的操操作作方方法法（基基础础性性很很强，使用范围宽阔强，使用范围宽阔；l运运用用SDS-PAGESDS-PAGE测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量及染色鉴定。及染色鉴定。二、实验原理二、实验原理 l带带电电质质点点在在电电场场中中向向带带有有异异相相电电荷荷的的电电极极移移动动，这种现象称为这种现象称为电泳电泳。l电泳分类：移动界面电泳、区带电泳等。电泳分类：移动界面电泳、区带电泳等。l区区带带电电泳泳 是是在在半半固固相相或或胶胶状状介介质质上上加加一一个个点点或或一一薄薄层层样样品品溶溶液液，然然后后加加电电场场，分分子子在在支支持持介介质质上上或或支支持介质中迁移。持介质中迁移。区带电泳使用不同的支持介质，有区带电泳使用不同的支持介质，有滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用现在则多用聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（PAGEPAGE）和和琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶。（一）分类（一）分类 PAGEPAGE根根据据其其有有无无浓浓缩缩效效应应，分分为为连续系统和不连续系统连续系统和不连续系统两大类：两大类：1.1.连连续续系系统统：电电泳泳体体系系中中缓缓冲冲液液pHpH值值及及凝凝胶胶浓浓度度相相同同，带带电电颗颗粒粒在在电电场作用下，场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。主要靠电荷和分子筛效应。2.2.不不连连续续系系统统：由由于于缓缓冲冲液液离离子子成成分分、pHpH、凝凝胶胶浓浓度度及及电电位位梯梯度度的的不不连连续续性性，带带电电颗颗粒粒在在电电场场中中泳泳动动不不仅仅有有电电荷荷效效应应，分分子子筛筛效效应应，还还具具有有浓浓缩缩效效应应，因因而而其其分分离离条条带带清清晰度及分辨率均较前者佳。晰度及分辨率均较前者佳。（二）特点：（二）特点：SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDSSDS（十二（十二烷基磺酸钠）。烷基磺酸钠）。蛋蛋白白质质在在一一定定浓浓度度的的含含有有强强还还原原剂剂的的SDSSDS溶溶液液中中，与与SDSSDS分分子子按按比比例例结结合合，形形成带负电荷的成带负电荷的SDS-SDS-蛋白质复合物。蛋白质复合物。蛋蛋白白质质丧丧失失了了原原有有的的电电荷荷状状态态形形成成仅仅保保持持原原有有分分子子大大小小为为特特征征的的负负离离子子团团块块，降降低低或或消消除除了了各各种种蛋蛋白白质质分分子子之之间间天然的电荷差异天然的电荷差异，因此在进行电泳时，因此在进行电泳时，蛋白质分蛋白质分子移速度取决于分子大小。子移速度取决于分子大小。当分子量在当分子量在15000Da15000Da到到200000Da200000Da之之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数数呈线性关系呈线性关系。合下式：合下式：，式中，式中 将已知分子量的将已知分子量的标准蛋白质的迁标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图移率对分子量对数作图，可获得一条，可获得一条标准曲线标准曲线，未知蛋白质在相同条件下，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。在标准曲线上求得分子量。图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱 图2 电泳迁移率与logMW之间的关系 94 00062 00043 00031 00020 10014 400胶槽123注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白得到同行专家赞 采采用用SDS-SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳法法测测蛋蛋白白质质分分子子量量时时，必必须须完完全全打打开开蛋蛋白白质质之之间间的的二二硫硫键键，使使蛋蛋白白质质分分子子被被解解聚聚，SDSSDS才才能能定定量量地地结结合合到到亚亚基基上上。因因此此在在用用SDSSDS处处理理样样品品同同时时用用巯巯基基乙乙醇醇处处理理。巯巯基基乙乙醇醇是是一一种种强强还还原原剂剂，它它使使被被还还原原的的二二硫硫键键不不易易再再氧氧化化，从从而而使使很很多多不不溶溶性蛋白质溶解而与性蛋白质溶解而与SDSSDS定量结合。定量结合。三、三、实验试剂和器材实验试剂和器材 材料 实验试剂 1.低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200l蒸馏水，置-20保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解。2.30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中 3.10%SDS（十二烷基磺酸钠）4.1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g（PH计）（7 7）10%10%过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵(AP)(AP)（8 8）TEMEDTEMED（四甲基乙二胺）（四甲基乙二胺）（四甲基乙二胺）（四甲基乙二胺）（9 9）样品溶解液：）样品溶解液：）样品溶解液：）样品溶解液：SDSSDS（100mg100mg）+巯基乙醇（巯基乙醇（巯基乙醇（巯基乙醇（0.1ml0.1ml）+溴酚蓝（溴酚蓝（溴酚蓝（溴酚蓝（2mg2mg）+甘油（甘油（甘油（甘油（2g2g）+0.05mol/L pH8.0Tris-+0.05mol/L pH8.0Tris-HCl HCl（2ml2ml），最后定容至），最后定容至），最后定容至），最后定容至10ml10ml。（1010）固定液：取）固定液：取）固定液：取）固定液：取50%50%甲醇甲醇甲醇甲醇454ml454ml，冰乙酸，冰乙酸，冰乙酸，冰乙酸46ml46ml混匀。混匀。混匀。混匀。（1111）染色液：称取考马斯亮蓝）染色液：称取考马斯亮蓝）染色液：称取考马斯亮蓝）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125gR250 0.125g，加上述固定，加上述固定，加上述固定，加上述固定液液液液 250ml250ml，过滤后备用。过滤后备用。过滤后备用。过滤后备用。（1212）脱色液：冰乙酸）脱色液：冰乙酸）脱色液：冰乙酸）脱色液：冰乙酸75ml75ml，甲醇，甲醇，甲醇，甲醇50ml50ml，加蒸馏水定容至，加蒸馏水定容至，加蒸馏水定容至，加蒸馏水定容至1000ml1000ml。（1313）电极缓冲液（内含）电极缓冲液（内含）电极缓冲液（内含）电极缓冲液（内含0.1%SDS0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.05mol/LTris-0.384mol/L0.384mol/L甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液pH8.3pH8.3）：称）：称）：称）：称Tris6.0gTris6.0g，甘，甘，甘，甘 氨酸氨酸氨酸氨酸28.8g28.8g，加入，加入，加入，加入SDS1gSDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至，加蒸馏水使其溶解后定容至，加蒸馏水使其溶解后定容至，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml1000ml。实验器材实验器材l 垂直板电泳装置垂直板电泳装置l直流稳压电源电泳厚胶浓度后要做直流稳压电源电泳厚胶浓度后要做8各小时，薄胶各小时，薄胶5各小时）各小时）l 电泳仪电泳仪l 标准型酸度计（标准型酸度计（TLD80-2B）l 离心机等离心机等 四、四、实验过程实验过程 如：如：免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白G G G G 分子量的测定分子量的测定分子量的测定分子量的测定 （一）血清（一）血清（一）血清（一）血清-球蛋白的提取球蛋白的提取球蛋白的提取球蛋白的提取 硫酸胺盐析沉淀法硫酸胺盐析沉淀法硫酸胺盐析沉淀法硫酸胺盐析沉淀法 （二）（二）（二）（二）-球蛋白脱盐纯化球蛋白脱盐纯化球蛋白脱盐纯化球蛋白脱盐纯化 葡聚糖凝胶过滤（柱层析法）除去硫酸胺，得到葡聚糖凝胶过滤（柱层析法）除去硫酸胺，得到葡聚糖凝胶过滤（柱层析法）除去硫酸胺，得到葡聚糖凝胶过滤（柱层析法）除去硫酸胺，得到-球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白（去年完成的基金项目）（去年完成的基金项目）（去年完成的基金项目）（去年完成的基金项目）（三）纯化免疫球蛋白（三）纯化免疫球蛋白（三）纯化免疫球蛋白（三）纯化免疫球蛋白G G G G DEAE-DEAE-DEAE-DEAE-离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白G G G G。（四）（四）（四）（四）SDS-SDS-SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定血液免疫球血液免疫球血液免疫球血液免疫球蛋白蛋白蛋白蛋白G G G G的分子量的分子量的分子量的分子量（连续四个单项实验）。连续四个单项实验）。（1）制胶（简单叙述）（双层胶，摸索胶浓度）A.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个干净的锥形瓶。把玻璃板在灌胶支架上固定好。B.按比例配好分离胶，溶液立即倾入制胶模板中(1 5模板)，加少许蒸馏水，待胶凝固后，倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，样梳需一次平稳插入，静置40分钟，待模板中的胶定型后，轻轻取出梳形样品槽模具，梳口处不得有气泡，拔出样梳后，在上槽内加入缓冲液。C.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,D.加样（摸索加样量）取10l标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10l 2倍样品缓冲液，上样量为20l。取10l样品溶液，再加入10l 2倍样品缓冲液，上样量分别为5l 和10l。E.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。F.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在8mA，（电流、电压）当进入分离胶后改为16mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。G.凝胶板剥离与染色 电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色 过夜。H.脱色 染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色。剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱 图2 电泳迁移率与logMW之间的关系 五、实验结果分析94 00062 00043 00031 00020 10014 400胶槽123注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白六、分析计算六、分析计算绘制标准曲线绘制标准曲线：按下式计算 电泳迁移率电泳迁移率=样品迁移距离样品迁移距离/溴酚兰迁移距离溴酚兰迁移距离 以每个以每个蛋白标准的分子量对数蛋白标准的分子量对数对它的相对对它的相对迁移迁移率作图率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶同一块凝胶上的上的样品的分子量测定才具有可靠性。样品的分子量测定才具有可靠性。标准蛋白分子量（标准试剂盒）：标准蛋白分子量（标准试剂盒）：97400kD、66200kD、43000kD、31000kD、20100kD、14400kD。采用不连续采用不连续SDS-PAGE电泳法对所分电泳法对所分离纯化的蛋白质进行纯度鉴定，发现图中离纯化的蛋白质进行纯度鉴定，发现图中电泳图谱可以清晰的看到电泳图谱可以清晰的看到两条蛋白带两条蛋白带。两条蛋白带代表两条蛋白带代表绵羊免疫球蛋白绵羊免疫球蛋白G的重的重链和轻链。链和轻链。计算分析结果表明：计算分析结果表明：绵羊血清绵羊血清lgG重链和轻链的分子量分别重链和轻链的分子量分别为为50000和和28000Kd。一般说来，当蛋白。一般说来，当蛋白质的分子量在质的分子量在200000至至15000 kD 之间时，之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。实验结果各谱带所代表的成分的分子量的实验结果各谱带所代表的成分的分子量的范围均在此之间。范围均在此之间。用用用用SDS-PAGESDS-PAGE垂直板电泳测得绵羊血清具有一定的可信度垂直板电泳测得绵羊血清具有一定的可信度垂直板电泳测得绵羊血清具有一定的可信度垂直板电泳测得绵羊血清具有一定的可信度 。七、思考题七、思考题l在在不不连连续续体体系系SDS-PAGESDS-PAGE中中,当当分分离离胶胶加加完完后后,需需在其上加一层水在其上加一层水,为什么为什么?l在在不不连连续续体体系系SDS-PAGESDS-PAGE中中,分分离离胶胶与与浓浓缩缩胶胶中中均均含有含有TEMEDTEMED和和AP,AP,试述其作用试述其作用?l样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?十二、达到预期目标十二、达到预期目标 1.SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳技术聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动是动物生物化学实验技术教学中物生物化学实验技术教学中一个综合性实一个综合性实验项目验项目，且是一个较高水平的一个实验项且是一个较高水平的一个实验项目。目。蛋白质盐析沉淀提取蛋白质盐析沉淀提取 凝胶层析分离（上年基金项目已完成）凝胶层析分离（上年基金项目已完成）DEAE-纤维素分离提纯蛋白质纤维素分离提纯蛋白质 蛋白质分子量测定、生物分子纯度鉴定等综合项目（五蛋白质分子量测定、生物分子纯度鉴定等综合项目（五个单项实验项目）。个单项实验项目）。2.该项目的完成对我们该项目的完成对我们课程的课程的建设起到了促进发展建设起到了促进发展的作用，达到了的作用，达到了我们预期目标。我们预期目标。3.该实验项目的开设，使学生掌该实验项目的开设，使学生掌握了利用聚丙稀酰胺凝胶电泳技术分握了利用聚丙稀酰胺凝胶电泳技术分离蛋白质离蛋白质、SDSPAGE测定蛋白质测定蛋白质分子量的分子量的基本理论及实验技术。基本理论及实验技术。4.通过对生物大分子的分离、通过对生物大分子的分离、纯化、鉴定等过程的学习，使学生纯化、鉴定等过程的学习，使学生在在综合性实验技术方面综合性实验技术方面 有了一个系有了一个系统的认识及动手能力统的认识及动手能力,为在现代分子为在现代分子生物学技术等手段方面的运用打下生物学技术等手段方面的运用打下了良好的基础。了良好的基础。5.5.“SDS SDS 聚丙稀酰胺凝胶电聚丙稀酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量泳法测定蛋白质分子量”一实验的开一实验的开设达到了与国内同类院校相当的较高设达到了与国内同类院校相当的较高水平。水平。对本科生的实验教学、本科生的对本科生的实验教学、本科生的论文设计、研究生的高级生化实验等论文设计、研究生的高级生化实验等方面都充实了内容。方面都充实了内容。