云斑白条天牛幼虫肠道致病菌的分离鉴定及杀虫活性研究.pdf

DOI:10.11929/j.swfu.202206063引文格式：庞美玲,李贝娜,林叶邦,等.云斑白条天牛幼虫肠道致病菌的分离鉴定及杀虫活性研究 J.西南林业大学学报（自然科学）,2023,43(5):177182.云斑白条天牛幼虫肠道致病菌的分离鉴定及杀虫活性研究庞美玲李贝娜林叶邦杨振德（广西大学林学院，广西南宁530004）摘要：应用传统微生物鉴别方法并结合分子技术对自然罹病死亡的云斑白条天牛幼虫肠道内 1 株产红色色素的菌株（BS1）进行分类鉴定；采用饲喂法观测该菌株 BS1 菌悬液对云斑白条天牛 5 龄幼虫的毒力及致病症状。结果表明，该菌株 BS1 为粘质沙雷氏菌。以基础培养基培养时，其余成分种类及添加量为蔗糖 1%、酵母粉 6%及 NaCl1%时最适，且最佳体外培养条件为 35、pH=7、240rpm、培养时间为 16h。使用 1.171011cfu/mL 的菌悬液处理新鲜铁核桃树树皮饲喂云斑白条天牛幼虫，被感染虫体身体逐渐变红且仅肠道异常，15d 的校正累计死亡率为 100%。从自然罹病死亡的云斑白条天牛幼虫肠道内筛选的菌株 BS1 为粘质沙雷氏菌，具有杀虫活性。该研究结果为云斑白条天牛的生物防治提供了依据。关键词：云斑白条天牛；粘质沙雷氏菌；毒力测定；杀虫活性中图分类号：S763文献标志码：A文章编号：20951914(2023)05017706IsolationandIdentificationofBacteriafromBatocera lineolataandDeterminationofItsInsecticidalBioactivityPangMeiling,LiBeina,LinYebang,YangZhende(CollegeofForestry,GuangxiUniversity,NanningGuangxi530004,China)Abstract:Aredpigment-producingstrain(BS1)intheintestinaltractofBatocera lineolata,whichdiedfromnaturaldiseases,wasclassifiedandidentifiedbytraditionalmicrobialidentificationmethodandmoleculartechno-logy;thevirulenceofthestrainBS1suspensiontothe5-d-oldlarvaeof B.lineolatawasdeterminedbyfeedingmethod.ThefindingsrevealedthatthestrainBS1wasidentifiedas Serratia marcescens.Onthebasisofbasalmedium,thetypeandamountofotheringredientaresucrose1%,yeastpowder6%andNaCl1%.Thebestinvitrocultureconditionsare35,pH7,240rpm,andtheculturetimeis16hoursunderthemediumdefined.Thefreshbarkofanironwalnuttreewhichwastreatedwith1.171011cfu/mLBS1suspensionwasfedtothelar-vaeofB.lineolata,theinfectedbodyofB.lineolatagraduallyturnedredandonlytheintestinaltractwasabnor-mal.Finally,thecorrectedcumulativemortalityratewas100%after15days.ThestrainBS1intheintestinaltractofB.lineolatalarvaewhichdiedfromnaturaldiseaseswasidentifiedasS.marcescens,andthestrainswithinsecticidalactivitytoitslarvae.TheresultssuggestthatS.marcescensBS1whichprovideabasisforbiologicalcontrolofB.lineolata.Key words:Batocera lineolata；Serratia marcescens；irulencedetermination；insecticidalactivity收稿日期:20220622；修回日期:20221024基金项目:广西自然科学基金面上项目（2017GXNSFAA198142）资助。第 1 作者:庞美玲（1997），女，硕士研究生。研究方向：森林保护学。Email:。通信作者:杨振德（1966），男，博士，教授。研究方向：植物生理生态、昆虫生态、昆虫与植物相互关系。Email:。第43卷第5期西南林业大学学报Vol.43No.52023年9月JOURNALOFSOUTHWESTFORESTRYUNIVERSITYSep.2023云斑白条天牛（Batocera lineolata）又名云斑天牛，隶属于鞘翅目天牛科白条天牛属，是我国主要林业蛀干害虫之一1。据报道，该虫幼虫、成虫均严重破坏树干，导致受害树木材质、产量下降，且长势衰弱乃至整株死亡13。云斑白条天牛防治主要依靠化学防治1，但由于该虫危害期长，加之长期使用化学农药使其产生一定抗药性，因此给该虫防治带来了巨大的困难15。为减少因化学农药导致该虫产生的“3R”问题，利用适宜的生物制剂防治该害虫十分必要，其中，微生物杀虫剂在世界范围内受到广泛重视67。目前，广泛利用苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringi-ensis）8、白僵菌（Beauveriaspp.）9对云斑天牛进行生物防治。粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）对昆虫具有高致病性1012，已从小菜蛾（Plutellaxylos-tella）10、黄曲条跳甲（Phyllotreta striolat）13、马铃薯块茎蛾（Phthorimaea operculella）14、地中海粉斑螟（Anagasta kuehniella）15等重要害虫中分离到较高致病性的粘质沙雷氏菌菌株。但从自然罹病死亡的云斑白条天牛体内直接分离到粘质沙雷氏菌在国内外未见报道。本研究报道一株使云斑白条天牛幼虫罹病死亡的粘质沙雷氏菌BS1，为该菌株用于控制云斑白条天牛种群数量的生防制剂开发与应用提供参考。1 材料与方法 1.1 病虫体采集2021 年 6 月从广西河池市巴马县核桃种植基地，采集自然罹病死亡的云斑白条天牛幼虫虫体，经 70%的乙醇溶液进行表面消毒后，放进 4冰箱保存。1.2 病原菌的分离和纯化1.2.1病原菌的分离和纯化参照涂艳等16对自然罹病死亡云斑白条天牛幼虫肠道微生物进行分离、纯化，同时根据菌落颜色，挑取红色单菌落，并将红色单菌落多次划线分离法得到菌株 BS1。1.2.2柯赫氏法则检验病原菌参照苏造堂等14利用柯赫氏法则检验病原菌，并挑取受感染死亡的云斑白条天牛幼虫，按1.2.1 法再次获得致病菌株 BS1 并保存。1.3 病原菌的鉴定1.3.1形态、生理生化特性鉴定观察并记录该菌培养性状，并结合细菌分类学17初步鉴定菌株，同时参照郭晓农等18、邹碧珍等19及傅仁杰等20对菌株 BS1 进行反应特性鉴定。1.3.2分子鉴定参照邢力等21以 16SrDNA 扩增子测序方法进行菌株的分子鉴定，并使用 MEGA5.1 构建系统发育树。1.4 培养条件筛选1.4.1波长、标准曲线测定参照邹积宏等22利用比浊法确定菌株 BS1适宜检测波长，同时利用稀释涂布平板法23得出该菌株菌悬液中活菌浓度，并倍比稀释成不同活菌浓度的菌悬液，并测定各浓度于最适波长下的OD 值，绘制活菌浓度与 OD 值的标准曲线图。1.4.2培养基筛选以 K2HPO41%、K2HPO43H2O1%、柠檬酸三钠 0.5%、pH=77.2 为基础培养基；选择葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、纤维素作为备选碳源；选择蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硫酸铵作为备选氮源。参照文献 2426 确定最适碳、氮源种类；选定碳、氮源后，在培养基中分别添加不同浓度最适碳源（0.5%、1%、2%、3%、4%）、最适氮源（0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%）后培养 16h，筛选碳、氮源的最适浓度。同时在仅含最适浓度碳源及氮源的基础培养基（pH=77.2）中分别添加不同浓度 NaCl（0.5%、1%、2%、3%、4%）后培养 16h，筛选 NaCl 的最适浓度。1.4.3体外培养条件测定参照文献 2426 利用单因素试验法，在最适培养基（1.4.2 确定）基础上设定不同的培养温度（20、25、30、35、40、45、50、55）、初始 pH 值（5、6、7、8、9）及摇床转速（80、120、160、200、240、280、320rpm），分别测定培养 16h 后菌液 OD550值，同时于不同的培养时间（2、4、6、8、10、12、16、24h）下分别测定菌液 OD550值，从而分析菌株 BS1 最适体外培养条件。1.5 对云斑白条天牛幼虫的杀虫活性测定1.5.1供试菌株采用本研究 1.2 分离培养的粘质沙雷氏菌菌株 BS1。1.5.2供试虫体云斑白条天牛幼虫来源于广西河池市巴马县核桃种植基地，参照苏造堂等14选取健康 5 龄幼178西 南 林 业 大 学 学 报第43卷虫作为试验虫源。1.5.3毒力测定将已活化菌株 BS1 接种于装有 100mLLB液体培养基的锥形瓶内，置于最适体外培养条件下（于 1.4.2 确定）培养 16h，同时按 1.4.2 法测定该菌悬液中活菌浓度，并倍比稀释成不同活菌浓度的菌悬液。参照苏造堂等14将新鲜铁核桃树树皮以不同活菌浓度的菌悬液进行处理，另将无菌水处理后的树皮设置为空白对照（CK），并用处理后树皮分别饲养 5 龄云斑白条天牛幼虫，同时定时记录幼虫死亡数量。1.6 数据分析采用 Excel 软件进行线性回归分析，并利用SPSS26.0 分析系统（选用 LSD 法）进行处理间的差异显著性分析。2 结果与分析 2.1 病原菌 BS1 的鉴定2.1.1形态、生理生化特性鉴定从罹病云斑白条天牛幼虫（图 1a）上分离到一株细菌，编号为 BS1。在 LB 培养基平板上（28）培养 24h 后出现红色菌落，表现为椭圆形、中央隆起、不透明、边缘整齐光滑（图 1b），且经革兰氏染色呈红色（图 1c），判定为革兰氏阴性菌。同时对该菌株进行反应特性鉴定，结果表明，菌株 BS1 能产生过氧化氢酶、能还原硝酸盐、能利用柠檬酸盐、属糖发酵型、不能分解葡萄糖、不能产气。d100100100981000.010abcSerratia marcescens(MG574821.1)Serratia sp.(MK695716.1)Serratia marcescens(KC335216.1)Scrratia marcescens(KY859808.1)Serratia marcescens(MK241850.1)BS1Serratia marcescens(AY498856.1)Klebsiella oxytoca(KF254665.1)Pseudomonas aeruginosa(MH378332.1)Streptomyces griseoaurantiacus(MG996870.1)Zimmermannella faecalis(AB012591.1)Flavobacterium degerlachei(AJ441005.1)a.罹病的云斑白条天牛幼虫；b.菌落形态；c.革兰氏染色；d.发育进化树。图 1 可培养致病菌典型菌落形态、革兰氏染色及系统发育树分析Fig.1Typicalcolonymorphology,gramstainofculturablepathogenicbacteriaandphylogenetictree2.1.216SrDNA 序列测定菌株 BS1 的 16SrDNA 序列长度为 1410bp（登录号为 SUB12017108BS1OP380452），并将该序列输入 GenBank 数据库中进行比对，同时利用 MEGA5.1（NJ 法）绘制系统发育树（图 1d），发现菌株 BS1 与粘质沙雷氏菌（登录号为 MK241850.1）的同源性高达 95%。结合该菌的形态特征、培养特性及生理生化特性，可以确定该菌为粘质沙雷氏菌。2.2 培养条件筛选2.2.1波长及标准曲线测定结果利用比浊法得到该菌最佳检测波长为 550nm，活菌浓度与OD 值的回归方程为y=0.4798x+0.0444，决定系数为 0.9991，表明该曲线拟合程度较好，第5期庞美玲等：云斑白条天牛幼虫肠道致病菌的分离鉴定及杀虫活性研究179可信度较高。2.2.2培养基筛选由图 2a 可知，碳、氮源不同，BS1 活菌浓度也会不同，其中蔗糖为碳源、酵母粉为氮源时最佳；BS1 活菌浓度随着蔗糖、酵母粉及 NaCl浓度升高，表现为先增加后减少，当蔗糖、酵母粉、NaCl 浓度分别为 1%、6%、1%时，BS1 活菌浓度最大（图 2bd）。因此在基础培养基上，其余成分种类及添加量为蔗糖 1%、酵母粉6%及 NaCl1%时最适。babcdeeff0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0feddcbabd0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0cabcddeeff0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0gfcabdeh4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.011.0ffedcbab00.20.40.60.81.01.21.41.62.0 4.0 6.0 8.0 10.012.016.024.0abccabcd00.20.40.60.81.0蔗糖酵母粉葡萄糖硫酸铵淀粉牛肉膏乳糖蛋白胨培养基碳、氮源种类碳源种类氮源种类活菌浓度/(1013 cfumL1)00.20.40.60.81.0活菌浓度/(1013 cfumL1)00.20.40.60.81.0活菌浓度/(1013 cfumL1)00.20.40.60.81.0活菌浓度/(1013 cfumL1)活菌浓度/(1013 cfumL1)00.20.40.60.81.0活菌浓度/(1013 cfumL1)00.20.40.60.81.0活菌浓度/(1013 cfumL1)00.20.40.60.81.0活菌浓度/(1013 cfumL1)培养基蔗糖浓度/%培养基酵母粉浓度/%培养基 NaCl 浓度/%菌悬液初始 pHedcabfgg2025303540455055培养温度/gecbadfh80 120 160 200 240 280 320 360摇床转速/rpm培养时间/ha.不同碳、氮源对菌株 BS1生长影响b.蔗糖浓度对菌株 BS1 生长影响c.酵母粉浓度对菌株 BS1 生长影响f.培养温度对菌株 BS1 生长影响e.初始 pH 对菌株 BS1 生长影响d.NaCl 浓度对菌株 BS1 生长影响h.培养时间对菌株 BS1 生长影响g.摇床转速对菌株 BS1 生长影响不同小写字母表示差异显著（P0.05）。图 2 培养条件筛选Fig.2Filtrationofcultureconditions2.2.3体外培养条件由图 2 可知，BS1 活菌密度随初始 pH 值、培养温度、摇床转速及培养时间的增加，表现为先增后减（图 2eh）。其中，当体外培养条件为 35、pH 为 7、摇床转速为 240rpm、培养时间为 16h 时活菌浓度达到最大值。2.3 粘质沙雷氏菌 BS1 菌悬液对云斑白条天牛幼虫的毒力2.3.1幼虫症状对照组云斑白条天牛幼虫通体呈乳白色（图3a），且肠道为黑色、表面无气泡、肠道外粘膜呈黄色（图 3b），而试验组云斑白条天牛幼虫在被菌株180西 南 林 业 大 学 学 报第43卷BS1 感染第 2 天后活动能力明显下降，同时虫体体色、肠道表征也发生显著变化。在感染前期（第 26 天），被感染虫体分泌褐色液体（图 3c），并伴随排泄异常（图 3d），且肠道内部出现大量气泡、略膨胀（图 3e）；在感染中期（第 610天），被感染虫体头部变红（图 3f），且不能正常蜕皮（图 3gi），脱皮后体表出现不规则黑褐色斑纹（图 3j）；此外，该虫肠道出现莲藕形异物（图3k）、黑色病变（图3l）及后肠溃烂（图3m），后导致虫肠道通体呈鲜红色（图 3n）；在感染后期（第1115 天），被感染虫体通体呈红色（图3o），但体壁内部呈淡黄色（图 3p），破坏虫肠道后流出暗红色脓液（图 3q），并伴有恶臭。afghopqjiklmnbcdea.正常虫体；b.正常虫肠道；c.感染前期虫体；d.排泄异常；e.感染前期虫肠道；f.感染中期虫体；gi.脱皮异常；j.不规则黑褐色斑纹；k.莲藕形异物；l.黑色病变；m.后肠溃烂；n.后肠溃烂；o.感染后期虫体；p.虫体体壁；q.暗红色脓液。图 3 云斑白条天牛幼虫感染菌株 BS1 后的体表、肠道染病特征Fig.3ThediseasecharacteristicsofB.lineolatalarvaesbodysurfaceandintestinaltractafterinfectedwithstrainBS12.3.2云斑白条天牛幼虫的死亡率动态采用本研究 1.5 获得活菌浓度分别为 1.17108、1.17109、1.171010、1.171011cfu/mL 菌株 BS1 菌悬液，并采用饲喂法接种 1.171081.171011cfu/mL 菌株 BS1 菌悬液于云斑白条天牛幼虫。由图 4 可知，菌株 BS1 对 5 龄云斑白条天牛幼虫的致死作用表现出明显的剂量与效应关系，其中接种第 5 天后的校正累计死亡率均极显著高于对照（P0.01）；接种第15 天时，1.171081.171011cfu/mL 的粘质沙雷氏菌处理后的云斑白条天牛幼虫的校正累计死亡率分别达到了 60%、80%、83.33%和 100%；此外，用菌株 BS1 菌悬液处理云斑白条天牛 5 龄幼虫 5、10d 的 LC50（寇氏法）分别为 1.631044、2.16104cfu/mL；用 1.171081.171011cfu/mL 菌株 BS1 菌悬液处理云斑白条天牛 5 龄幼虫 LT50分别为 4.77、6.85、8.17d 和 13.61d。0204060801001201 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16累计校正死亡率/%abcdck接种后时间/da.1.171011cfu/mL 试验组；b.1.171010cfu/mL 试验组；c.1.17109cfu/mL 试验组；d.1.17108cfu/mL 试验组；ck.对照组。图 4 云斑白条天牛幼虫取食粘质沙雷氏菌BS1 菌悬液后的校正累计死亡率Fig.4CorrectedcumulativemortalityrateofB.lineolatalarvaeafterfeedingS.marcescensBS1suspension 3 结论与讨论不同粘质沙雷氏菌对碳源、氮源偏好有所不同25,2728，其中，葡萄糖作为碳源25、蛋白胨作为氮源22,27较为常见。本研究从自然罹病死亡的云斑白条天牛幼虫上分离得到了 1 株能够产生红色色素菌株，采用传统微生物分类并结合分子技术鉴定该菌株为粘质沙雷氏菌（BS1），该菌株偏好利用蔗糖为碳源、酵母粉作为氮源进行增殖，与其他文献22,25,27所报道的粘质沙雷氏菌不同。其次，培养基筛选及优化，可促进菌体增殖，提高活菌浓度，同时温度、pH 是影响细菌生长的重要因素之一。一般情况下，粘质沙雷氏菌最适生长温度为 2830 及最适 pH 为 6728。而本实验中，菌株 BS1 最适温度为 35、pH=7，该菌株甚至在 40 时生命力仍旺盛，说明菌株 BS1 是一株耐高温较强的粘质沙雷氏菌。本研究发现该粘质沙雷氏菌 BS1 对云斑白条天牛 5 龄幼虫具有较强的致死率，其幼虫第15 天校正累计死亡率高达 100%，且该菌致病特点与粘质沙雷氏菌 PS113、ML114一致。然而，本研究中被感染虫体内部只肠道发生显著变化，虫肠道表面出现气泡及内部具有明显褐色病斑，究其原因可能是菌株 BS1 对云斑白条天牛第5期庞美玲等：云斑白条天牛幼虫肠道致病菌的分离鉴定及杀虫活性研究181幼虫肠道具有强烈破坏作用，导致其肠道无法摄取营养物质而死亡，但作用机理还需要进一步研究。此外，美洲烟夜蛾（Heliothis virescens）感染粘质沙雷氏菌后，不仅能通过卵幼虫蛹成虫进行垂直传播，还能通过个体间的相互感染而进行水平传播，从而使美洲烟夜蛾种群整个世代的迅速死亡29。本研究只测定了粘质沙雷氏菌BS1 对云斑白条天牛幼虫的致病作用，而对于该菌是否会感染云斑白条天牛成虫，是否会通过云斑白条天牛卵幼虫蛹成虫进行垂直传播或通过个体间的相互感染而进行水平传播，还需进一步研究。云斑白条天牛为高度危险性林业有害生物30，但到目前为止，在生产上未见有利用昆虫病原微生物防治云斑白条天牛的报道。粘质沙雷氏菌BS1 菌株易于培养，且具有显著杀虫活性，在云斑白条天牛的生物防治方面具有一定的应用前景。参 考 文 献 刘凤华,王新亮,刘涛,等.云斑天牛的危害及防治技术J.安徽农业科学,2014,42(23):78147816.1胡长林.核桃云斑天牛防治技术J.河北果树,2010(2):5152.2夏举飞,刘仪君,杨松,等.云斑白条天牛防治研究现状及对策J.安徽农业科学,2015,43(20):154155.3付甫永.核桃云斑天牛综合防治技术J.农村百事通,2017(16):3132.4李贝娜,杨振德,林叶邦,等.自然罹病死亡云斑白条天牛幼虫体内微生物的分离鉴定J.湖北农业科学,2022,61(7):6976.5石雷,赵耘,张忠和,等.复合微生物杀虫剂大面积防治松毛虫的效果J.林业科学研究,2004,17(4):461464.6薛欢,孙海英,陈雷,等.微生物杀虫剂防治农林害虫研究现状及应用效果J.江苏林业科技,2013,40(2):4346.7黄运霞,黄荣瑞,李焜华.坚强芽孢杆菌对黄条跳甲的毒效初步试验J.生物防治通报,1992,8(4):182.8邝灼彬,吕利华,冯夏,等.球孢白僵菌对四种十字花科蔬菜害虫的兼控潜力评价J.昆虫知识,2005,42(6):673676.9JeongHU,MunHY,OhHK,etal.Evaluationofin-secticidal activity of a bacterial strain,Serratia sp.EML-SE1 against diamondback mothJ.Journal 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