第四章--抗体多样性的产生.ppt

第六第六节节Ig的基因的基因结结构与构与Ab多多样样性的性的产产生生一、抗体学一、抗体学说说的的发发展展二、二、Ig的基因的基因结结构构三、三、Ig基因重排和表达基因重排和表达四、抗体多四、抗体多样样性的性的产产生机制生机制1.根据抗原抗体反根据抗原抗体反应应的特异性，的特异性，针对针对于某一种特定于某一种特定抗原，就会有特异的抗体与之相抗原，就会有特异的抗体与之相对应对应。也就是。也就是说说，外界存在有多少种抗原，在体内就会外界存在有多少种抗原，在体内就会产产生相生相应应的的抗体。据估抗体。据估计计，在人体内具有，在人体内具有产产生超生超过过1亿亿种抗体种抗体的潜在能力。的潜在能力。如此多的抗体如此多的抗体类类型是如何型是如何产产生的呢？生的呢？Ab多多样样性和特异性是如何性和特异性是如何产产生的？生的？抗体是如何抗体是如何抗体是如何抗体是如何产产产产生的？生的？生的？生的？预预预预先先先先储备储备储备储备抗原特异性抗原特异性抗原特异性抗原特异性抗原抗原抗原抗原诱导诱导诱导诱导抗体特异性抗体特异性抗体特异性抗体特异性抗体多抗体多抗体多抗体多样样样样性的性的性的性的产产产产生？生？生？生？一个基因一个基因一个基因一个基因编码编码编码编码一个蛋白一个蛋白一个蛋白一个蛋白一个基因一个基因一个基因一个基因编码编码编码编码多个蛋白多个蛋白多个蛋白多个蛋白上帝之上帝之谜谜：GOD（GenerationofDiversityGenerationofDiversity）2.一、抗体学一、抗体学说说的的发发展展3.侧链侧链学学说说抗原抗原诱导诱导学学说说n直接模板学直接模板学说说n折叠学折叠学说说n间间接模板学接模板学说说选择选择学学说说n自然自然选择选择学学说说n克隆克隆选择选择学学说说一、抗体学一、抗体学说说的的发发展展抗体形成机制的研究：抗体形成机制的研究：4.侧链侧链学学说说（1897年，年，Ehrlich）细细胞具有胞具有多种膜多种膜侧链侧链，毒，毒素可以特异与相素可以特异与相应侧链结应侧链结合合细细胞可胞可产产生多量而生多量而过过剩的剩的侧链侧链，并将其，并将其释释放的血液放的血液中，即成中，即成为为抗体，抗体，这这种游种游离的抗体，在血液中与毒离的抗体，在血液中与毒素素结结合，便可将其中和，合，便可将其中和，从而达到免疫效果。从而达到免疫效果。一个一个细胞克隆具胞克隆具备针对多多种抗原的种抗原的多种膜多种膜侧链侧链一、抗体学一、抗体学说说的的发发展展5.直接模板学直接模板学说说：抗原：抗原为为模板合成抗体模板合成抗体（1930年，Breinl和Haurowits）前提：蛋白质的合成要以蛋白质为模板。抗体的产生必需以抗原为模板，抗体的抗原结合部位是以抗原决定簇为模板而形成的。折叠学折叠学说说：抗原：抗原诱导诱导抗体折叠抗体折叠（1940年，Pauling）所有抗体的初级结构完全相同，即氨基酸的排列顺序，其决定于基因。球蛋白的高级结构取决于多肽链的折叠方式，高级结构决定抗体的特异性。如在形成球蛋白处附着有抗原时，即球蛋白的高级结构即按抗原折叠，因而可使抗体获得特异性。一、抗体学一、抗体学说说的的发发展展6.间间接模板学接模板学说说：抗原：抗原对对基因基因发发生影响生影响（1949年，年，Burnet和和Fenner）抗原进入细胞核中，干扰DNA的合成，指导抗体的特异性。抗原在细胞内继续存在，而且可随细胞而增殖，所以抗原不存在也能产生抗体。对于自身与非自身的识别上，认为一切属于自身的物质，均有自身的标记（self-marker），识别单位可以对其加以识别，因此对自身物质不能发生免疫反应。一、抗体学一、抗体学说说的的发发展展7.自然自然选择选择学学说说（1955年，年，Jerne）机体对任何抗原早已准备下了相似的抗体（自然抗体），外来的抗原如与某种自然抗体相对应时，便可与之结合。抗原抗体复合物被巨噬细胞吞噬后，抗原被酶溶解，剩下的抗体便可在巨噬细胞内诱导产生与其具有同样特异性的抗体。在抗体的形成上，起主要作用的是体内早已存在的抗体。这种抗体在特异性抗原的选择作用下，才能诱导吞噬细胞产生抗体。一、抗体学一、抗体学说说的的发发展展8.克隆克隆选择选择学学说说（Cloneselectivetheory）n受到Jerne的自然选择学说的影响，澳大利亚免疫学家Burnet毅然放弃其间接模板学说，并且引进了他在间接模板学说所主张的基因致使细胞特异性的概念n1957年发表了以“A modification of Jerne theory of antibody production using the concept of clone selection”为题的论文。n1959年出版了题为The clonal selection theory of aquired immunity的专著，创立了举世闻名的克隆选择学说。一、抗体学一、抗体学说说的的发发展展9.克隆克隆选择选择学学说说（Cloneselectivetheory）n基本思想基本思想l动物体内存在大量的淋巴细胞克隆，每一克隆表面都带有特异性的SIg。l抗原选择的不是游离的抗体，而是事先存在于淋巴细胞膜表面的抗原受体，即表面免疫球蛋白（SIg）。l抗原能够选择性的激活带有相应受体的淋巴细胞克隆，使其分化增殖，产生相应抗体。l决定抗体结构的是淋巴细胞的基因，抗原不能改变修饰产生抗体的基因。10.克隆克隆选择选择学学说说（Cloneselectivetheory）n对对抗体抗体产产生多生多样样性的解性的解释释：l动物出生后，体内约有107个免疫细胞克隆，能产生各种抗体，足够抗原选择。l抗原与特异淋巴细胞的抗原受体结合，相应的克隆即被选择，进而增殖分化，产生抗体。n抗原的作用：抗原的作用：l抗原的作用只是启动，与枪机的扳机相似。相应的克隆一旦被选出，即便没有抗原的存在，也能继续产生抗体。l决定抗体特异性的是DNA，抗原对其无影响11.克隆克隆选择选择学学说说（Cloneselectivetheory）n对对免疫免疫记忆现记忆现象的解象的解释释：l细胞克隆在分化过程中，一部分淋巴细胞停留在中间阶段，与再次同相应的抗体接触时，立刻发育成熟而产生抗体，呈现免疫记忆现象。n对对免疫耐受免疫耐受现现象的解象的解释释：l在胚胎后期，自身抗原已经齐备，于是凡能与自身抗原特异性结合的相应克隆，便可受到阻抑，最后被清除，构成自身免疫耐受。12.取被卵白蛋白、牛血清蛋白免疫的A兔的淋巴细胞（能产生抗卵白蛋白、牛血清蛋白的抗体）玻璃珠（附有牛血清蛋白）亲和淋巴细胞，收集非结合淋巴细胞。（玻璃珠附有牛血清白蛋白，同产生抗牛血清白蛋白的B细胞克隆发生结合而清除；抗卵白蛋白的淋巴细胞未被清除）用X射线处理B兔子，破坏骨髓，杀死原有的淋巴细胞；注入经玻璃珠处理的A兔淋巴细胞卵白蛋白、牛血清蛋白免疫B兔，只产生抗卵白蛋白的抗体克隆克隆选择选择学学说说（Cloneselectivetheory）实验证实验证据据1：Wigzell实验13.A抗原偶联放射性元素，免疫动物，清除能与A抗原结合的淋巴细胞，不能分泌抗A抗体识别其他抗原的细胞则不受影响，能产生抗体。克隆克隆选择选择学学说说（Cloneselectivetheory）实验证实验证据据2：Humphrey放射自放射自杀实验杀实验A产产产产生抗生抗生抗生抗A A及抗及抗及抗及抗B B抗体抗体抗体抗体抗原抗原A抗原抗原BB产产产产生抗生抗生抗生抗B B抗体抗体抗体抗体不不不不产产产产生抗生抗生抗生抗A A抗体抗体抗体抗体+14.结论结论一、抗体学一、抗体学说说的的发发展展抗体是如何抗体是如何抗体是如何抗体是如何产产产产生的？生的？生的？生的？预预预预先先先先储备储备储备储备抗原特异性抗原特异性抗原特异性抗原特异性一个一个一个一个B B细细胞克隆胞克隆胞克隆胞克隆对应对应一种抗体一种抗体一种抗体一种抗体抗体多抗体多抗体多抗体多样样样样性的性的性的性的产产产产生？生？生？生？一个基因一个基因一个基因一个基因编码编码编码编码一个蛋白一个蛋白一个蛋白一个蛋白一个基因一个基因一个基因一个基因编码编码编码编码多个蛋白多个蛋白多个蛋白多个蛋白未完待未完待续续面面面面对对对对自然界中无自然界中无自然界中无自然界中无穷穷穷穷无尽的抗原，就要求机体必无尽的抗原，就要求机体必无尽的抗原，就要求机体必无尽的抗原，就要求机体必须产须产须产须产生无限生无限生无限生无限多的相多的相多的相多的相应应应应的特异性抗体与之的特异性抗体与之的特异性抗体与之的特异性抗体与之针锋针锋针锋针锋相相相相对对对对，但怎，但怎，但怎，但怎样样样样才能使机体才能使机体才能使机体才能使机体内内内内为为为为数不多的数不多的数不多的数不多的基因基因基因基因产产产产生如此多的抗体呢？生如此多的抗体呢？生如此多的抗体呢？生如此多的抗体呢？15.二、二、Ig的基因的基因结结构构以重以重链为链为重点重点16.二、二、Ig的基因的基因结结构构1.H基因基因库库（重（重链链基因基因连锁连锁群）第群）第14号染色体号染色体2.基因基因库库（链链基因基因连锁连锁群）第群）第2号染色体号染色体3.基因基因库库（链链基因基因连锁连锁群）第群）第22号染色体号染色体（一）人（一）人类类胚系胚系Ig基因及其定位基因及其定位17.18.（二）人（二）人类类胚系胚系Ig基因基因结结构构二、二、Ig的基因的基因结结构构nHH链链链链：包括：包括：包括：包括V V、D D、J J、C C 基因片段。基因片段。基因片段。基因片段。l lC C基因片段的排列基因片段的排列基因片段的排列基因片段的排列顺顺顺顺序是：序是：序是：序是：5-C5-C-C C-C-C 3 3-C-C 1-1-C C 1-1-C C 2-C2-C 4-C4-C-C-C 2 2-3-3nL(L(/)链链链链：包括：包括：包括：包括V V、J J、C C 基因片段。基因片段。基因片段。基因片段。重重重重链链链链V V区的基因区的基因区的基因区的基因由由由由V V、D D、J J三个三个三个三个基因片段基因片段基因片段基因片段组组组组成成成成轻链轻链轻链轻链V V区基因由区基因由区基因由区基因由V V、J J两个基因片两个基因片两个基因片两个基因片段段段段组组组组成。成。成。成。19.H链链的的编码编码V区：区：V、D、J基因基因编码编码V基因：基因：CDR1、CDR2D基因及基因及V-D：大部分：大部分CDR3D-J基因：基因：CDR3其余部分及其余部分及骨架区骨架区C区：区：C C基因基因编码编码了解了解20.H链链胚系基因胚系基因结结构构C区基因（区基因（CH）:9个个V区基因区基因V基因片段（基因片段（VH）:65个个D基因片段（基因片段（DH）:27个个J基因片段（基因片段（JH）:6个个了解了解21.三、三、IgIg基因重排和表达基因重排和表达编码一条Ig重链、轻链的基因是由胚系中多个分开的DNA片段经剪切重排而成的。22.Ig基因表达的特点基因表达的特点（一）（一）Ig基因重排基因重排（二）等位排斥与同种型排斥（二）等位排斥与同种型排斥（三）（三）Ig的的类别转换类别转换（四）分泌型和膜型（四）分泌型和膜型Ig（五）（五）mIgM与与mIgD的共表达的共表达23.nIg基因重排基因重排：Ig胚系基因中，胚系基因中，V、（、（D）、）、J基因基因片段之片段之间间由内含子隔开，通由内含子隔开，通过过基因片段的随机重基因片段的随机重排，形成排，形成V（D）J连连接，再与基因片段接，再与基因片段连连接，接，才能才能编码编码完整的完整的Ig多多肽链肽链。Ig基因重排主要通基因重排主要通过过重重组组酶酶（recombinase）的作用）的作用实现实现。nIg胚系基因重排程序胚系基因重排程序l首先是重首先是重链发链发生基因重排，随后是生基因重排，随后是轻链轻链重排。重排。l重重链链：胚系基因：胚系基因D-J连连接接V-DJ连连接接三、三、Ig基因重排和表达基因重排和表达（一）（一）Ig基因重排基因重排重点重点24.三、三、Ig基因重排和表达基因重排和表达25.等位排斥（等位排斥（allelicexclusion）：一条染色体上一条染色体上Ig重重链链基因的有效重排，抑制另一条同源染色体重基因的有效重排，抑制另一条同源染色体重链链基基因重排。因重排。B细细胞中位于一胞中位于一对对染色体上的染色体上的轻链轻链或重或重链链基因，其中只有一条染色体上的基因得到表达。基因，其中只有一条染色体上的基因得到表达。保保证了一个了一个B细细胞只表达一种胞只表达一种轻链轻链和一种重和一种重链链，也即，也即只表达一种特异抗原受体。只表达一种特异抗原受体。同种型排斥（同种型排斥（isotypeexclusion）：是指两种轻链之间的排斥，轻链有链和链，但一个Ig分子只能表达其中的一种，或是链，或是链。(注意：二者在非同源的染色体)三、三、Ig基因重排和表达基因重排和表达（二）等位排斥与同种型排斥（二）等位排斥与同种型排斥26.类别转换类别转换（classswitching）：指指B细细胞在胞在受抗原受抗原刺激后刺激后，首先合成，首先合成IgM，然后，然后转为转为合成合成IgG、IgA和和IgE等的等的现现象。象。由于由于Ig的的类类型由重型由重链链决定，所以在重决定，所以在重链链重重排排时时，在，在V区基因不区基因不变变的情况下，的情况下，C基因基因发发生重排生重排，使得最，使得最终终的基因的基因产产物的物的V区相同，而区相同，而C区不同；也就是区不同；也就是说说抗体抗体识别识别的特异性相同，但的特异性相同，但Ig分子的分子的类类型却型却发发生了改生了改变变。三、三、Ig基因重排和表达基因重排和表达（三）（三）Ig的的类别转换类别转换重点重点IgGIgGIFN-IFN-IL-4IL-4IgEIgEIL-5IgAIgMB cell抗原抗原举举例例27.28.（三）（三）Ig的的类别转换类别转换（图图解）解）cmcdcg3VJCg3DVJDV-D-JcmV-D-JCg3CmCdIgMIgGcmcdcg3VJDVJCg3DDNADNA初始初始初始初始RNARNAmRNAmRNADNADNA重排重排重排重排重排后重排后重排后重排后DNADNA丢丢丢丢失的失的失的失的DNADNARNARNA选择选择选择选择剪切剪切剪切剪切29.Ig的的类别转换类别转换30.比比较较Ig基因重排与基因重排与类别转换类别转换V区基因重排类别转换性质DNA初次重排DNA二次重排发生位点骨髓外周淋巴组织发生时间B细胞骨髓发育成熟抗原刺激作用抗原特异性的B细胞发育产生功能性抗体三、三、Ig基因重排和表达基因重排和表达31.三、三、Ig基因重排和表达基因重排和表达（四）分泌型和膜型（四）分泌型和膜型IgIgM膜型膜型(mIgM)：作：作为为B细细胞受体接受抗胞受体接受抗原信息，活化原信息，活化B细细胞胞分泌型分泌型(SIgM)：结结合抗原，合抗原，发挥发挥免疫免疫防御作用防御作用产产产产生机制：生机制：生机制：生机制：RNARNA选择选择选择选择剪切剪切剪切剪切了解了解32.RNARNA选择选择选择选择剪切剪切剪切剪切33.幼稚B细胞的分化过程中，首先表达mIgM，后表达mIgD；mIgD是B细胞的重要表面标志。B细胞若仅表达mIgM，在接受抗原刺激后易形成耐受性，若同时表达mIgM和mIgD，则受抗原刺激后可被激活。故mIgD可作为B细胞分化发育成熟的标志，活化的B细胞或记忆B细胞的mIgD逐渐消失。三、三、Ig基因重排和表达基因重排和表达（五）（五）mIgM与与mIgD的共表达的共表达了解了解34.V-D-Jd dV-D-Jm md dPloyAPloyAV-D-Jm mIgDmRNAIgMmRNAPrimaryRNAtranscript三、三、Ig基因重排和表达基因重排和表达了解了解产产产产生机制：生机制：生机制：生机制：RNARNA选择选择选择选择剪切剪切剪切剪切35.四、抗体多四、抗体多样样性的性的产产生机制生机制破解上帝之破解上帝之谜谜36.1965年年Bennet首先提出首先提出“两个基两个基因因编码编码一条多一条多肽链肽链”假假说说，认为认为Ig的的V区和区和C区是由分隔存在的区是由分隔存在的基因所基因所编码编码，在淋巴，在淋巴细细胞胞发发育育过过程中程中这这两个基因两个基因发发生易位而生易位而重排在一起。重排在一起。1976年利根川年利根川进应进应用用DNA重重组组技技术证实术证实了了这这一假一假说说。发现发现：编码编码一条一条Ig多多肽链肽链的基因是由的基因是由各个分隔开的各个分隔开的DNA片段片段经经剪接剪接重排而形成。重排而形成。四、抗体多四、抗体多样样性的性的产产生机制生机制利根川利根川进进 因因因因“发现发现发现发现抗体多抗体多抗体多抗体多样样样样性的性的性的性的遗遗遗遗传传传传学原理学原理学原理学原理”而而而而获获获获19871987年年年年诺诺诺诺贝贝贝贝尔尔尔尔生理学或医学生理学或医学生理学或医学生理学或医学奖奖奖奖。37.实验证实验证据据38.1.编码编码Ig基因的多基因的多样样性性（原始因素）（原始因素）2.随机重排随机重排产产生的多生的多样样性性（主要因素）（主要因素）3.H、L链链的随机的随机组组合合四、抗体多四、抗体多样样性的性的产产生机制生机制VH:40(V)25(D)6(J)=6000VL(k):40(V)5(J)=200VL(l):30(V)4(J)=1201.9 106抗体多抗体多样样性机制性机制39.4.不准确不准确不准确不准确连连连连接、核苷酸插入接、核苷酸插入接、核苷酸插入接、核苷酸插入5.体体体体细细细细胞高胞高胞高胞高频频频频突突突突变变变变：B细细胞在受到胞在受到抗原剌激后抗原剌激后，已重排，已重排好的好的V区基因区基因(尤尤CDR3)突突变频变频率增高，称体率增高，称体细细胞高胞高频频突突变变。经过经过抗原的抗原的选择选择，使，使V区区CDR(互互补补决定区决定区)与抗原与抗原的的亲亲和力得到和力得到优优化，即化，即为为抗体的抗体的亲亲和力成熟和力成熟。抗体多抗体多样样性机制性机制四、抗体多四、抗体多样样性的性的产产生机制生机制+N-核苷酸核苷酸+TdT40.重重链链基基因因的的重重排排、RNA处处理理和和蛋蛋白白质质表表达达的的过过程程41.Ig(BCR)多多样样性可达性可达1014，TCR多多样样性可达性可达1016Question：为为什么有的人打乙肝疫苗却没什么有的人打乙肝疫苗却没有有诱导诱导出抗乙肝抗体？出抗乙肝抗体？42.43.第七第七节节 抗体的制抗体的制备备多克隆抗体多克隆抗体单单克隆抗体克隆抗体基因工程抗体基因工程抗体44.一、多克隆抗体（一、多克隆抗体（polyclonal antibodypolyclonal antibody），），第一代抗体第一代抗体 1.定定义义指由不同指由不同B细细胞克隆胞克隆产产生的生的针对针对抗原物抗原物质质中多种抗原决中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。定簇的多种抗体混合物。如如:免疫血清（含多种特异性、免疫血清（含多种特异性、抗体）。抗体）。2.特点特点来源广泛，制来源广泛，制备备容易；特异性不高容易；特异性不高3.实际实际意意义义预预防、治防、治疗疗感染性疾病感染性疾病如抗蛇毒血清、抗狂犬、破如抗蛇毒血清、抗狂犬、破伤风伤风血清等血清等多数天然抗原具有多种抗原决定簇,注入机体后可刺激多个B细胞克隆发生免疫应答,产生多种相应抗体-这种由多个克隆细胞产生的多种抗体混合物,即为多克隆抗体.45.带带有多个表位有多个表位抗原抗原针对针对不同表位不同表位的的B细细胞胞克隆增殖克隆增殖多种抗体的混合物多种抗体的混合物（多克隆抗体）（多克隆抗体）刺激小鼠刺激小鼠46.二、二、单单克隆抗体（克隆抗体（monoclonal antibody,McAb），），第二代抗体第二代抗体1.定定义义 由由单单一克隆一克隆B细细胞胞杂杂交瘤交瘤产产生的，只生的，只识识别别抗原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。抗原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。2.特点特点 具有高度均一性。具有高度均一性。3.杂杂交瘤交瘤细细胞胞 骨髓瘤骨髓瘤细细胞胞 无限增殖；无限增殖；免疫免疫B细细胞胞 合成、分泌特异性抗体。合成、分泌特异性抗体。4.杂杂交瘤技交瘤技术术 HAT培养基：次黄培养基：次黄嘌嘌(H),氨基蝶呤氨基蝶呤(A)和胸和胸腺腺嘧啶嘧啶核苷核苷(T)。47.能否利用能否利用传统传统的抗体制的抗体制备备方法方法制制备单备单克隆抗体？克隆抗体？方案方案1：利用生物化学的方法和：利用生物化学的方法和手段从多克隆抗血清中分离具有手段从多克隆抗血清中分离具有单一抗原一抗原结合位点的抗体分子。合位点的抗体分子。方案方案2：分离：分离产生抗体的特异的生抗体的特异的B细胞克隆，并使之在体外条件胞克隆，并使之在体外条件下下进行特异性抗体的合成。行特异性抗体的合成。48.Cesar MilsteinNobel Prize in 1984 Georges Kohler Nobel Prize in 1984革命性的突破：革命性的突破：杂杂交瘤技交瘤技术术49.Step1:进进行行杂杂交瘤交瘤细细胞融合胞融合单单克隆抗体的制克隆抗体的制备备原理和原理和方法：方法：(1)B细细胞能胞能产产生抗体，生抗体，但不易在体外培养但不易在体外培养(2)骨髓瘤骨髓瘤细细胞能在体内、胞能在体内、外无限增殖，但不能分泌外无限增殖，但不能分泌抗体抗体(3)两者形成的两者形成的杂杂交瘤交瘤细细胞即能大量增殖，又能合胞即能大量增殖，又能合成和分泌特异性抗体。成和分泌特异性抗体。50.HAT筛选培养基的主要成分为：H：次黄嘌呤，DNA合成底物A：氨基喋呤，正常：氨基喋呤，正常DNA合成合成阻断阻断剂T：胸腺嘧啶，DNA合成底物由于氨基喋呤的作用，使DNA合成的主要通路(叶酸途径)受阻，迫使细胞启动旁路通路进行DNA的合成。如果细胞的次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(TK)缺失，无法启动旁路通路利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成DNA，细胞死亡。Step2:筛选杂筛选杂交瘤交瘤51.结结果：果：HGPRT或或TK缺陷的骨缺陷的骨髓瘤髓瘤细细胞在胞在HAT培养基培养基中不能存活；中不能存活；脾脾细细胞不能在体外胞不能在体外长长期期培养繁殖；培养繁殖；杂杂交瘤交瘤细细胞从脾胞从脾细细胞胞获获得得HGPRT或或TK，可以，可以存活。存活。52.将将杂杂交瘤交瘤细细胞克隆混合胞克隆混合液充分稀液充分稀释释后加入每个后加入每个小孔，最小孔，最终终使每个小孔使每个小孔中最多含有一个中最多含有一个杂杂交瘤交瘤细细胞克隆（胞克隆（单单克隆克隆）用特异性抗原决定簇用特异性抗原决定簇对对每个孔的每个孔的杂杂交瘤交瘤细细胞克胞克隆隆进进行行检测检测，选选出出针对针对目目标标抗原决定簇的抗体抗原决定簇的抗体阳性阳性细细胞株胞株Step3:筛选筛选抗体抗体YYYYYY取每孔的上清液与目取每孔的上清液与目标标抗原决定簇抗原决定簇进进行抗原抗行抗原抗体反体反应应，若呈阳性，若呈阳性，说说明明该该孔内的孔内的杂杂交瘤交瘤细细胞胞克隆克隆为为我我们们所需要的所需要的细细胞株胞株53.54.单单克隆和多克隆抗体的比克隆和多克隆抗体的比较较和用途和用途特异性特异性敏感性敏感性均一性均一性McAbPcAb差差无无高高强强有有1、用于免疫学、用于免疫学检测检测，辅辅助助临临床床诊诊断断2、McAb用于用于亲亲和和层层析，分析，分离微量可溶性抗原离微量可溶性抗原3、标记标记的的McAb用于基用于基础础研研究，了解究，了解细细胞分化等胞分化等4、制、制备备生物生物导弹导弹用于用于肿肿瘤、瘤、移植、自身免疫疾病等的移植、自身免疫疾病等的临临床治床治疗疗。55.（三）基因工程抗体（三）基因工程抗体(Geneticengineeringantibody)概念：概念：概念：概念：根据研究者的意根据研究者的意根据研究者的意根据研究者的意图图图图，采用基因工程方法，在基，采用基因工程方法，在基，采用基因工程方法，在基，采用基因工程方法，在基因水平，因水平，因水平，因水平，对对对对免疫球蛋白基因免疫球蛋白基因免疫球蛋白基因免疫球蛋白基因进进进进行切割、拼接或行切割、拼接或行切割、拼接或行切割、拼接或修修修修饰饰饰饰后后后后导导导导入受体入受体入受体入受体细细细细胞胞胞胞进进进进行表达，行表达，行表达，行表达，产产产产生新型抗体。生新型抗体。生新型抗体。生新型抗体。主要包括主要包括主要包括主要包括 人源化抗体如嵌合抗体、改形抗体等，人源化抗体如嵌合抗体、改形抗体等，人源化抗体如嵌合抗体、改形抗体等，人源化抗体如嵌合抗体、改形抗体等，单链单链单链单链抗体、双价抗体和双特异性抗体。抗体、双价抗体和双特异性抗体。抗体、双价抗体和双特异性抗体。抗体、双价抗体和双特异性抗体。56.n(1)嵌合抗体(chimeric antibody)：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。n特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。1 1、人源化抗体、人源化抗体人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体知知识识拓展拓展57.（2）改形抗体(reshaped antibody)：将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体。人人-鼠改形抗体鼠改形抗体知知识识拓展拓展58.（3）完全人源化抗体：将小鼠 Ig 基因敲除，转染人 Ig 基因，在小鼠体内产生人 Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体。知知识识拓展拓展59.l用基因工程方法，将抗体一条重链和一条轻链可变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋白。它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片断。l特点：能保持与抗原结合的性能，分子量小，穿透性强，体内循环半衰期短，免疫原性低。l应用：单链抗体与重组毒素、细胞因子或药物等融合表达，用于肿瘤的导向治疗;肿瘤定位诊断等 2、单链单链抗体抗体(singlechainantibody)知知识识拓展拓展60.是一是一类类具有双功能的抗体具有双功能的抗体杂杂交分交分于，两价抗体中的于，两价抗体中的Fab段具有不同段具有不同特异性，能与不同的表位特异性，能与不同的表位结结合。合。3、双特异性抗体、双特异性抗体(bispecificantibody)双特性抗体双特性抗体杀伤肿杀伤肿瘤瘤细细胞示意胞示意图图知知识识拓展拓展抗肿瘤和抗免疫活性细胞CDl6或CD3的双特异性抗体，不仅具有激活NK细胞或T细胞作用，而且可以通过抗肿瘤的Fab段特异性结合肿瘤细胞发挥作用，提高局部NK细胞或T细胞浓度，增强效应分子杀伤肿瘤能力61.62.多克隆抗体单克隆抗体来源动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群多为鼠源性特点来源广泛、制备容易纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应、制备成本低组成针对不同抗原表位的抗体的混合物针对单一表位，结构和组成高度均一，抗原特异性及同种型一致应用疾病的被动免疫治疗广泛用于疾病诊断、特异性抗原或蛋白的检测和鉴定、疾病的被动免疫治疗和生物导向药物制备缺点特异性不高、易发生交叉反应，不易大量制备人体应用后可导致人鼠抗体反应多克隆抗体与多克隆抗体与单单克隆抗体的比克隆抗体的比较较63.思考思考题题：1、抗体与免疫球蛋白及、抗体与免疫球蛋白及球蛋白有何不同。球蛋白有何不同。2、从免疫球蛋白的基本、从免疫球蛋白的基本结结构、构、酶酶解片段及功能区解片段及功能区说说说说抗体的基本抗体的基本结结构。构。3、免疫球蛋白有哪几大、免疫球蛋白有哪几大类别类别，各自的主要特性及功能，各自的主要特性及功能有哪些？有哪些？4、什么是免疫球蛋白的、什么是免疫球蛋白的类别转换类别转换？5、理解抗体多、理解抗体多样样性的原理。性的原理。6、抗体有哪些功能？、抗体有哪些功能？7、什么是、什么是单单克隆抗体？其制克隆抗体？其制备备原理和原理和过过程如何？程如何？64.2、补补体体结结合部位位于合部位位于IgG类类抗体的（抗体的（）AVH区区BVL区区CCH2区区DCH3区区3、补补体体结结合部位位于合部位位于IgM类类抗体的（抗体的（）AVH区区BVL区区CCH2区区DCH3区区4、关于、关于铰链铰链区的区的组组成，下列哪成，下列哪项项是正确的（是正确的（）A含大量丙氨酸含大量丙氨酸B含大量酪氨酸含大量酪氨酸C含大量脯氨酸含大量脯氨酸D含大量苯丙氨酸含大量苯丙氨酸习题习题1 1、抗体与抗原、抗体与抗原结结合的部位有（合的部位有（）A A 重重链链和和轻链轻链的的V V区区 B B 重重链链和和轻链轻链的的CDRCDR区区 C C F(ab)2F(ab)2片段片段 D FabD Fab片片段段6、胃蛋白、胃蛋白酶酶水解水解IgG的的产产物是（物是（）A2Fab段段+Fc段段B2F(ab)段段+Fc段段C2Fab段段+pFc段段DF(ab)2段段+pFc段段5、IgG和和IgE的功能区不同，主要在于（的功能区不同，主要在于（）A是否有是否有CH1B是否有是否有CH2C是否有是否有CH3D是否有是否有CH47、含有、含有CH4功能区的抗体是（功能区的抗体是（）AIgE和和IgABIgM和和IgGCIgA和和IgGDIgM和和IgEABCDCDCDDD65.8、具有、具有补补体体C1q结结合点的合点的Ig是是（）AIgE和和IgDBIgG和和IgMCIgM和和IgADIgE和和IgG10、既能、既能结结合合补补体又能与体又能与SPA结结合的合的Ig是是（）AIgEBIgMCIgADIgG11、关于分泌型、关于分泌型IgA，下列哪，下列哪项项是是错误错误的的（）A由两个由两个单单体体IgA、一个、一个J链链和一个分泌片和一个分泌片组组成成B由淋巴由淋巴结结中的中的浆细浆细胞胞产产生生C分泌片由粘膜上皮分泌片由粘膜上皮细细胞胞产产生生D分泌片可保分泌片可保护护sIgA不被蛋白不被蛋白酶酶水解水解9、血清中含量最高的、血清中含量最高的Ig是是（）AIgEBIgMCIgADIgG12、能与肥大、能与肥大细细胞胞结结合的合的Ig是是（）AIgEBIgMCIgADIgGEIgD13、J链链存在于下列哪一种存在于下列哪一种Ig分子分子结结构中构中（）AIgEBIgMC血清型血清型IgADIgGEIgDBDDBAB66.16、B细细胞成熟胞成熟时时，其膜上出，其膜上出现现下列哪种下列哪种Ig（）AIgEBIgMCIgADIgGEIgD17、外分泌液中，含量最高的、外分泌液中，含量最高的Ig是是（）AIgEBIgMCIgADIgGEIgD14、五聚体、五聚体IgM，实际实际可可结结合抗原的合抗原的结结合点有合点有（）A2个个B4个个C5个个D10个个15、在粘膜局部主要起免疫作用的抗体是、在粘膜局部主要起免疫作用的抗体是（）AIgEBIgMCIgADIgGEIgD18、IgE类类抗体主要介抗体主要介导导了下列哪种反了下列哪种反应应（）A调调理作用理作用BADCC作用作用C超敏反超敏反应应D粘膜局部免疫粘膜局部免疫CCECC67.