银杏叶部内生真菌多样性的研究.doc

银杏叶部内生真菌多样性的研究
杜少康 陈双林* 林岱 吴鸣谦 王梅霞
南京师范大学生命科学学院 南京 210046

摘 要：为了解我国特有植物银杏的叶部组织中内生真菌菌群的多样性和演替变化，分别于春、夏、秋季从江苏和山东两省的五个主要银杏栽培地采集健康叶片进行了内生真菌的研究。结果表明：所分离出的1971株内生真菌可归于32属，以交链孢属Alternaria（18.01%）、叶点霉属Phyllosticta（14.66%）和丝核菌属Rhizoctonia（14.56%）为优势菌群。在内生真菌的类群及组成上存在着部位、地区以及季节的差异性，也呈现一定的规律性。多样性指数的计算反映出所获得的银杏叶部内生真菌菌群具有不同的丰富度及均匀度，同时有一定的相似性。
关键词：分离率，分离频率，优势菌群，多样性指数，相似性系数

Diversity of endophytic fungi in leaves of Ginkgo biloba
DU Shao-Kang CHEN Shuang-Lin* LIN Dai WU Ming-Qian WANG Mei-Xia
College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China
Abstract: Diversity of endophytic fungi in leaves of Ginkgo biloba was studied in order to understand diversity state and succession change of endophytic fungal communities in this endemic plant. Healthy leaf samples were collected from five main planting locations of G. biloba in Jiangsu and Shandong provinces separately in spring, summer and autumn. A total of 1971 strains of endophytic fungi was isolated. As a result of morphological identification 32 genera were obtained, of which Alternaria (amounting to 18.01% of the total), Phyllosticta (14.66%) and Rhizoctonia (14.56%) were dominant. The distribution and composition of endophytic fungi varied with plant organs colonized, localities and seasons, but they assumed regularity to a certain extent. Populations of endophytic fungi in different parts of the leaves indicated different abundance and uniformity but assumed similarity to a certain extent.
Key words: isolation rate, isolation frequency, dominant population, diversity index, similarity coefficient

从de Bary在1866年指出植物中存在有内生微生物，特别是从上个世纪80年代至今，大量的植物内生真菌资源被发掘出来，从而也证实了内生真菌在植物体内是普遍存在的（郭良栋 2001）。从不同植物中分离到的内生真菌数量不同，Fisher et al.（1993）从光叶大戟Eucalyptus nitens Maiden上分离到60多种内生真菌。但是仅凭种数多寡来评价某种植物的内生真菌多样性丰富与否虽然直观却不够科学、客观和准确。另一方面，已有的研究资料表明：由于协同进化的作用使得某些内生真菌具有宿主专一性，平均每种植物有4－5种专性内生真菌（Petrini 1991），因此，选择特有植物根据分离率分析内生真菌的特定组成和演替变化、运用多样性指数来评价其内生真菌的丰富度将有助于植物内生真菌多样性研究的深入。
银杏Ginkgo biloba L.是单科单属单种的多年生落叶乔木，为我国特有树种。其内生真菌的研究主要是由国内一些研究者开展，且主要集中在生物活性菌株的研究上，如对与宿主银杏相似的黄酮类化合物产生菌的分离和鉴定（王梅霞等 2004；韩晓丽等 2008），对产香的银杏内生镰刀菌G1024菌株的生物学特性和挥发性成分的研究（蒋继宏等 2004；鞠秀云等 2006），对银杏内生真菌抑菌活性的研究（申屠旭萍等 2006，2007）等。在银杏内生真菌的多样性研究上，周松林等（2006）采用随机引物扩增多态性技术分析了银杏内生刺盘孢的遗传多样性，甘金莲等（2007）探讨了银杏内生真菌生态分布的一些特征，樊有赋等（2007）则研究了银杏内生真菌的种群多样性。本研究在江苏和山东两省的主要银杏栽培基地分别于春、夏、秋三季定点随机采样，通过菌种分离和鉴定以及分离率和多样性指数计算，分析了银杏叶部组织中内生真菌的组成、多样性和分布特征。
1 材料与方法
1.1 材料
分别于2007年春季（5月）、夏季（8月）及秋季（11月）在5个样点（表1）采集银杏叶样品。在每一采样地点，随机选取相隔一定距离的若干健康的银杏植株采样。样品标记后置于保鲜袋中，于4℃保存，在12h之内对样品进行内生真菌的分离。
1.2 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH值自然，临用时加250mg/L链霉素。
1.3 内生真菌的分离、纯化及保藏
采用常规的真菌组织分离法（方中达 1998）。叶片剪成0.5cm×0.5cm左右的组织小块，叶柄剪成1cm长的小段。每次分离均选取叶片组织块200个，叶柄组织块50个。
表1 银杏叶组织采样地点及其生境
Table 1 Sampling site and habitat of the leaves of Ginkgo biloba
采样地点
Sampling site
采样生境
Habitat
江苏南京
Nanjing, Jiangsu
公园
Park
江苏泰兴
Taixing, Jiangsu
种植园
Plantation
江苏启东
Qidong, Jiangsu
公园
Park
江苏邳州
Pizhou, Jiangsu
种植园
Plantation
山东郯城
Tancheng, Shandong
种植园
Plantation
1.4 内生真菌的鉴定
依照真菌的经典分类鉴定方法，从纯化后培养数日的菌落上挑取菌体制成切片，置于光学显微镜下观察菌丝、有性或无性孢子、产孢结构等的形态特征，鉴定到属。真菌分类鉴定的工具书主要为《真菌鉴定手册》（魏景超 1979），半知菌的鉴定则主要依据Barnett & Hunter（1998）的系统，并根据Kirk et al.（2001）追寻属的变动采用目前的属名和定义。
1.5 数据处理
采用分离频率比较判断优势菌群。分离频率（isolation frequency，IF）：分离到的某一指定类型内生真菌的菌株数占分离总的内生真菌菌株数的百分率。
采用分离率衡量植物组织中内生真菌的丰富程度和每个组织块受多重侵染的发生频率。分离率（isolation rate，IR）：分离到的某一指定类型内生真菌的菌株数占分离样品组织块总数的百分率。
采用Shannon-Wiener指数（H）和Simpson指数（D）分析内生真菌的群落生物多样性。H=-Σ(Pi)(ln Pi)、D=1-Σ(Pi)2，式中：Pi为属于种i的个体在全部个体中的比例；采用Evenness指数（J）分析群落物种分布的均匀程度。J=H/lnS，式中：H为Shannon-Wiener指数、S为物种总数目；采用Sorenson（Cs）及Jaccard（CJ）相似性系数比较两地之间内生真菌种类组成的相似程度。CS=2j/(a+b)，CJ=j/(a+b-j)，式中：j为两个样地共有种数或属数；a和b分别为样地A和样地B的物种数或属数。
2 结果分析
2.1 内生真菌的组成
从五个地点三个季节采集的银杏叶中共分离得到内生真菌1971株，鉴定后归于32属，少数因不产孢而未鉴定出种属的暂归为一类——无孢菌群（Sterile mycelia）。分离得到的内生真菌多属于半知菌（94.82%），少数属于子囊菌（2.38%）。在目的分类水平上以半知菌中的丛梗孢目Moniliales和球壳孢目Sphaeropsidales为优势菌群，分别占总菌株数的37.85%和31%；在科的分类水平上以球壳孢科、暗梗孢科、黑盘孢科为优势菌群，分别占总菌株数的30.84%、27.84%和10.75%；在属的水平上以交链孢属Alternaria、叶点霉属Phyllosticta、丝核菌属Rhizoctonia为优势类群，分别占总菌株数的18.01%、14.66%和14.56%（表2）。
2.2 内生真菌的差异分布
2.2.1 内生真菌在不同部位的分布：各采样地春季
柄中内生真菌的分离率均高于叶片，而夏、秋两季时叶片中内生真菌的分离率则显著高于叶柄（图1）。但是，叶片和叶柄内生真菌的种群组成却基本一致，优势菌群均为交链孢属Alternaria、叶点霉属Phyllosticta和丝核菌属Rhizoctonia。
2.2.2 内生真菌的地理分布：在5个采样调查地区之间，银杏叶中内生真菌的菌群组成存在差异，在分离率上表现为南京>启东>邳州>郯城>泰兴的规律（图1）。除共有的优势菌群以外，银杏叶部内生真菌还具有其各自地区的优势菌群。其中，南京为盘长孢属Gloeosporium（3.55%），泰兴为匐柄霉属Stemphylium（1.07%），启东为刺盘孢属Colletotrichum（3.65%），邳州为闭果霉属Sclerotiopsis（1.17%），郯城为拟茎点霉属Phomopsis（3.75%）。此外，部分内生真菌也具有一定的地理分布特性，泰兴为拟青霉属Paecilomyces（0.05%）和单格孢属Ulocladium（0.10%），郯城为丝葚霉属Papulospora（0.15%），邳州为黑腐菌属Guignardia（0.15%），南京为小丛壳属Glomerella（0.10%）（表3）。
2.2.3 内生真菌在不同季节的分布：在春、夏、秋三个季节中，春季内生真菌的分离率为7.76%，显著低于夏季的19.76%和秋季的25.04%（图1）。在

图1 银杏叶片和叶柄内生真菌菌群分离率随季节的变化
Fig. 1 The seasonal change of isolation rate of endophytic fungi in blade and petiole of Ginkgo biloba. Spr., Spring; Sum., Summer; Aut., Autumn; NJ, Nanjing; TX, Taixing; QD, Qidong; PZ, Pizhou; TC, Tancheng.

表2 银杏叶部内生真菌的类群组成
Table 2 The composition of endophytic fungi in leaves of Ginkgo biloba
纲
目
科
属
分离率（%）
分离频率（%）
Class
Order
Family
Genus
Isolation rate (%)
Isolation frequency (%)
半知菌
Fungi Imperfecti
丛梗孢目
Moniliales
丛梗孢科
Moniliaceae
青霉属 Penicillium
1.47
2.79
木霉属 Trichoderma
0.67
1.27
曲霉属 Aspergillus
0.45
0.86
拟青霉属 Paecilomyces
0.03
0.05
头孢霉属 Cephalosporium
0.16
0.30
葡萄孢属 Botrytis
0.35
0.66
短梗霉属 Aureobasidium
0.75
1.42
合计
3.88
7.35
瘤座菌科
Tuberculariaceae
镰孢属 Fusarium
1.39
2.64
暗梗孢科
Dematiaceae
单格孢属 Ulocladium
0.05
0.10
匐柄霉属 Stemphylium
2.61
4.97
交链孢属 Alternaria
9.47
18.01
黑孢属 Nigrospora
0.53
1.01
链毛孢属 Streptothrix
0.43
0.81
色串孢属 Torula
1.55
2.94
合计
14.64
27.84
球壳孢目
Sphaeropsidales
球壳孢科
Sphaeropsidaceae
叶点霉属 Phyllosticta
7.71
14.66
拟茎点霉属 Phomopsis
2.72
5.18
壳二孢属 Ascochyta
0.43
0.81
色二孢属 Diplodia
0.13
0.25
闭果霉属 Sclerotiopsis
0.85
1.62
壳变孢属 Hendersonula
1.01
1.93
核座孢属 Plenodomus
1.52
2.89
射盾孢属 Actinopelte
1.12
2.13
壳单孢属 Amerosporium
0.72
1.37
合计
16.21
30.84
裂壳孢科
Excipulaceae
刺毛壳孢属 Dinemasporium
0.08
0.15
黑盘孢目
Melanconiales
黑盘孢科
Melanconiaceae
刺盘孢属 Colletotrichum
2.27
4.31
盘长孢属 Gloeosporium
3.39
6.44
合计
5.66
10.75
无孢目
Agnomycetales

丝核菌属 Rhizoctonia
7.65
14.56
小菌核属 Sclerotium
0.27
0.51
丝葚霉属 Papulospora
0.08
0.15

合计
8.00
15.22
子囊菌
Ascomycetes
座囊菌目
Dothideales
座囊菌科
Dothideaceae
黑腐菌属 Guignardia
0.08
0.15

续表2

球壳菌目
Sphaeriales
日规壳菌科
Gnomoniaceae
小丛壳属 Glomerella
0.05
0.10
毛壳菌科
Chaetomiaceae
毛壳菌属 Chaetomium
1.12
2.13
无孢菌群Sterile mycelium
1.47
2.79
表3 不同地区银杏叶部内生真菌菌群主要类群的比较
Table 3 The comparison of common endophytic fungi in leaves of Ginkgo biloba from different sampling sites
内生真菌Endophytes
分离频率 Isolation frequency (%)
属Genera
南京Nanjing
泰兴Taixing
启东Qidong
邳州Pizhou
郯城Tancheng
青霉属Penicillium
0.76
0.36
0.41
0.25
1.01
木霉属Trichoderma
0.71
0.05
0.20
0.25
0.05
曲霉属Aspergillus
0.05
0.15
0.10
0.10
0.46
拟青霉属Paecilomyces
--
0.05
--
--
--
头孢霉属Cephalosporium
--
0.15
0.15
--
--
葡萄孢属Botrytis
0.25
--
--
--
0.41
短梗霉属Aureobasidium
0.96
--
--
0.20
0.25
镰孢属Fusarium
0.51
0.05
0.20
--
1.88
单格孢属Ulocladium
--
0.10
--
--
--
匐柄霉属Stemphylium
0.66
1.07
1.27
1.01
0.96
交链孢属Alternaria
3.86
2.74
5.73
4.06
1.62
黑孢属Nigrospora
0.10
0.30
--
0.20
0.41
链毛孢属Streptothrix
0.61
--
-
--
0.20
色串孢属Torula
--
0.76
0.71
0.41
1.07
叶点霉属Phyllosticta
8.27
1.17
0.51
4.36
0.36
拟茎点霉属Phomopsis
0.86
0.41
0.15
--
3.75
壳二孢属Ascochyta
0.41
0.10
--
--
0.30
色二孢属Diplodia
--
--
--
0.20
0.05
闭果霉属Sclerotiopsis
0.20
--
--
1.17
0.25
壳变孢属Hendersonula
--
0.46
0.30
0.91
0.25
核座孢属Plenodomus
1.47
--
0.10
0.96
0.36
刺毛壳孢属Dinemasporium
0.10
--
--
--
0.05
壳单孢属Amerosporium
0.30
0.41
0.15
0.10
0.41
射盾孢属Actinopelte
1.78
--
--
0.36
--
刺盘孢属Colletotrichum
0.56
0.10
3.65
--
--
盘长孢属Gloeosporium
3.55
0.05
2.38
0.30
0.15
丝核菌属Rhizoctonia
0.56
1.12
8.47
3.30
1.12
小菌核属Sclerotium
0.05
--
--
0.20
0.25
丝葚霉属Papulospora
--
--
--
--
0.15
黑腐菌属Guignardia
--
--
--
0.15
--
小丛壳属Glomerella
0.10
--
--
--
--
毛壳菌属Chaetomium
0.81
0.56
0.05
0.56
0.15
表4 银杏叶部内生真菌菌群的多样性指数
Table 4 The diversity index of endophytic fungi in leaves of Ginkgo biloba
采样地
季节
菌株种数
多样性指数 Diversity index
均匀度指数
Sampling site
Season
Species
Shannon-Wiener indices
Simpson’s indices
Evenness

春Spring
12
2.2852
0.8810
0.9196
南京Nanjing
夏Summer
20
2.1408
0.7987
0.7146

秋Autumn
17
2.2664
0.8561
0.8000

春Spring
10
2.1272
0.8616
0.9238
泰兴Taixing
夏Summer
16
2.0539
0.7752
0.7408

秋Autumn
15
2.2646
0.8701
0.8362

春Spring
10
2.0994
0.8521
0.9118
启东Qidong
夏Summer
9
1.3902
0.6992
0.6327

秋Autumn
17
2.0704
0.8146
0.7308

春Spring
11
2.0710
0.8423
0.8637
邳州Pizhou
夏Summer
14
2.1406
0.8505
0.8111

秋Autumn
17
2.0909
0.8276
0.7380

春Spring
12
1.9908
0.8056
0.8012
郯城Tancheng
夏Summer
18
2.2440
0.8527
0.7764

秋Autumn
21
2.7102
0.9041
0.8902

菌株数量和种类上，春季仅为291株和16种，都明显低于夏季和秋季。夏季和秋季相比较，两者在种群类别上差异不大，分别为28种和31种，只是秋季菌株数量939株略高于夏季的741株。
2.3 内生真菌的多样性
2.3.1 内生真菌菌群的多样性指数：秋季在郯城所分离获得的内生真菌菌群的Shannon-Wiener多样性指数最高（2.7102），夏季在启东获得的内生真菌菌群的Shannon-Wiener指数最低（1.3902）。Simpson多样性指数的范围在0到1之间，结果与Shannon-Wiener指数是一致的，仍然是秋季郯城的最高及夏季启东的最低，其指数分别为0.9041和0.6992（表4）。
均匀度可以反映出群落中不同物种分布的均匀程度。通过对各内生真菌种群均匀度指数的计算发现，分离得到的内生真菌种群均匀度各不相同，均匀度指数都在0.6以上。其中以春季泰兴菌群的均匀度指数最高（0.9238），而夏季启东菌群的最低（0.6327）（表4）。
表5 银杏叶部内生真菌种类组成在地区之间的相似性系数
Table 5 The similarity coefficients of endophytic fungi in leaves of Ginkgo biloba from different sampling sites
采样地
Sampling site
南京
Nanjing
泰兴
Taixing
启东
Qidong
邳州
Pizhou
郯城
Tancheng
南京Nanjing

0.5333
0.5357
0.5862
0.7586
泰兴Taixing
0.6957

0.7727
0.5000
0.5667
启东Qidong
0.6977
0.8718

0.5600
0.5714
邳州Pizhou
0.7391
0.6667
0.7179

0.6786
郯城Tancheng
0.8627
0.7234
0.7273
0.8085

注：表中对角线以上为Jaccard指数，以下为Sorenson指数.
Note: Jaccard index (above diagonal) and Sorenson index (below diagonal).
2.3.2 内生真菌菌群的相似性系数：通过两种相似性系数Jaccard指数和Sorenson指数的计算结果的比较，发现从5个采集地点分离获得的内生真菌菌群的相似性系数均大于0.5（表5），这说明各地银杏内生真菌菌群之间具有一定的相似性。其中南京与郯城、泰兴与启东之间的内生真菌菌群有较高的相似性，它们之间的Jaccard指数和Sorenson指数分别为0.7586、0.7727和0.8627、0.8718（表5）。
3 讨论
本研究所获得的银杏叶部组织的内生真菌类群普遍被认为腐生性较强，所采集的样本全部来自健康植株，宿主完全没有受到伤害或感染病害的症状，应该不会给腐生性真菌提供生长基质。叶部组织材料的表面消毒彻底，可以排除叶表的腐生菌和附生菌，因此，可以认为这些真菌是内生的或至少是部分内生且不引起植物病害，它们符合植物内生真菌的有关定义（Petrini 1991；Stone et al. 2000）。但是，本研究获得的银杏内生真菌，除了闭果霉属Sclerotiopsis、射盾孢属Actinopelte和小丛壳属Glomerella等个别类群尚未在银杏以外的其它植物中见到报道外，其余大都已作为内生真菌被广泛分离报道，这可能与研究所采用分离培养基为通用培养基有关。考虑到不同的植物应有特定的专一性内生真菌物种，在今后的内生真菌资源研究中，多种选择性分离培养基的采用和将内生真菌鉴定到种的水平是必要的。
研究表明银杏叶部组织内生真菌在叶片和叶柄两个部位的分布以及季节间存在差异。这可能是因为春季银杏叶柄部位发育较之叶片成熟，而到了夏季和秋季，随着叶片发育完全，表面积的逐渐增大，原有内生真菌从叶柄向叶片扩展、或是外部真菌增加了侵染机会所致。另一方面，银杏叶部组织中内生真菌的类群与分布在不同地理生境下也存在着差异，这说明内生真菌的类群和分布可能受到地理位置及其气候环境等因素的影响。研究结果表明，不同地区银杏叶部组织的内生真菌在春季的种群数量及分离率都是最少和最低的，而在夏季和秋季均有很明显的升高，这可能是与气候、环境、降雨量等外在条件的季节性变化有关，这与其他植物内生真菌研究的结果相一致（Larran et al. 2001; Vujanovic & Brisson 2002；Santamarı´a & Bayman 2005; 柯海丽等 2007）。不过，决定植物内生真菌菌群分布、组成特征和演替变化的因素和作用机制既是多方面的又可能是较为复杂的，需深入研究。
丰富度和均匀度指数是反映生境中真菌菌群分布的重要参数，相似性系数是反映两个不同生境中真菌菌群组成相似程度的重要参数。丰富度指数数值越大，表明种类越多，多样性越高；均匀度指数则反映着种类之间个体分配的均匀性，其值越大，多样性一般也越高；相似性系数越大，两个生境的多样性水平越接近。由本研究的多样性指数及相似性系数的结果可以得出这样的判断，各采样地点银杏叶部组织中的内生真菌菌群普遍具有较高的多样性，因为分别计算Shannon-Wiener指数和Simpson指数获得的多样性参数所反映出来的结果是一致的，并不因春季分离获得的菌群数量少些、夏季和秋季分离获得的菌群多些而呈现出季节间的波动，均匀度指数也同时表明本研究各采样地区内银杏叶部组织中的内生真菌多样性是比较稳定的，组成菌群的分配是比较均匀的。本研究采样地点中的江苏泰兴和山东郯城均被称为我国的银杏之乡，江苏邳州又与山东郯城相邻，银杏植株生长缓慢而时间较长，因此也促成了银杏内生真菌多样性的丰富和稳定。相似性系数的结果更反映出银杏叶部组织中的内生真菌多样性水平在地区间的差异是适中的，相近程度较好。这就暗示我们，银杏作为一种古老的植物在长期的进化过程中与其体内外的真菌菌群可能已经形成了较好的适应关系，不仅多样性水平较高，而且较为稳定。不过，这需要长期和地域广泛的研究调查来证实。

[REFERENCES]
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