第十四章维生素类药物的分析.pptx

第十四章维生素类药物的分析第十四章维生素类药物的分析 维生素得发现就是维生素得发现就是维生素得发现就是维生素得发现就是20202020世纪得伟世纪得伟世纪得伟世纪得伟大发现之一。大发现之一。大发现之一。大发现之一。1897189718971897年年年年,C,C,C,C、艾克曼在艾克曼在艾克曼在艾克曼在爪哇发现只吃精磨得白米即可患脚爪哇发现只吃精磨得白米即可患脚爪哇发现只吃精磨得白米即可患脚爪哇发现只吃精磨得白米即可患脚气病气病气病气病,未经碾磨得糙米能治疗这种未经碾磨得糙米能治疗这种未经碾磨得糙米能治疗这种未经碾磨得糙米能治疗这种病。并发现可治脚气病得物质能用病。并发现可治脚气病得物质能用病。并发现可治脚气病得物质能用病。并发现可治脚气病得物质能用水或酒精提取水或酒精提取水或酒精提取水或酒精提取,当时称这种物质为当时称这种物质为当时称这种物质为当时称这种物质为“水溶性水溶性水溶性水溶性B B B B”。Christiaan Eijkman1929诺贝尔生物医学奖诺贝尔生物医学奖TheDiscoveryofVitamin发现简史发现简史公元前公元前3500年年-古埃及人发现能防治夜盲症得物质古埃及人发现能防治夜盲症得物质,也就就是后来得维也就就是后来得维A。1747年年-苏格兰医生林德发现柠檬能治坏血病苏格兰医生林德发现柠檬能治坏血病,也就就是后来得维也就就是后来得维C。1831年年-胡萝卜素被发现。胡萝卜素被发现。195年年-科学家认糙皮病就是由于缺乏某种维生素而造成得科学家认糙皮病就是由于缺乏某种维生素而造成得1916年年-维生素维生素B被分离出来。被分离出来。1917年年-英国医生发现鱼肝油可治愈佝偻病英国医生发现鱼肝油可治愈佝偻病,随后断定这种病就是随后断定这种病就是缺乏维缺乏维D引起得。引起得。1922年年-维维E被发现被发现1933年年-维维E首次用于治疗首次用于治疗必需维生素必需维生素13种种维生素维生素维生素维生素A A，维生素，维生素，维生素，维生素B B，维生素，维生素，维生素，维生素C C，维生素，维生素，维生素，维生素D D，维生素，维生素，维生素，维生素E E，维生素，维生素，维生素，维生素K K，维生素，维生素，维生素，维生素H H（生物素）（生物素）（生物素）（生物素），维生素，维生素，维生素，维生素P P，维生素，维生素，维生素，维生素PPPP，维生素，维生素，维生素，维生素MM，维生，维生，维生，维生素素素素T T，维生素，维生素，维生素，维生素U U，水溶性维生素。，水溶性维生素。，水溶性维生素。，水溶性维生素。分类分类维生素维生素维生素维生素水溶性水溶性VitB族族(B1、B2、B6、B12)VitC、叶酸、叶酸（VitM）、烟酸、）、烟酸、烟酰胺（烟酰胺（VitPP）脂溶性脂溶性VitA、D2、D3、E、K1 等等 AB1CDEVitaminsVitaminsContents全反式全反式全反式全反式R-H 维生素维生素A醇醇-COCH3 维生素维生素A醋醋酸酯酸酯-COC15H31 维生素维生素A棕棕榈酸酯榈酸酯结构结构共轭多烯醇侧链得环己烯共轭多烯醇侧链得环己烯黄色棱形黄色棱形,62-64淡黄色棱形淡黄色棱形,57-58无定型无定型,28-29去氢维生素去氢维生素VitA2去水维生素去水维生素VitA3易发生脱氢、脱水、聚合反应易发生脱氢、脱水、聚合反应 溶解性溶解性:与三氯甲烷、乙醚、环已烷或石油醚能任意混合与三氯甲烷、乙醚、环已烷或石油醚能任意混合,在乙醇中微溶在乙醇中微溶,在水中在水中不溶。不溶。不稳定性不稳定性:含有多个不饱与键含有多个不饱与键,性质不稳定性质不稳定,易被空气中氧或氧化剂氧化易被空气中氧或氧化剂氧化,易被紫外易被紫外光裂解光裂解,特别就是在加热与金属离子存在时更易氧化变质从而失活。特别就是在加热与金属离子存在时更易氧化变质从而失活。性质性质 或有金属离子存在或有金属离子存在或有金属离子存在或有金属离子存在时氧化时氧化时氧化时氧化 临床使用时成酯后临床使用时成酯后临床使用时成酯后临床使用时成酯后,溶于植物油中溶于植物油中溶于植物油中溶于植物油中;阴凉阴凉阴凉阴凉干燥处保存干燥处保存干燥处保存干燥处保存,还需加还需加还需加还需加入入入入N N2 2或一定抗氧剂提或一定抗氧剂提或一定抗氧剂提或一定抗氧剂提高稳定性。高稳定性。高稳定性。高稳定性。大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静继续保持安静紫外吸收紫外吸收:共轭多烯醇侧链结构共轭多烯醇侧链结构,在在325-328nm325-328nm之间有最大吸收之间有最大吸收,可用于鉴别。可用于鉴别。maxmax 相对生物效价相对生物效价顺反异构顺反异构维生素生素A325、5100%全反式全反式新新维生素生素Aa32875%2顺新新维生素生素Ab 320、524%4顺新新维生素生素Ac 310、515%2,4顺异异维生素生素Aa32321%6顺异异维生素生素Ab32424%2,6顺v天然维生素天然维生素A主要就是反式主要就是反式CHCl3可用于鉴别与含量测定可用于鉴别与含量测定 与三氯化锑呈色与三氯化锑呈色:三氯甲烷三氯甲烷+三氯化锑三氯化锑=不稳定得蓝色不稳定得蓝色与三氯化锑呈色反应与三氯化锑呈色反应三氯三氯三氯三氯甲烷甲烷甲烷甲烷三氯三氯三氯三氯化锑化锑化锑化锑不稳定不稳定不稳定不稳定得蓝色得蓝色得蓝色得蓝色鉴别实验鉴别实验Vit ASbCl3CHCl3(无水无醇)蓝色紫红色（一）（一）Carr-Price反应反应蓝色蓝色紫红紫红条件条件:无水、无醇无水、无醇SbCl3水水SbOCl乙醇可使碳正离子得正电荷消失乙醇可使碳正离子得正电荷消失要求仪器与试剂必须干燥无水要求仪器与试剂必须干燥无水,三氯甲烷必须无醇三氯甲烷必须无醇max为为326nm一个吸收峰一个吸收峰max为为350390nm三个吸收峰三个吸收峰五个共轭双键五个共轭双键六个共轭双键六个共轭双键最大吸收峰红移最大吸收峰红移（二）（二）UV法法USP 显色剂显色剂 磷钼酸磷钼酸 规定斑点颜色和规定斑点颜色和Rf值值BP 对照品法对照品法 显色剂显色剂 三氯化锑三氯化锑（三）（三）TLC法法展开剂展开剂:环己烷环己烷-乙醚乙醚(80:20)均显蓝色斑点均显蓝色斑点,维生素醇维生素醇(Rf=0、1)维生素醋酸酯维生素醋酸酯(Rf=0、45)维生素棕榈酸酯维生素棕榈酸酯(Rf=0、7)酸值 取乙醇与乙醚各15ml,置锥形瓶中,加酚酞指示剂5滴,滴加氢氧化钠滴定液(0、1mol/L)至显粉红色,再加本品2、0g,振摇使溶解,用氢氧化钠滴定液(0、1mol/L)滴定,酸值应不大于2、0(附录VIIH)杂质检查杂质检查过氧化值取本品1、0g,加冰醋酸-三氯甲烷(6:4)30ml,振摇使溶解,加碘化钾得饱与溶液1ml,振摇1分钟,加水100ml与淀粉指示液1ml,用硫代硫酸钠滴定液(0、01mol/L)滴定至紫蓝色消失,并将滴定得结果用空白试验校正。消耗硫代硫酸钠滴定液(0、01mol/L)不得过1、5ml。杂质检查杂质检查维生素维生素A得测定得测定CHP收载三种收载三种UVHPLC三氯化锑法三氯化锑法含量测定含量测定立体异构立体异构体体氧化产物氧化产物及光照产及光照产物物合成中间合成中间体体去氢维生去氢维生素素A(VitA2)去水维生去水维生素素A(VitA3)（一）（一）UV法（三点校正法）法（三点校正法）维生素生素A在在325328nm得波得波长范范围内有最大吸收内有最大吸收,可用紫外法可用紫外法进行含量行含量测定但定但维生素生素A原料常混有原料常混有杂质如如:杂质得吸收杂质得吸收 对维生素对维生素A有影响的杂质主要有以下几种：有影响的杂质主要有以下几种：(1)VA2(345350nm)和和VA3(2)维生素维生素A的氧化产物的氧化产物(3)维生素维生素A在光照下产生的无活性的聚合物在光照下产生的无活性的聚合物(4)维生素维生素A的异构体等。的异构体等。以上这些杂质在以上这些杂质在310nm-340nm的波长范围内有吸收，的波长范围内有吸收，干扰维生素干扰维生素A的测定。的测定。维生素生素A得氧化得氧化产物物维生素生素A在光照下在光照下产生得无活性得聚合物生得无活性得聚合物1、三点校正法三点校正法 即在三个波长处测得吸光度，在规定条件下以校正公即在三个波长处测得吸光度，在规定条件下以校正公即在三个波长处测得吸光度，在规定条件下以校正公即在三个波长处测得吸光度，在规定条件下以校正公式进行校正，式进行校正，式进行校正，式进行校正，再再再再进行计算，消除干扰，求得维生素进行计算，消除干扰，求得维生素进行计算，消除干扰，求得维生素进行计算，消除干扰，求得维生素A A的真的真的真的真实实实实含量。含量。含量。含量。2、测定原理测定原理 杂质的吸收在杂质的吸收在杂质的吸收在杂质的吸收在310340nm310340nm波长范围内呈一条直线，且波长范围内呈一条直线，且波长范围内呈一条直线，且波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小；随波长的增大吸收度减小；随波长的增大吸收度减小；随波长的增大吸收度减小；物质对光的吸收具有加和性。物质对光的吸收具有加和性。物质对光的吸收具有加和性。物质对光的吸收具有加和性。3、波长得选择波长得选择 1 VitA的的 max（如（如VitA酯酯 328nm）2 3 分别在分别在 1的两侧各选一点的两侧各选一点测定对象测定对象:VitA醋酸酯时醋酸酯时,ChP2015规定规定第一法第一法 等波长差法等波长差法第二法第二法 等吸收比法等吸收比法测定对象测定对象:VitA醇时醇时,ChP2015规定规定合成得或天然得合成得或天然得合成得或天然得合成得或天然得维维生素生素生素生素A A 均均均均为酯为酯式式式式维维生素生素生素生素A A,根据供根据供根据供根据供试试品中干品中干品中干品中干扰杂质扰杂质得多少得多少得多少得多少,可采用可采用可采用可采用:(1 1)直接直接直接直接测测定法定法定法定法 (2 2)皂化法皂化法皂化法皂化法 求求求效价求效价(1)基本步骤基本步骤4.测定方法测定方法A选择，选择，A328测定或测定或A328校正校正求标示百分含量求标示百分含量(1)第一法第一法(直接直接测定法定法,适用于适用于纯度高得度高得维生素生素A醋酸醋酸酯得得测定定)1)方法方法 取取样品适量品适量,精密称定精密称定,加加环己己烷溶解溶解在在300、316、328、340、360nm测吸收度吸收度,以确定最以确定最大吸收波大吸收波长(A328或或A328校正校正)。b、判断法判断法 最大吸收波最大吸收波长在在326-329nm之之间,且且5个波个波长下得下得绝对值差差值均不超均不超过0、02时,可直接用可直接用328nm波波长处得得测得得吸收得得吸收度度值求得吸收系数。求得吸收系数。a、计算吸收度比算吸收度比值(Ai/A328):与中国与中国药典得吸收度比典得吸收度比值相比相比较,判断每个差判断每个差值得得绝对值就是否超就是否超过0、02。最大吸收波最大吸收波长在在326-329nm之之间,计算算5个波个波长下得下得绝对差差值,如果有一个或几个超如果有一个或几个超过0、02,应按以按以下得方法下得方法进行判断行判断:A328校正校正=3、52(2 A328 A316-A340)(1)第一法第一法(直接直接测定法定法,适用于适用于纯度高得度高得维生素生素A醋酸醋酸酯得得测定定)1)方法方法 取取样品适量品适量,精密称定精密称定,加加环己己烷溶解溶解在在300、316、328、340、360nm测吸收度吸收度,确定确定A2)计算算 a、吸光系数吸光系数E1%1cm b、求效价求效价(IU/g):效价指每效价指每g供供试品所含品所含维生素得生素得A得国得国际单位数。位数。1IU=0、344g全反式维生素全反式维生素A醋酸酯醋酸酯 IU/g=每克纯品相当多少个单位每克纯品相当多少个单位(IU)?1IU=0、344g全反式维生素全反式维生素A醋酸酯醋酸酯c、求求维生素生素A占占标示量得百分含量示量得百分含量AA328或或A328校正校正D供供试品得稀品得稀释倍数倍数换算因子算因子维生素生素A醋酸醋酸酯在在环己己烷中中1900;维生素生素A醇在异丙醇中醇在异丙醇中1830W为平均内容物重量平均内容物重量;W为称取内容物重量称取内容物重量(供供试品取用量品取用量)L 比色池厚度比色池厚度标示量示量为处方中方中规定得每粒中所含得国定得每粒中所含得国际单位数位数 VitAD胶丸中胶丸中VitA得含量测定得含量测定 精密称取本品精密称取本品(规格格10000VitAIU/丸丸)装量差异装量差异项下下(平均装量平均装量0、08262g/丸丸)得内容物得内容物 0、2399g 至至250ml量瓶中量瓶中,用用环己己烷稀稀释至刻度至刻度,摇匀匀;精密量取精密量取2、0ml,置另一置另一20 ml量瓶中量瓶中,用用环己己烷稀稀释至刻度至刻度,摇匀。匀。以以环己己烷为空白空白,测定最大吸收波定最大吸收波长为328nm,并在并在下列波下列波长处测得吸收度得吸收度为A300 :0、354A316 :0、561A328 :0、628A340 :0、523A360 :0、216A300/A328 :0、555A316/A328 :0、907A328/A328 :1、000A340/A328 :0、811A360/A328 :0、299 求本品中维生素求本品中维生素A得含量得含量？A300/A328 :0、564A316/A328 :0、893A328/A328 :1、000A340/A328 :0、833A360/A328 :0、344 0、555 0、907 1、000 0、811 0、299 +0、010、01 0+0、02+0、04=适用于维生素适用于维生素A醇醇(等吸收比法)第一法无法消除杂质干扰时用此法第一法无法消除杂质干扰时用此法 皂化法、皂化法、6/7A法法(2)第二法第二法水溶性水溶性脂溶性脂溶性 判断判断 max就是否在就是否在323327nm之之间间取未皂化样品采用取未皂化样品采用色谱法纯化后再测色谱法纯化后再测定定 计算计算就就是是否否 判断判断 A300/A325 就是否大于就是否大于0、73就就是是否否取未皂化样品采用色谱取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定法纯化后再测定 计算计算A325(校正校正)03%3%f高效液相色谱法高效液相色谱法流动相流动相:正己烷异丙醇正己烷异丙醇(9973)检测波长检测波长:325nm系统适用性实验考察分离度系统适用性实验考察分离度就是否能将维生素就是否能将维生素A醋酸酯顺式与反式分醋酸酯顺式与反式分开开三氯化锑比色法三氯化锑比色法max 618nm620nm标准曲线法标准曲线法缺点：缺点：呈色不稳定呈色不稳定（5 10s内）内）水分干扰水分干扰与标准曲线温差与标准曲线温差1专属性差专属性差三氯化锑有腐蚀性三氯化锑有腐蚀性优点优点:简便简便 快速快速小结小结维生素生素A共共轭多多烯醇醇侧链得得环乙乙烯性性质:脂溶性脂溶性;不不稳定定,可与三可与三氯化化锑呈色呈色鉴别:三三氯化化锑反反应;UV;TLC含量含量测定定:紫外紫外-分光光度法分光光度法(三点校正三点校正)三三氯化化锑比色法比色法AB1CDEVitaminsVitaminsContents 维生素维生素B1广泛分布于米糠、麦麸与酵广泛分布于米糠、麦麸与酵母中母中,具有维持糖代谢及神经传导与消化具有维持糖代谢及神经传导与消化得正常功能。主要用于治疗维生素得正常功能。主要用于治疗维生素B1缺缺乏症、多发性神经炎及胃肠疾病。乏症、多发性神经炎及胃肠疾病。氯化化4-甲基甲基-3(2-甲基甲基-4-氨基氨基-5-嘧啶基基)甲基甲基-5-(2-羟基乙基基乙基)噻唑鎓盐酸酸盐结构与性质结构与性质维生素维生素B1(盐酸硫胺盐酸硫胺)第二节第二节 维生素维生素B1得分析得分析结构与性质结构与性质维生素生素B1为白色白色结晶或晶或结晶性粉末晶性粉末易溶于水易溶于水,微溶于乙醇微溶于乙醇,不溶于乙不溶于乙醚水溶液呈酸性水溶液呈酸性1、溶解性溶解性性质性质噻唑环、嘧啶环共轭双键噻唑环、嘧啶环共轭双键12、5g/ml盐酸溶液盐酸溶液(9 1000)max=246nm2、硫色素荧光反应硫色素荧光反应3、UV杂原子得反应杂原子得反应,能与某些生物碱沉淀试剂反应能与某些生物碱沉淀试剂反应,生成组成恒定得沉淀生成组成恒定得沉淀,可用于鉴别与含量测定。可用于鉴别与含量测定。4、与生物碱沉淀试剂反应与生物碱沉淀试剂反应5、氯化物得特性氯化物得特性与与NaOH共热共热,形成硫化钠形成硫化钠,硝酸铅生成黑色硝酸铅生成黑色沉淀沉淀;6、硫元素反应硫元素反应7、红外光谱特征红外光谱特征二、鉴别试验(一)硫色素荧光反应为维生素B1所特有NaOHH2O环合O2H硫色素Thiochtome溶于丁醇,显蓝色荧光维生素维生素B1VitB1H+H+H+沉淀反应沉淀反应H+硫元素反应与氯化物反应硫元素反应与氯化物反应H+pany Logo三、含量测定三、含量测定非水溶液滴定法Non-aqueous Titrimetry紫外分光光度法UV硫色素荧光法Thiochrone Fluoremetry高氯酸滴定液高氯酸滴定液(0、1mol/L)得滴定度得滴定度(T)为为16、86mg/ml。喹那啶红亚甲蓝喹那啶红亚甲蓝(紫红紫红天蓝天蓝)非水溶液滴定法非水溶液滴定法非水溶液滴定法非水溶液滴定法紫外分光光度法紫外分光光度法维生素生素B1分子中具有共分子中具有共轭双双键,在紫外区有吸收在紫外区有吸收10.1M HCl2H203H3PO4 buffer4alcohol246232255注意注意维生素维生素1得紫外吸收峰随溶液得得紫外吸收峰随溶液得pH变化而不同变化而不同:pH2.0时，最大吸收波长在时，最大吸收波长在246nm处；处；pH7.0时，时，2个吸收峰：个吸收峰：232233和和266；可采用差示分光光度法可采用差示分光光度法,消除背景与消除背景与辅料得干扰辅料得干扰,测定其含量测定其含量;维生素生素B1片得片得测定定片剂、注射剂片剂、注射剂=421(每片每片)相当于标示量得相当于标示量得%=A=ECLChP11 标示量标示量%WEA%cm 100D 100平均片重平均片重(每每ml)相当于标示量得相当于标示量得 标示量标示量%VEA%cm 100D 100NaOH硫色素荧光法硫色素荧光法:维生素维生素B1得专属性反应得专属性反应原理原理1、2、方法VitB1铁氰化钾NaOH硫色素异丁醇荧光ex-365nmem-435nm+NaOH+铁氰化钾+异丁醇+NaOH+异丁醇对照液+NaOH+铁氰化钾+异丁醇+NaOH+异丁醇供试液SdAb特点特点3、(1)灵敏度高，线性范围宽。灵敏度高，线性范围宽。(2)专属性强，氧化产物及代谢产物不干扰，可用于制剂专属性强，氧化产物及代谢产物不干扰，可用于制剂分析，体液分析等，分析，体液分析等，但操作比较复杂，受干扰因素多但操作比较复杂，受干扰因素多。(3)本法中使用的氧化剂，除铁氰化钾，尚可用氯化汞或本法中使用的氧化剂，除铁氰化钾，尚可用氯化汞或溴化氰溴化氰小结小结维维生素生素生素生素B B1 1(盐盐酸硫胺酸硫胺酸硫胺酸硫胺)氨基氨基氨基氨基嘧啶环嘧啶环与与与与噻唑环噻唑环通通通通过亚过亚甲甲甲甲基基基基连连接而成季接而成季接而成季接而成季铵盐铵盐。性性性性质质:水溶性水溶性水溶性水溶性;硫色素反硫色素反硫色素反硫色素反应应;可与生物碱沉淀可与生物碱沉淀可与生物碱沉淀可与生物碱沉淀剂剂反反反反应应鉴别鉴别:硫色素反硫色素反硫色素反硫色素反应应;沉淀反沉淀反沉淀反沉淀反应应;ClCl、S S反反反反应应含量含量含量含量测测定定定定:非水滴定非水滴定非水滴定非水滴定;紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法;硫色素硫色素硫色素硫色素荧荧光法光法光法光法AB1CDEVitaminsVitaminsContents维生素生素C就是胶原蛋白形成所必需得就是胶原蛋白形成所必需得,有助于保持有助于保持间质得完整得完整,维生素生素C 缺乏可缺乏可导致致齿龈肿胀,出血出血,皮下瘀点皮下瘀点,关关节及肌肉疼及肌肉疼痛痛,毛囊角化毛囊角化,严重缺乏可引起坏血病。所以重缺乏可引起坏血病。所以维生素生素C又称又称为抗坏血酸。抗坏血酸。L-抗坏血酸(有生物活性)L-二酮古罗糖酸L-去氢抗坏血酸无生物活性结构与性质结构与性质C3OH得得pKa=4、17C2OH得得pKa=11、572、酸性酸性一元酸一元酸1、溶解性溶解性易溶于水易溶于水,水中呈酸性水中呈酸性;略溶于乙醇略溶于乙醇,不溶于不溶于三氯甲烷或乙醚三氯甲烷或乙醚L(+)抗坏血酸抗坏血酸活性最强活性最强比旋度比旋度+20、5+21、5手性手性C(C4、C5)3、旋光性旋光性*含有四个光学异构体含有四个光学异构体有活性有活性有活性有活性无活性无活性4、还原性还原性二烯醇结构二烯醇结构与碱反应与碱反应5、水解反应水解反应弱碱中生成单钠盐弱碱中生成单钠盐,强碱中水解强碱中水解糖类得显色反应糖类得显色反应50结构与糖类相似结构与糖类相似6、具糖得性质具糖得性质五碳糖五碳糖维生素维生素C7、UV特征特征维生素生素C具有共具有共轭双双键利用还原性利用还原性:与氧化剂得反应与氧化剂得反应鉴别试验鉴别试验(一一)与与AgNO3反应反应去氢抗坏血酸去氢抗坏血酸黑色黑色(二二)与与2,6-二氯靛酚反应二氯靛酚反应氧化型氧化型玫瑰红色玫瑰红色(酸性酸性)还原型还原型蓝色蓝色(碱性碱性)无色无色与碱性酒石酸铜反应与碱性酒石酸铜反应与与KMnO4反应反应(三三)与其她氧化剂反应与其她氧化剂反应砖红色沉淀砖红色沉淀试剂褪色试剂褪色磷钼酸磷钼酸 钼蓝钼蓝与磷钼酸反应与磷钼酸反应(四四)薄层色谱法薄层色谱法(五五)糖类反应糖类反应H2O-CO2戊糖-3H2O糠醛50蓝色维生素生素C可在三可在三氯醋酸或醋酸或盐酸存在下水解、脱酸存在下水解、脱羧、生成戊糖、生成戊糖,再失水再失水,转化化为糠糠醛,加入吡咯加入吡咯,加加热至至50 产生生蓝色色0、01mol/L HCl(五五)紫外光谱法紫外光谱法BP2010杂质检查杂质检查(一一)溶液得澄清度与颜色检查溶液得澄清度与颜色检查内酯环水解内酯环水解糠醛缩合呈色糠醛缩合呈色高于或低于高于或低于pH、0-6、0空气、光线、温度空气、光线、温度维生素维生素C C脱羧脱羧控制有色杂质控制有色杂质维生素维生素C(二二)铁、铜离子铁、铜离子(三三)草酸得检查草酸得检查p草酸与金属离子作用形成沉淀草酸与金属离子作用形成沉淀;所以所以对Vc得原得原料料,尤其就是注射液尤其就是注射液,要要进行草酸行草酸检查;p加入加入CaCl2,比比浊法法;原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法(二二)铁、铜离子铁、铜离子原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法四、含量测定四、含量测定维生素生素C维生素生素C制制剂碘量法碘量法二氯靛酚法二氯靛酚法紫外分光光度法紫外分光光度法高效液相色谱法高效液相色谱法指示剂指示剂 淀粉指示液淀粉指示液(一一)碘量法碘量法原理原理:利用利用Vc强得还原性强得还原性HAc 取本品约取本品约0、2g,精密称定精密称定,加新沸过得冷加新沸过得冷水水100ml与稀醋酸与稀醋酸10ml使溶解使溶解,加淀粉指示液加淀粉指示液1ml,立即用碘滴定液立即用碘滴定液(0、05mol/L)滴定滴定,至溶液至溶液显蓝色显蓝色,在在30秒内不褪。每秒内不褪。每1ml碘滴定液碘滴定液(0、05mol/L)相当于相当于8、806mg得得C6H8O6。2、方法、方法原料药原料药(2)酸性环境酸性环境 稀醋酸稀醋酸 (1)新沸冷新沸冷H2O减慢减慢VitC被被O2氧化速度氧化速度(3)立即滴定立即滴定 赶走水中赶走水中O2,减少减少O2得干扰得干扰3、注意事项、注意事项(4)附加剂干扰得排除附加剂干扰得排除片剂片剂 过滤过滤注射剂注射剂 抗氧剂抗氧剂 丙酮丙酮甲醛甲醛Na2SO3 NaHSO3 Na2S2O3 Na2S2O5(二二)2,6-二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法快速滴定快速滴定,专属性强专属性强,用于含用于含Vit CVit C得制剂与食品分析得制剂与食品分析自身指示终点自身指示终点1、原理原理2、方法方法(2)快速滴定快速滴定 2min内内 (1)酸性环境酸性环境 HPO3-HAc 稳定稳定VitC防止其她还原性物质干扰防止其她还原性物质干扰(3)亦可剩余比色测定亦可剩余比色测定 (定量过量定量过量)(测剩余染料测剩余染料)3、注意事项注意事项(4)二氯靛酚不稳定二氯靛酚不稳定,须临用前配制并标定须临用前配制并标定专属性强专属性强,多用于含多用于含 Vc得制剂与食品得分析得制剂与食品得分析配制方法配制方法:NaHCO3 42mg+水水50 ml,加二加二氯靛酚靛酚钠二水合物二水合物0、5g+水水200 ml,过滤,即得。即得。标定方法定方法:用干燥得用干燥得维生素生素C对照品照品进行行标定定(三三)高效液相色谱法高效液相色谱法人血浆中人血浆中VitC浓度得浓度得HPLC法测定法测定1、色谱条件、色谱条件2、标准溶液得制备、标准溶液得制备3、血浆样品得处理、血浆样品得处理:酸性溶液沉淀蛋白法酸性溶液沉淀蛋白法4、方法学考察、方法学考察5、测定、测定标准溶液制备标准溶液制备:取取V C对照品约对照品约25mg，精密称定，置，精密称定，置25ml量瓶中，加量瓶中，加10%偏磷酸稀释至刻度，得维生素偏磷酸稀释至刻度，得维生素C储备液浓度为储备液浓度为1mg/ml，置冰箱中，置冰箱中2保存，保存，3日内可用。日内可用。血浆样品预处理血浆样品预处理:取受试者静脉血，立即置肝素化的离心试管中，取受试者静脉血，立即置肝素化的离心试管中，3000rpm离心离心5min；取血浆；取血浆0.5ml，加入，加入0.5ml 10%偏偏磷酸溶液，涡旋混合磷酸溶液，涡旋混合0.5min，离心，分取上清液，置，离心，分取上清液，置冰箱冰箱2贮存，直至测定。贮存，直至测定。稳定性考察稳定性考察:VC在血浆中不稳定，在在血浆中不稳定，在5%偏磷酸溶液中也难偏磷酸溶液中也难以保持长期稳定，应尽可能缩短药物分离和处以保持长期稳定，应尽可能缩短药物分离和处理时间。理时间。样品测定样品测定:每天抽取的血样应当日测定，每天建立一条标每天抽取的血样应当日测定，每天建立一条标准曲线，并随行测定高、中、低浓度的双样本准曲线，并随行测定高、中、低浓度的双样本质控样品。质控样品。小结小结维生素生素C(L抗坏血酸抗坏血酸)烯二醇二醇结构构性性质:水溶性水溶性;酸性酸性;旋光性旋光性;还原性原性;水解性水解性 糖糖类性性质;紫外吸收特性紫外吸收特性鉴别:硝酸硝酸银反反应;二二氯靛酚靛酚钠反反应;氧化反氧化反应;TLC;糖糖类反反应;紫外紫外杂质检查:澄清度与澄清度与颜色色检查 铁、铜离子离子检查 草酸草酸检查含量含量测定定:碘量法碘量法;二二氯靛酚滴定法靛酚滴定法;高效液相色高效液相色谱 AB1CDEVitaminsVitaminsContentsvSunlightvFoodsvFortified MilkvFish Oilsv佝偻病佝偻病v牙齿松动v鸡胸v骨质疏松v脚成弓形v促进钙、磷得吸收;v促进骨骼与牙齿得正常生长;v调节柠檬酸得代谢第四节第四节 维生素维生素D D得分析得分析胆甾醇7-脱氢胆甾醇维生素 D3(胆骨化醇)维生素 D2(麦角骨化醇)麦角甾醇 维生素生素D就是一就是一类抗佝抗佝偻病病维生素得生素得总称称,目前有目前有10多种多种,都就是甾醇衍生物。都就是甾醇衍生物。维生素维生素D2 维生素维生素D3维生素维生素D2、D3无色针状结晶或白色结晶性粉末无色针状结晶或白色结晶性粉末;无臭无臭,无味无味;遇光或空气均易变质。遇光或空气均易变质。溶解性溶解性:维生素维生素D2在三氯甲烷中极易溶解在三氯甲烷中极易溶解,在丙酮乙醇乙醚在丙酮乙醇乙醚中易溶中易溶;维生素维生素D3在乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚极易溶解在乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚极易溶解;二者均在植物油中略溶二者均在植物油中略溶,在水中不溶。在水中不溶。不稳定性不稳定性:毒性增强毒性增强、含有多个烯键含有多个烯键,所以极不稳定所以极不稳定,宜氧化宜氧化变质变质,效价降低效价降低,毒性增强。毒性增强。旋光性旋光性:有五到六个手性碳原子有五到六个手性碳原子,均具有旋光性均具有旋光性、维生素维生素D2 6个手性碳原子个手性碳原子 维生素维生素D3 5个手性碳原子个手性碳原子 显色反应显色反应 甾类化合物甾类化合物氯仿溶液氯仿溶液 黄色黄色 红色红色 紫色紫色 绿色绿色紫外吸收特性紫外吸收特性 无水乙醇无水乙醇 265nm 265nm 维生素维生素D D2 2 为为460460490490 维生素维生素D D3 3 为为465465495495醋酐醋酐硫酸硫酸E1cm1%E1%1cm二、鉴别试验二、鉴别试验(一一)显色反应显色反应1 1、与醋酐、与醋酐-浓硫酸反应浓硫酸反应 氯仿溶液氯仿溶液 黄色黄色 红色红色 紫色紫色 绿色绿色醋酐醋酐硫酸硫酸2 2、与三氯化锑反应、与三氯化锑反应 本品本品1,2-1,2-二氯乙烷二氯乙烷 三氯化锑试液三氯化锑试液 橙红色橙红色 粉红色粉红色 3 3、其它显色反应、其它显色反应 维生素维生素D D 三氯化铁三氯化铁 橙黄色橙黄色 二氯丙醇二氯丙醇 乙酰氯乙酰氯 绿色绿色 (二二)比旋度鉴别比旋度鉴别无水乙醇溶液无水乙醇溶液 维生素维生素D D2 2 比旋度为比旋度为102102、55至至107107、5 5 维生素维生素D D3 3 比旋度为比旋度为105105至至112 112(三三)其它鉴别方法其它鉴别方法 薄层色谱法、薄层色谱法、HPLCHPLC法法制备衍生物测熔点制备衍生物测熔点 紫外、红外吸收光谱紫外、红外吸收光谱(四四)维生素维生素D D2 2、D D3 3得区别反应得区别反应维生素维生素D D2 2 维生素维生素D D3 3 96%96%乙醇乙醇 10ml 取取0 0、1ml1ml 乙醇乙醇1ml1ml与与85%85%硫酸硫酸5ml5ml 红色红色max570nm 黄色黄色 max495nm 三、杂质检查三、杂质检查(一一)麦角甾醇得检查麦角甾醇得检查维生素维生素D D2 290%乙醇溶液乙醇溶液 洋地黄皂苷溶液洋地黄皂苷溶液 不得发生浑浊或沉淀不得发生浑浊或沉淀 (二二)前维生素前维生素D D得光照产物得光照产物(三三)有关物质检查有关物质检查Ch、P 2010NP-HPLC四、含量测定四、含量测定正相高效液相色谱法正相高效液相色谱法 (一一)维生素维生素D D测定法测定法 含量以单位表示含量以单位表示每单位相当于维生素每单位相当于维生素D 0D 0、025025g g 注意注意:计算得就是维生素计算得就是维生素D D及前维生素及前维生素D D经经折折 算成维生素算成维生素D D得总量得总量u 固定相:硅胶u 流动相:正己烷正戊醇(997:3)u 检测波长:254nm第一法:用于无维生素A醇及其她干扰得供试品第二法:(1)皂化提取;(2)净化用色谱柱系统分离收集维生素D,得供试品溶液B;(3)按第一法进行测定。第三法:当样品经皂化提取及净化用色谱系统分离收集后,前维生素D峰仍受干扰时,采用此法。小结小结维生素维生素D抗佝偻病维生素得总称抗佝偻病维生素得总称性质性质:脂溶性脂溶性;不稳定不稳定;旋光性旋光性;显色反应显色反应;紫外紫外鉴别鉴别:显色反应显色反应;比旋度比旋度;VD2、VD3区别区别杂质检查杂质检查:麦角甾醇麦角甾醇;前维生素前维生素D光照产物光照产物;有关物质有关物质含量测定含量测定:三法三法AB1CDEVitaminsVitaminsContents第五节第五节 维生素维生素E得分析得分析维生素维生素E E早在早在2020世纪世纪2020年代就被人们年代就被人们发现发现,EvansEvans与她得同事在研究生殖过与她得同事在研究生殖过程中发现程中发现,酸败得猪油可以引起大鼠酸败得猪油可以引起大鼠得不孕症。得不孕症。就是与生育有关得维生素得总称就是与生育有关得维生素得总称1936 1936 年分离出结晶体年分离出结晶体1938 1938 年被瑞士化学家人工合成年被瑞士化学家人工合成维生素维生素E得显微照片得显微照片维维生生素素E胶胶囊囊维生素维生素E类结构与相对活性类结构与相对活性名称R1R2烃链相对活性-生育酚CH3CH3C16H331、0-生育酚CH3HC16H330、5-生育酚HCH3C16H330、2-生育酚HHC16H330、1-生育酚CH3HC16H270、5维生素维生素E得结构得结构2R*(4R*,8R*)-3,4-二氢-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基十三烷基)-2H-苯并吡喃苯并吡喃-6-醇醋酸酯-生育酚醋酸酯生物效价 右旋体 :消旋体 =1、4:10(天然品天然品)(合成品合成品)维生素维生素维生素维生素E E得性质得性质得性质得性质l性状性状:黄色或金黄色粘稠状透明液体黄色或金黄色粘稠状透明液体l脂溶性脂溶性:溶于溶于丙酮、乙醇、乙醚或植物油丙酮、乙醇、乙醚或植物油等有机溶剂中等有机溶剂中l水溶性水溶性:不溶于水不溶于水l稳定性稳定性:无氧时对热、酸稳定无氧时对热、酸稳定,对碱不稳定对碱不稳定,对氧敏感对氧敏感,遇光可被氧化遇光可被氧化,色渐变深色渐变深,lUV:乙醇溶液中乙醇溶液中max284nm(一一)硝酸反应硝酸反应二、鉴别试验二、鉴别试验生育酚HNO3（橙红色）生育红维生素维生素E在硝酸酸性条件下在硝酸酸性条件下,水解生成生育酚水解生成生育酚水解水解三氯化铁联吡啶反应三氯化铁联吡啶反应O(二二)生育酚生育酚对对-生育醌生育醌红色红色Fe3+Omax=284nmmin=254nm0、01%无水乙醇中无水乙醇中UV法法（三）（三）薄层板薄层板 硅胶硅胶G展开剂展开剂 环己烷环己烷-乙醚乙醚(4 :1)显色剂显色剂 硫酸硫酸(105 5)TLC法法（四）（四）VitE Rf =0、7-生育酚生育酚 Rf =0、5-生育醌生育醌 Rf =0、9维生素维生素维生素维生素E E合成过程合成过程合成过程合成过程2,3,5-三甲基对二苯酚植醇+-生育酚-生育酚醋酸酯 三、杂质检查三、杂质检查 三、杂质检查三、杂质检查(一一)酸度酸度游离醋酸游离醋酸(二)生育酚 硫酸铈滴定液硫酸铈滴定液(0、01mol/L)二苯胺二苯胺(亮黄亮黄灰紫灰紫)利用游离生育酚得还原性利用游离生育酚得还原性,将硫酸铈还原成硫酸亚铈将硫酸铈还原成硫酸亚铈 三、杂质检查三、杂质检查 1、原理原理2、试剂试剂问药典中规定得维生素问药典中规定得维生素E中所含得游离生育中所含得游离生育酚得限量就是多少？酚得限量就是多少？计算每ml硫酸铈滴定液(0、01mol/L)相当于0、002154g得游离生育酚2、15限量限量(三)有关物质得检查(四)残留溶剂:环己烷得检查四、含量测定四、含量测定GC法法(一一)GC特点特点1、选择性好选择性好灵敏度高灵敏度高速度快速度快分离效能好分离效能好挥发性低、不稳定、挥发性低、不稳定、极性强极性强衍生化。衍生化。易受样品蒸气压限易受样品蒸气压限制制载气载气N2固定液固定液硅酮硅酮(OV-17)担体担体硅藻土或高分子多孔小球硅藻土或高分子多孔小球柱温柱温265检测器检测器氢火焰离子化检测器氢火焰离子化检测器(FID)内标内标正三十二烷正三十二烷 n 500 R2内标法加校正因子定量内标法加校正因子定量2、VitE测定得色谱条件测定得色谱条件内标法内标法供试液供试液(样品样品+内标内标)内标物内标物对照液对照液(对照对照+内标内标)就是样品中不存在得物就是样品中不存在得物质质与被测组分峰靠近与被测组分峰靠近能与各组分完全分离能与各组分完全分离与被测组分得量接近与被测组分得量接近样品样品 dl生育酚生育酚固定相固定相十八烷基硅烷键合硅胶十八烷基硅烷键合硅胶流动相流动相甲醇甲醇-水水(49 :1)检测波长检测波