维生素类药物的分析-(4).ppt

第五章维生素类药物的分析第五章维生素类药物的分析THE ANALYSIS OF VITAMINESTHE ANALYSIS OF VITAMINES+维维生生素素是是维维持持人人体体正正常常生生理理机机能能所所必必需需的生物活性物质。的生物活性物质。如如果果人人体体缺缺少少某某种种维维生生素素，就就会会引引起起维维生生素素缺缺乏乏症症，而而影影响响人人体体的的正正常常生生理理机机能。能。例如例如:VA缺乏缺乏夜盲症夜盲症 VB1缺乏缺乏脚气病脚气病概概 述述 脂溶性：脂溶性：水溶性：水溶性：按溶解性分类VA、VD、VE、VK等等B族（族（VB1、VB2等）、等）、VC、烟酸、叶酸、泛酸等、烟酸、叶酸、泛酸等第一节第一节 维生素维生素A A的分析的分析+一结构与性质一结构与性质1化学结构化学结构lR=HVA醇VA1lR=COCH3VA醋酸酯lR=COC15H31VA棕榈酸酯+（1）环己烯）环己烯+共轭多烯侧链；共轭多烯侧链；+（2）天然）天然VA侧链为全反式；侧链为全反式；+（3）天然来源主要是鱼肝油，为醋）天然来源主要是鱼肝油，为醋 酸酯，棕榈酸酯等酸酯，棕榈酸酯等,目前多由人目前多由人 工合成。工合成。结构特点：结构特点：a.紫外吸收紫外吸收具有共轭多烯侧链具有共轭多烯侧链紫外吸收。紫外吸收。最最大大吸吸收收波波长长在在325328nm，随随VA存存在在状状态态以以及及所所用用的的溶溶剂剂，最大吸收波长的位置有所不同最大吸收波长的位置有所不同2.性质性质 不溶于水不溶于水 溶于乙醚，氯仿，溶于乙醚，氯仿，异丙醇异丙醇，环己烷环己烷，脂肪和油。，脂肪和油。b.溶解性：溶解性：共轭多烯侧链共轭多烯侧链性质非常活泼性质非常活泼.c.不稳定性不稳定性维生素维生素A的氧化产物：的氧化产物：环氧化物环氧化物维生素维生素A醛醛维生素维生素A酸酸or 鉴别鉴别 含量测定含量测定 d.与与SbCl3作用作用 Carr-Price反应反应无水+二二.鉴别试验鉴别试验+1.三氯化锑反应 无水+2.紫外吸收光谱紫外吸收光谱VA的无水乙醇溶液在的无水乙醇溶液在326nm有最有最大吸收。大吸收。确认醇或酯，是醋酸酯或其他酸酯，确认醇或酯，是醋酸酯或其他酸酯，例：例：VA和其标准品用环己烷溶解和其标准品用环己烷溶解+展开剂：环己烷展开剂：环己烷乙醚（乙醚（80：20）+板：硅胶板：硅胶G+显色：显色：SbCl3T.S.+Rf：VA醇醇 0.08VA醋酸酯醋酸酯 0.41VA棕榈酸酯棕榈酸酯 0.753、TLC：+三含量测定三含量测定1.概述概述共轭多烯的结构共轭多烯的结构具有特征的紫外吸收。具有特征的紫外吸收。相关物质相关物质结构相似结构相似,维生素维生素A最大吸收最大吸收波长附近也有吸收，对测定有影响。波长附近也有吸收，对测定有影响。Morton和和Stubbs等人提出了三点校正法等人提出了三点校正法。紫外分光光度法三点校正法紫外分光光度法三点校正法2.原理（根据、假定）原理（根据、假定）物质对光的吸收具有加和性，即物质对光的吸收具有加和性，即维生素维生素A中的不相关吸收在中的不相关吸收在310340nm范围内近似一条直线。范围内近似一条直线。效价为维生素A1的40%，max345350nml3.相关物质的吸收相关物质的吸收a.维生素维生素A的衍生物的衍生物维生素A2去氢维生素A效价低于维生素A1，max385390nmlb.维生素维生素A的氧化产物的氧化产物l已介绍。l维生素维生素A3去水维生素去水维生素Alc.合成时的中间体合成时的中间体侧连有侧连有4个双键个双键应有应有种异构体。种异构体。目前，包括维生素目前，包括维生素A在内，共发现有在内，共发现有6种异种异构体。它们是：构体。它们是：le.维生素维生素A异构体异构体ld.鲸醇鲸醇维生素维生素A醇的二聚体，没有生物活性醇的二聚体，没有生物活性名称顺反异构max(nm)相对效价新维生素Aa2-顺式32875%新维生素Ab4-顺31924%新维生素Ac2,4-二顺31115%异维生素Aa6-顺32321%异维生素Ab2,6-二顺32424%维生素A全反式325328100%新维生素Aa新维生素Ab新维生素Ac异维生素Aa异维生素Ab维生素A 1：维生素A的max 2、3：分别在1两侧 4.三个波长的选择方法+等波长差法：1=328nm;2=316nm;3=340nmn这两个波长分别在这两个波长分别在 1两侧两侧12nm处，即处，即+等吸光度法：等吸光度法：1=325nm;2=310nm;3=334nmnVA在这两个波长下的吸光度应该等于在这两个波长下的吸光度应该等于 1下下 的吸光度的的吸光度的 ，即，即 5.方法方法Chp收载有2种方法。第一法（适用于酯式维生素第一法（适用于酯式维生素A的测定）的测定）a.操作方法+最大吸收波长确认最大吸收波长确认+max 在326329nm，第一法测定。+max不在326329nm，第二法测定。lb.计算方法计算方法测定波长吸光度吸光度比值吸光度比值差计算值规定值3000.5553160.907(326)3281.000(329)3400.8113600.299+计算吸收度比及比值差计算吸收度比及比值差l首先要计算吸收度比值。l然后计算吸收度的比值差。测定波长吸光度吸光度比值吸光度比值差计算值规定值3000.5553160.907(326)3281.000(329)3400.8113600.299+计算校正吸收度计算校正吸收度l吸收度校正公式：换算因数换算因数定义：每一个数值所相当的效价。+1IU=0.344g全反式维生素A醋酸酯，+1g的维生素A醋酸酯就相当于 +维生素A醋酸酯+练习题：维生素AD胶丸中维生素A的含量测定+已知：平均胶丸重为0.0815g+维生素A的标示量为10000IU/丸+取样：波长 吸收度比值规定值比值差3000.3740.574 0.5550.0193160.5840.896 0.907-0.013280.6521103400.5340.819 0.8110.0083600.2110.339 0.2990.04l l求：维生素求：维生素求：维生素求：维生素A A的标示百分含量。的标示百分含量。的标示百分含量。的标示百分含量。l l测定数据如下表测定数据如下表首先要求样品的。根据比尔定律lA为测得吸收度or校正吸收度首先计算吸收度比值和吸收度比值差。（填于上表）由此可知，应该用测得的328nm处的吸收度计算。然后计算校正吸收度与未校正吸收度相差的百分数由结果知，需计算校正吸收度。所以，维生素A的标示含量这样第二法（皂化法）：消除植物油干扰：适合VA醇b.b.在在300300，310310，325325和和334nm334nm处测定吸收度，找出处测定吸收度，找出maxmaxc.c.计算计算d.d.校正公式校正公式 A A325325（校）（校）=6.815A=6.815A325325-2.555A-2.555A310310-4.260A-4.260A334334e.e.判断判断 5、注意事项、注意事项 （1）VA遇光易氧化变质，操作应半暗室遇光易氧化变质，操作应半暗室 中快速进行，所用试剂不得含氧化性物中快速进行，所用试剂不得含氧化性物 质，以防质，以防VA紫外线或氧化性物质破坏。紫外线或氧化性物质破坏。（2）用三校正法测定时，一点在）用三校正法测定时，一点在max处，处，其余两点均为吸收曲线的上升和下降陡其余两点均为吸收曲线的上升和下降陡坡处。对波长的正确性要求严格。坡处。对波长的正确性要求严格。340nm处，若波长误差处，若波长误差0.5nm，可影响，可影响结果结果-3.12.07%。所以测定时所用仪器的。所以测定时所用仪器的波长读数应注意，必要时应作标准。波长读数应注意，必要时应作标准。维生素维生素A醋酸酯胶丸含量测定醋酸酯胶丸含量测定:取内容物取内容物39.1mg,加环加环己烷溶解并稀释成己烷溶解并稀释成100ml，在下列五个波长处测得吸，在下列五个波长处测得吸收度收度A值如下：值如下：测定波长(nm)测得吸收度A值吸收度比值差值规定值计算值3000.3740.5553160.5920.9073280.6631.0003400.5530.8113600.2280.299 已知：平均胶丸内容物重为已知：平均胶丸内容物重为已知：平均胶丸内容物重为已知：平均胶丸内容物重为0.08736g;0.08736g;维生素维生素维生素维生素A A的标示量为的标示量为的标示量为的标示量为3000IU/3000IU/丸丸丸丸 试求：维生素试求：维生素试求：维生素试求：维生素A A的标示百分含量？的标示百分含量？的标示百分含量？的标示百分含量？维生素A醋酸酯胶丸的含量测定，取内容物W，加环己烷溶解并稀释至10ml，摇匀，精密量取0.1ml,再加环己烷稀释至10ml，使其浓度为915IU/ml。已知内容物平均重量为80.0mg,每丸标示量为10000IU。试计算取样量（W）的范围是多少？+第二节第二节 维生素维生素E的分析的分析名称：消旋生育酚醋酸酯母核：苯骈二氢吡喃衍生物 苯环上有一乙酰化的酚羟基侧链：脂肪烷烃一化学结构与性质 二、鉴别试验二、鉴别试验+1、硝酸反应：、硝酸反应：本品，无水乙醇溶解，加硝酸，本品，无水乙醇溶解，加硝酸，75加热约加热约15分钟，显橙红色。分钟，显橙红色。+2、水解后氧化反应：、水解后氧化反应：本品，在碱性条件下水解，得本品，在碱性条件下水解，得生育酚，生育酚，在联吡啶和三氯化铁试液的作用下，反应产在联吡啶和三氯化铁试液的作用下，反应产生血红色配离子生血红色配离子。+3、UV吸收：+VE的0.01%无水乙醇液：+max=284nm+min=254nm三、杂质检查三、杂质检查+检查游离生育酚检查游离生育酚:ChP2000 P798:ChP2000 P798+取取0.1g0.1g样品，按铈量法用样品，按铈量法用Ce(SOCe(SO4 4)2 2(0.01mol/L)(0.01mol/L)滴定，以二苯胺为滴定，以二苯胺为 指示剂，消耗指示剂，消耗Ce(SOCe(SO4 4)2 2液不得超过液不得超过1.0ml1.0ml。（一）铈量法+1、原理：、原理：VE用硫酸加热回流，水解成生育酚，用硫用硫酸加热回流，水解成生育酚，用硫酸铈定量地氧化为对一生育醌，过量的硫酸酸铈定量地氧化为对一生育醌，过量的硫酸铈氧化二苯胺指示剂而指示滴定终点。铈氧化二苯胺指示剂而指示滴定终点。终点：亮黄终点：亮黄灰紫灰紫 空白试验空白试验四、含量测定四、含量测定 2、反应条件、反应条件+（1）VE在H2SO4酸性条件下水解为宜。碱性溶液中游离生育酚易被氧化。Ce(SO4)2液滴定在酸性溶液中进行,如在碱性中会生成碱式盐而影响测定。（2）Ce(SOCe(SO4 4)2 2溶于酸水溶液，不溶于醇溶于酸水溶液，不溶于醇,生生育酚溶于酸而不溶于水育酚溶于酸而不溶于水,滴定过程中应有一定滴定过程中应有一定浓度的乙醇。浓度的乙醇。（3）本法适用于纯度高的）本法适用于纯度高的VE供试品。供试品。（二）气相色谱法：（二）气相色谱法：Chp20001、色谱条件及系统适应性试验+色谱柱：2m4mmI.D.硼硅玻璃柱，内装硅藻土（80100目）+固定相：硅酮（OV-17）涂布浓度 2%+载气：N2，+流速:含2%固定相：以1820分钟为宜；含5%固定相：以3032分钟为宜+柱温：柱温：265+内标：正三十二烷内标：正三十二烷+检测器：检测器：FID（氢火焰离子化检测器）（氢火焰离子化检测器）+性能要求：性能要求：理论塔板数按理论塔板数按VE峰计算应不低于峰计算应不低于500，VE峰与内标物质峰的分离度应大于峰与内标物质峰的分离度应大于2。2、溶液配制：、溶液配制：+内标溶液：正三十二烷的环己烷溶液 （1.0mg/ml）+对照溶液：对照品溶解于内标溶液中(1mg/ml)+供试品溶液：供试品约50mg，用内标溶液，溶解并稀释至50ml 4、供试品测定、供试品测定+mg=FAxMs/AsAx：供试品峰面积：供试品峰面积 F：校正因子：校正因子 As：内标物的峰面积内标物的峰面积5、特点：、特点：（1）简便快速、专属性强，适用于）简便快速、专属性强，适用于VE、VE制制剂及多种维生素制剂中剂及多种维生素制剂中VE的测定。的测定。（2）需要特殊仪器）需要特殊仪器（三）高效液相色谱法（三）高效液相色谱法 日本药局方（JP13）+色谱条件：柱：ODS 流动相：甲醇水(49:1)检测波长：292nm+对照品法定量第三节维生素第三节维生素B1的分析的分析l一、化学结构与性质l1.结构：l氯化3-（4-氨基-2-甲基嘧啶-5-）甲基-5-（2-羟乙基）-4-甲基噻唑的盐酸盐 2.结构特点：a.氨基嘧啶氨基嘧啶次甲基次甲基噻唑环季铵化合物噻唑环季铵化合物 b.碱性基团：碱性基团：嘧啶环上的氨基嘧啶环上的氨基 可与酸成盐可与酸成盐 噻唑环上的季铵噻唑环上的季铵 +3.性质性质：+硫色素反应硫色素反应 VB1噻噻唑唑环环在在碱碱性性条条件件下下可可被被铁铁氰氰化化钾钾K3Fe(CN)6等等一一些些氧氧化化剂剂氧氧化化后后，与与嘧嘧啶啶环环上上的的氨氨基基缩缩合合成成具具有有荧荧光光的硫色素。的硫色素。沉淀反应沉淀反应 VB1的的含含氮氮杂杂环环，能能和和生生物物碱碱沉沉淀淀试试剂剂反应产生沉淀。反应产生沉淀。如如：VB1与与硅硅钨钨酸酸反反应应可可生生成成组组成成一一定定的沉淀。的沉淀。重量法测定重量法测定VB1含量。含量。硫胺显碱性硫胺显碱性具有两个碱性基团具有两个碱性基团:噻唑环上的季铵噻唑环上的季铵 嘧啶环上的氨基嘧啶环上的氨基可以和酸成盐。可以和酸成盐。如：盐酸硫胺、硝酸硫胺如：盐酸硫胺、硝酸硫胺。加碱分解后与醋酸铅反应加碱分解后与醋酸铅反应 VB1与与NaOH试试液液一一起起加加热热，分分解解产产生生NaS，可可与与PbAc2反反应应生生成成PbS的的黑黑色色沉沉淀。淀。维生素维生素B1的水溶液显氯化物的特征反应。的水溶液显氯化物的特征反应。l二二.鉴别试验鉴别试验l1.硫色素荧光反应硫色素荧光反应VB1专属反应，用于鉴别和含量测定。2、沉淀反应、沉淀反应：可与某些生物碱沉淀试剂生成组成恒定的可与某些生物碱沉淀试剂生成组成恒定的 沉淀沉淀 如：与碘化汞钾产生淡黄色沉淀如：与碘化汞钾产生淡黄色沉淀 与碘生成红色沉淀与碘生成红色沉淀 与硅钨酸生成白色沉淀与硅钨酸生成白色沉淀 与苦味酸生成扇形白色结晶与苦味酸生成扇形白色结晶 三三.含量测定含量测定+非水滴定法非水滴定法（ChP所用方法）所用方法）+硅钨酸重量法硅钨酸重量法+银量法银量法+硫色素荧光法硫色素荧光法+紫外分光光度法紫外分光光度法+比色法比色法+络合滴定法络合滴定法 （一）非水溶液滴定法（一）非水溶液滴定法：1、原理：VB1分子中含有已成盐的伯胺和季铵基团，在非水溶液中，在醋酸汞存在下，均可被高氯酸滴定。2、方法：、方法：溶剂：冰醋酸溶剂：冰醋酸 指示剂：喹哪定红指示剂：喹哪定红-亚甲蓝混合指示液亚甲蓝混合指示液 滴定剂：高氯酸滴定剂：高氯酸 醋酸汞：醋酸汞：终点：天蓝色终点：天蓝色 空白校正：空白校正：T=16.86mg/ml（二）硅钨酸重量法（二）硅钨酸重量法2VB1硅钨酸白色沉淀4HCl1、原理：VB1在酸性溶液中与硅钨酸作用产生沉淀，根据沉淀的重量和供试品的重量即可计算其含量。2、计算：、计算：2VB1的分子量为2337.27 沉淀的分子量为3479.22 换算因数=0.1939（含义：1g沉淀相当于0.1939gVB1）+3、测定方法：、测定方法：4、实验条件、实验条件（1）取样量：应在50mg左右，不得少于25mg。（2）加入盐酸的目的：易于过滤。酸量不足：沉淀的颗粒过细。酸量过多：无太大影响。（3）硅钨酸的用量：）硅钨酸的用量：硅钨酸：硅钨酸：VB1=8：1用量不足，导致结果偏低用量不足，导致结果偏低（4）干燥温度：）干燥温度：80，干燥，干燥3hr，至恒重，沉淀含，至恒重，沉淀含4分子结晶水分子结晶水，换算因数为，换算因数为0.1939（5）硅钨酸的加入速度）硅钨酸的加入速度 用滴管一滴一滴加入，纯度高快加，纯度用滴管一滴一滴加入，纯度高快加，纯度低慢加。低慢加。防止沉淀表面吸附的杂质来不及离开而被防止沉淀表面吸附的杂质来不及离开而被沉淀包围。沉淀包围。（6）煮沸时间）煮沸时间 25min为宜为宜 使沉淀颗粒大，利于过滤洗涤。使沉淀颗粒大，利于过滤洗涤。（7）沉淀的洗涤 用热稀盐酸洗涤，洗涤液用量不得多于50ml，否则，沉淀会部分溶解（8）洗器 用4号垂熔玻璃漏斗为宜。4、重量法特点（1）比较准确、灵敏；（2）方法简便，不需要特殊仪器；（3）恒重比较费时间。第四章第四章 维生素维生素C的分析的分析一一.化学结构化学结构 结构特点：维生素C分子中具有2个手性C原子，具有4种光学异构体。其中生理活性最强的是L（+）-抗坏血酸lD(-)-异抗坏血酸lL(+)-异抗坏血酸lL(+)-抗坏血酸lD(-)-抗坏血酸 具有内酯结构。具有内酯结构。碱性下可水解。碱性下可水解。具有烯二醇基。具有烯二醇基。还原性，能够被氧化成去氢抗还原性，能够被氧化成去氢抗 坏血酸。坏血酸。酸性酸性,能与碱成盐。能与碱成盐。二性质与鉴别试验 1.酸性 烯二醇结构酸性。C3-OH，pKa=4.17(共轭效应)C2-OH，pKa=11.57(邻位羰基)一元酸.能与NaHCO3作用生成钠盐。2.还原性还原性 烯二醇基还原性。如：+3.水解反应水解反应 L-二酮古罗糖酸(无生物活性)4.荧光反应荧光反应5.糖的性质糖的性质VC的结构很象糖结构，具有糖的性质。这个反应的摩尔比是12。三三含量测定含量测定1.碘量法碘量法a.原理 b.操作终点颜色：无色蓝色1ml0.1mol/L碘液1ml8.806mgC6H8O6 c.讨论讨论 反应条件反应条件 酸性酸性 使使VC在空气中氧化速度减慢。在空气中氧化速度减慢。溶剂溶剂 新沸放冷的水。新沸放冷的水。减少水中溶解氧的影响。减少水中溶解氧的影响。还原性物质的影响及排除还原性物质的影响及排除 VC注注射射液液中中常常加加有有亚亚硫硫酸酸盐盐如如NaHSO3作作为为抗抗氧剂氧剂.排除：加入丙酮或甲醛。排除：加入丙酮或甲醛。+2.2,6-二氯吲哚酚滴定法二氯吲哚酚滴定法 原理：原理：在酸性下在酸性下 氧化型是红色的氧化型是红色的;还原型是无色的还原型是无色的 酸酸性性下下直直接接用用2,6-二二氯氯吲吲哚哚酚酚滴滴定定，用用滴滴定定剂剂自自身身的的颜颜色色变变化化指指示示终终点点，不不需需要另外的指示剂。要另外的指示剂。l所以，终点的颜色是溶液由无色变为红色。氧化型（红色）还原型（无色）+