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载体,体外重组,重组子（杂合,DNA,）,转化,受体细胞,筛选阳性克隆,大量扩增，取得子代,DNA,基因克隆技术路线,第2页,第3页,重组基因表示目标,1.,蛋白质功效研究,2.,生物制药和疫苗生产,3.,疾病基因治疗,4.,食品、化工用酶制剂,5.,抗虫、抗逆植物改良,6.,细胞代谢产物富集,第4页,重组基因表示体系,1.,原核体系,2.,真核体系,大肠杆菌,枯草杆菌,乳酸菌,沙门氏杆菌,苏云金杆菌,酵母细胞,昆虫细胞,植物细胞、组织,动物细胞、组织,第5页,大肠杆菌表示体系,优越性,：,1.,对大肠杆菌背景知识，尤其是基因表示调控,分子机理有深刻了解；,2.,是一个安全基因工程试验体系，拥有各类适,用寄主菌株和不一样类型载体；,3.,许多克隆真核基因都能够在大肠杆菌细胞中,实现有效、高水平表示；,4.,大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易,用于批量生产。,大肠杆菌表示体系,第6页,大肠杆菌中表示体系,不足,：,1.,真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很,大差异。,2.,真核基因转录信号同原核不一样。细菌,RNA,聚合酶不能识别真核开启子；外源基因,可能含有具大肠杆菌转录终止信号功效核苷,酸序列。,3.,真核基因,mRNA,分子结构同细菌有所差异，,影响真核基因,mRNA,稳定性。,第7页,4.,许多真核基因蛋白质产物，都要经过,转译后加工修饰（正确折叠和组装），,而大多数这类修饰作用在细菌细胞中,并不存在；,5.,细菌蛋白酶，能够识别外来真核基,因所表示蛋白质分子，并把它们降解掉。,第8页,1.,经过表示载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌酶系统合成外源蛋白。,2.,外源基因不能带有间隔次序,(,内含子,),，因而必须用,cDNA,或全化学合成基因，而不能用基因组,DNA,。,3.,必须利用原核细胞强开启子和,SD,序列等调控元件控制外源基因表示。,4.,外源基因与表示载体连接后，必须形成正确开放阅读框架,(ORF),。,5.,利用宿主菌调控系统，调整外源基因表示，预防外源基因表示产物对宿主菌毒害。,重组基因在原核细胞中表示具备条件,第9页,开启子,核糖体结合位点,(SD,序列,),终止子,选择标识基因,复制子,原核生物基因表示载体组成特征,第10页,开启子,核糖体结合位点,转录终止子,大肠杆菌表示载体,第11页,汇报基因,（,reporter gene,）：特指那些编码产物能够被快速测定功效核苷酸编码单元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。,追踪某种特定,DNA,结构（重组质粒）是否已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也可用来同任何一个目标开启子连接，所以其表示活性可作为检测开启子功效依据。,第12页,Lac(,乳糖开启子,),Trp(,色氨酸开启子,),Tac(,乳糖和色氨酸杂合开启子,),P,L,(,噬菌体左向开启子,),T7,噬菌体开启子,惯用可调控开启子,经过与,阻遏蛋白,相互作用来控制基因开启和停顿,第13页,大肠杆菌,Lac,开启子,来自大肠杆菌乳糖操纵子,由阻遏蛋白基因,(LacI),、开启基因,(P),、操纵基因,(O),和编码,3,个与乳糖利用相关酶结构基因所组成,受活化蛋白和,cAMP,正调控，阻遏蛋白负调控,受,IPTG,（异丙基硫代半乳糖苷）、,TMG,（硫甲基半乳糖苷）、,ONPG,（邻硝基苯基半乳糖苷）诱导,LacUV5,开启子,：,Lac,开启子衍生物,第14页,大肠杆菌,trp,开启子,来自大肠杆菌色氨酸操纵子,由开启子、衰减子、操纵基因及,trpE,部分结构基因组成,受阻遏蛋白和衰减子调控，,阻遏蛋白前体必须与色氨酸结合才有活性,3-,吲哚丙烯酸（,IAA,）可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白结合，提升转录活性。,第15页,Tac,开启子,是一组由,Lac,和,trp,开启子人工构建杂合开启子，其开启能力比,Lac,和,trp,都强；,受,Lac,阻遏蛋白负调整，受,IPTG,（异丙基硫代半乳糖苷）诱导。,第16页,噬菌体左向开启子,P,L,来自,噬菌体早期左向转录开启子，活性比,Trp,开启子高约,11,倍；,受控于温度敏感阻遏蛋白,cI,。在低温,(28-30),时，,cIts857,阻遏蛋白可阻遏,P,L,开启子转录。在高温,(42),时，,cIts857,蛋白失活，阻遏解除，促使,P,L,开启子转录。,第17页,1.,非融合型表示载体,pKK223-3,载体,1,）强开启子,:tac,（,trp-lac,）,2,）操纵基因：乳糖操纵子系统,trp-35,区,lacUV5-10,区,lac,操纵基因,惯用大肠杆菌表示载体,3,）表示诱导物：,IPTG,（乳糖类似物，不会被降解）,第18页,条件：,必须选择一个有,lacI,宿主菌。,第19页,非融合蛋白：,指所表示外源蛋白,N,端或,C,端不含任何其它氨基酸。,所表示蛋白质以真核蛋白,mRNAAUG,为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。,第20页,非融合蛋白特点：,表示时要求高：,SD,序列与,ATG,距离要,适当,。即使改变,2-3,个碱基，表示效率也,会大受影响。,优点：能够很好地保持原来蛋白活性。,缺点：在宿主细胞内轻易被蛋白酶降,解，蛋白产量低；分离纯化费时费劲，,成本较高。,第21页,2.,分泌型表示载体,载体表示出外源蛋白质与细菌分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。,pIN III-comA1,pIN III-comA2,pIN III-comA3,1,）强开启子：,Ipp,（脂蛋白基因开启子）和,lacUV5,开启子。,2,）调整基因：,lac I,。,3,）,S-D,序列和起始密码,ATG,。,4,）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因,ompa,。,5,）插入位点区（多克隆位点）。,第22页,3.,融合蛋白表示载体系统,表示出外源基因产物蛋白是与质粒载体上菌体蛋白连接在一起。如：,pGEX,、,pET,系列,优点：便于融合蛋白分离和纯化。,组成结构：,1,）开启子：,tac,2,）操纵基因：,lacP,3,）调整基因：,lacI,4,）,S-D,序列,5,）,ori,：,pBR322,ori,6,）融合肽：,GST,(,谷胱甘肽巯基转移酶）,第23页,融合蛋白表示系统构建三个标准：,首先，受体细菌结构基因应能高效表示，且其,表示产物能够经过亲和层析进行特异性简单纯化。,其次，外源基因应插在受体菌结构基因下游,区域，并为融合蛋白提供终止密码子。另外，两个,结构基因拼接位点处序列设计十分主要，它直接,决定了融合蛋白裂解方法。,最终，当两个蛋白编码序列融合在一起时，外,第24页,生命科学学院,第25页,用融合载体组合表示融合蛋白质：,以,Ecoli,.lacZ为靶基因组合最经典，含三个不一样,载体，每个载体都有一个,lacZ开启子和SD序列，且在,lacZ基因下游部位含有一EcoR识别序列,(GAATTC),5上游存在着不一样数量G-C碱基对。三种情况必有一,个保持着正确读码结构，产生出真实融合蛋白质。,第26页,第27页,第二节,外源基因在原核细胞中表示,第28页,用凝血酶或,Xa,因子能够把外源蛋白从,GST,上切下来,第29页,pGEX-2X,插入区,pGEX-1X,插入区,pGEX-3X,插入区,第30页,4.,其它融合蛋白系统,His-tag,（组氨酸标签）,在外源多肽,N,端或,C,端接上,6,个组氨酸（,His,）。,His-tag,能与,Ni,2+,柱结合，但很轻易被,EDTA,（或咪唑溶液）洗脱下来，能够纯化蛋白质。,第31页,融合蛋白：,是指蛋白质,N,末端由原核,DNA,序列或其它,DNA,序列编码，,C,端由真核,DNA,完整序列编码。这么蛋白质有一段短原核多肽或含有其它功效多肽和真核蛋白质结合在一起，故称为融合蛋白。,第32页,外源基因在原核细胞中表示,位于,细胞质,细胞周质,细胞外,表示产物,形式,包涵体蛋白,融合蛋白,整合型外源蛋白,分泌型外源蛋白,第33页,目标蛋白在细胞质中表示主要优点是：,表示质粒构建比较简单；,能够到达很高目标蛋白表示量，普通能够到达占细,胞总蛋白,20%,40%,。,目标蛋白在大肠杆菌系统表示形式有二种：,在细胞内表现为不溶性包涵体颗粒,包涵体存在于大肠杆菌细胞质中,在细胞内表现为可溶性蛋白质,可溶性目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借,助于身功效序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最,终分泌到周质空间，或外泌到培养液中。,第34页,包涵体蛋白,本质：,细胞内蛋白质不停聚集,包含：,1.,折叠状态蛋白质聚集作用；,2.,非折叠状态蛋白质聚集作用；,3.,蛋白质中间体结构。,优点：,易于分离纯化,第35页,在一定程度上保持表示产物结构稳定,能够防止细胞内蛋白水解酶作用，有利于目标蛋白富集,简化外源基因表示产物分离操作,包涵体水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成份，,菌体经超声波裂解后，直接经过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来,能够表示对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应目标蛋白,包涵体表示形式优点,第36页,以包涵体形式表示重组蛋白丧失了原有生物活性，必须经过,有效变性复性操作，才能回收得到含有正确空间构象（因而含有生,物活性）目标蛋白，所以包涵体变复性操作效率对目标产物收,率至关主要。,经过复性处理目标蛋白不一定能完全恢复原来生物学活性，,有时甚至完全得不到有活性蛋白蛋，尤其当目标蛋白分子中,Cys,残基数目较高时，体外复性蛋白质成功率相当低，普通不超出,30%,复性处理工艺可使目标蛋白制备成本上升。,包涵体表示形式缺点,第37页,分离纯化细菌包涵体蛋白质,基本步骤,：,破碎细胞,(,Disruption of cell,),分离包涵体,(Seperation of inclusion body),溶解包涵体,(D,issolve,inclusion body,),蛋白质产物构象复原等。,(Recovery of target protein conformation),第38页,包涵体复性前准备,洗涤：,因为脂体及部分破碎细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通惯用低浓度变性剂如,2M,尿素在,50mM Tris pH7.0-8.5,左右、,1mMEDTA,中洗涤。另外能够用温和去垢剂,TritonX-100,洗涤去除膜碎片和膜蛋白。,第39页,包涵体溶解,1.,采取高浓度,变性剂,，使其形成伸展肽链。惯用变性剂有尿素（,8M,）、盐酸胍（,GuaHCl 6-8M,），经过离子间相互作用，破坏包涵体蛋白间氢键而增溶蛋白。尿素增溶效果稍差，异氰硫酸胍（,GuaSCN,）最强。,变性剂使用浓度和作用时间：普通在偏碱性环境中如,pH8.0-9.0,，尿素在碱性环境中不稳定。有些蛋白只能用盐酸胍。增溶时普通室温过夜，但盐酸胍在,37,度,1,小时便能够使多数蛋白完全变性溶解。,第40页,2.,去垢剂,：如强阴离子去垢剂,SDS,，能够破坏蛋白内疏水键，防止蛋白形成疏水关键，能够增溶几乎全部蛋白。但因为,SDS,无法彻底去除而不允许在制药过程中使用,（研究）。,3,.,极端,pH,：能够破坏蛋白次级键从而增溶蛋白。如在,pH9.0,溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白能够溶解在,60mMHCl,中。这些方法只适合于少部分蛋白增溶。,第41页,4.,还原剂：,因为蛋白间二硫键存在，在增溶时普通使用还原剂。还原剂使用浓度普通是,50-100mM DTT,，也有使用,5mM,浓度。实际，还原剂使用浓度与蛋白二硫键数目无关，而有些没有二硫键蛋白加不加还原剂无影响。对于目标蛋白没有二硫键一些包涵体增溶，有时还原剂使用也是必要，可能因为含二硫键杂蛋白影响了包涵体溶解。,含有半胱氨酸蛋白质，需要加入还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等。加入金属螯合剂,EDTA,去除金属离子。,第42页,(,伸展态,)U(,中间态,)I(,自然态,)N,A,（包涵体）,从中间体转变为天然态过程比较迟缓。当溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它辅助伎俩存在时，聚集趋势占主导地位，造成蛋白质自发复性效率极低。,蛋白质折叠三态模型,第43页,复性目标,第44页,复性：经过迟缓去除变性剂（防止折叠中间体重新聚集）使目标蛋白从变性完全伸展状态（？）恢复到正常折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。普通在尿素浓度,4M,左右时复性过程开始，到,2M,左右时结束。对于盐酸胍而言，能够从,4M,开始，到,1.5M,时复性过程已经结束。,第45页,蛋白质复性是重组蛋白纯化中最关键和最复杂问题。蛋白质性质不一样，所处环境不一样，使其复性条件大不相同。任何一个蛋白质都有一个最正确复性条件，只有选择到了适当复性缓冲液，使蛋白得以正确折叠，才能使深入层析分离得以顺利完成。,第46页,包含体蛋白复性方法,几个要求：,活性蛋白回收率高,正确复性产物易于与错误折叠蛋白质分离。,折叠复性后应得到浓度较高蛋白质产品,复性过程耗时少,第47页,复,性惯用方法,1.,稀释复性：,直接加入水或复性缓冲液，缺点是体积增加较大，后续处理困难。,稀释蛋白浓度：,浓度高则轻易形成聚集体（较低复性收率）。有时需低于,0.01mg/mL,。,脉冲流加复性：,分批次加入到缓冲液中，使折叠中间体保持在较低水平。例：在,5-10mg/mL,终浓度下，溶菌酶复性收率,可达,80%,以上,。,第48页,2.,透析复性：,好处是不增加体积，经过逐步降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不适合大规模操作，无法应用到生产规模。,3.,超滤复性：,选择适当载留分子量膜，允许变性剂经过膜而蛋白质通不过。在生产中较多使用，规模较大，缺点是不适合样品量较少情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆变性（蛋白聚集于膜上）。,第49页,4.,色谱复性：,辅助伎俩，兼具分离。,4.1,凝胶过滤复性：,除了蛋白质在胶粒中传质和扩散外，蛋白质与介质之间并没有发生其它作用。该法能够起到一定抑制凝集作用，而且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，对有些蛋白质复性有利。,第50页,第51页,4.2,吸附型层析复性：,离子交换、疏水层析、亲和层析和扩张床层析均属于吸附层析。其基本复性原理是层析柱平衡后，将变性蛋白上样并吸附在凝胶介质上，然后用清洗缓冲液洗掉未吸附变性剂和杂蛋白，最终用复性缓冲液将吸附蛋白洗脱下来，在洗脱过程中完成复性。,第52页,第53页,Solid-Phase(or Matrix-assisted)Refolding,IB in,E.coli,IB(solid,),Solubilized IB,(unfolded),Aggregate,Refolded,Bioactive,monomer,Refolding,Solution-state,F,Solid Support,Functional,Group,Solid-state,refolding,Remove Denaturant,F,第54页,第55页,第56页,5.,分子伴侣：,主要包含硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折叠酶等不但可在细胞内调整蛋白质折叠和聚集过程平衡，而且可在体外促进蛋白质折叠复性。,体内复性主要是在工程菌培养过程中同时加入分子伴侣基因进行共表示；体外复性主要是将基因工程菌中包涵体溶解，再加入分子伴侣帮助折叠。,第57页,复性过程中添加剂,低分子化合物本身并不能加速蛋白质折叠，但可能经过破坏错误折叠中间体稳定性或增加折叠中间体和未折叠分子可溶性来提升复性产率。可预防不可逆聚集体出现。,盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等,，,在非变性浓度下是有效促进剂。,第58页,In-Vitro Refolding Pathway,S,S,S,S,Unfolded,Aggregate,Intermediate,(molten globular),3D Structure,(Bioactive),S,S,S,S,Correctly,Folded,Intramolecular,Misfolding,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,Intermolecular,Misfolding,第59页,Standard IB Renaturation Process,Cell Disruption,Refolding,Post-refolding,purification step,IB Isolation,IB Washing,Solubilization,Centrifugation,Remove,Cell Debris,Denaturant,Partial Removal,of Denaturant,Complete Removal,of Denaturant,IB,Dissolved,Refolding,第60页,包涵体分离纯化,过程,细胞培养,收获细胞,细胞破碎,离心,5-10 000g,沉淀物,冲洗和离心,分离包涵体,亲和纯化和复性,溶解,第61页,61,包涵体-细胞破碎,冲洗和分离,每,100,ml,培养液重新悬浮细胞沉淀物於,4,ml 20 mM Tris-HCl pH 8.0,在冰浴情况下，用超声震荡破碎细胞，并在,+4,C,下高速离心,10,分钟,重新悬浮细胞沉淀物於,2,ml,含,e.g.urea,冲洗缓冲液和再度超声震荡,并在,+4,C,下高速离心,10,分钟,用冲洗缓冲液冲洗细胞沉淀物,2,M UREA,20,mM Tris HCl,2%,Triton X100,0.5,M NaCl,第62页,62,溶解和准备样品,重新悬浮细胞沉淀物於,5,ml,溶解缓冲液(,e.g.):,20 mM Tris-HCl,0.5 M NaCl,5 mM,咪唑,6,M,盐酸胍,1,mM 2-,巯基乙醇,pH 8,在室温等 30-60 分钟,在,+4C,离心 15 分钟,用 0.22,m,或 0.45,m,濾膜过滤,第63页,63,载体和标识纯化,pGEX,谷胱甘肽,S-,转移酶,GST MicroSpin Purification Module,GSTrap,Glutathione Sepharose Fast Flow,PQE6 x,组氨酸,His MicroSpin Purification Module,pETHisTrap,HiTrap Chelating,6 x,组氨酸,Chelating Sepharose Fast Flow,pEZZ 18(,非诱导性表示)蛋白,A,IgG,结合区,IgG Sepharose 6 Fast Flow,pRIT2T(,利用温度改变诱导,),蛋白,A,IgG,结合区,IgG Sepharose 6 Fast Flow,亲和层析纯化,第64页,GST 融合蛋白纯化,GST,重组蛋白,酶切位点,Factor Xa:,M,r,17-20 000/,28-30 000,Thrombin,:,M,r,37 000,PreScission Protease:,M,r,46 000,Glutathione Sepharose,M,r,26 000,10,C,第65页,65,SDS PAGE analysis,0,20,40,60,80,100,%,Elution,buffer,0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,5.0,10.0,15.0,20.0,ml,min,Wash,Elution,buffer,2.7,mg,pure GST,fusion,protein,5.0,10.0,15.0,20.0,A,280,kD,94,14.4,20.1,30,43,67,1 2 3,柱:,GSTrap 1 ml,样品:,8,ml,大肠杆菌表示含,GST,融合蛋白胞浆萃取液,结合缓冲液:,PBS,pH 7.3,洗脱缓冲液,50,mM Tris-HCl,pH 8.0 10 mM,还原谷胱甘肽,流速:,1,ml/min,层析 步骤:,4,CV,结合缓冲液,8,ml,样品,10,CV,结合缓冲液,5,CV,洗脱缓冲液,5,CV,结合缓冲液,(,CV=,柱体积),系统:,KTAexplorer 10,1:,低分子量标识(,LMW)Calibration kit,还原,Amersham Pharmacia Biotech,2:,胞浆萃取液,1,g/10 ml,3:,洗脱,GST,融合蛋白,第66页,66,(,His),6,融合蛋白纯化和检测,重组蛋白,His,His,His,Ni,2+,His,His,His,His,Ni,2+,Ni,2+,Ni,2+,第67页,67,第68页,SDS PAGE,Flo,w through,加样,结合液,洗脱液,结合液,A,A,280,280,A,A,405,405,1.0,0.5,0.0,0.70,0.60,0.50,0.40,0.30,0.20,0.10,0.0,5.0,10.0,15.0,20.0,Volume(ml),Eluted,pool,W,ash,kDa,94.0,67.0,43.0,20.1,14,4,1 2 3 4 5 6 7 8,样品:,5,ml,大肠杆菌表示含,(,His)-,标识,谷胱甘肽转移酶，,GST-(His),6,柱,:,HiTrap Chelating 1 ml,加,Ni,2+,结合缓冲液,:,1,X,磷酸缓冲液,20,mM,咪唑,pH 7.4,洗脱缓冲液:,1,X,磷酸缓冲液,500,mM,咪唑,pH 7.4,流速:,2,ml/min,312 cm/h,结果:,洗脱,GST-(His),6,4 ml,A,280,:1.65,总量:4.46,mg,1:,低分子量标识(,LMW),2:,样品稀释,1:20,3:,穿透稀释,1:10,4:,冲洗液,5:,洗脱,GST-(His),6,稀释,1:20,6:,洗脱,GST-(His),6,稀释,1:10,7:,GST,标准品,0.5,mg/ml,8:,LMW,第69页,69,纯化和复性,稀释样品,用,10 ml,结合缓冲液洗柱，,5 mM,咪唑,6,M,盐酸胍,pH 8.0,上样，并以,20 mM,咪唑,6 M,尿素,pH 8.0,缓冲液洗柱,复性,线性梯度：6,to 0 M,尿素 最少 30 柱体积 流速：0.1,ml/min-1 ml/min,用没有尿素缓冲液冲洗 5 个柱体积,纯化和洗脱,线性梯度:20,mM-500 mM,咪唑,10-20,柱体积,用,Hi,柱,Desalting,交换缓冲液去除,咪唑,1.0,0.75,0.5,0.25,0,10,20,30,40,50,60,65,ml,Manually using,a syringe:,Sample loading,Gua-HCl wash,Urea wash,Start,elution,fr.,38,fr.,42,fr.,46,fr.,49,fr.,40,Start,refold-,ing,A,280,第70页,70,1:,LMW,2:,样品,3-6:,盐酸胍冲洗物,7,8:,尿素冲洗物,1:,LMW,2-6:,组份 38-42,7,8:,组份 48,49,1.0,0.75,0.5,0.25,0,5,10,15,20,ml,A,280,kD94,6743,30,20.1,14.4,12345678,kD94,6743,30,20.1,14.4,12345678,Superdex 75 HR 10/30,SDS PAGE,PhastGel Gradient 1015,样品稀释前处理:用,15%,SDS,30%2-,巯基乙醇,+10,mM Tris+1 mM EDTA,稀释,1:5,HiTrap Chelating 1 ml,Superdex 75 HR 10/30,第71页,71,表示产物检测,1.western blotting,第72页,2.HPLC,高效液相层析,第73页,3.,聚丙烯酰胺凝胶电泳,4.,等电聚焦电泳,第74页,5.,双向电泳,6.,免疫电泳,7.,放射免疫测定,8.,酶联免疫吸附试验,第75页,
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