玉屏风散通过STAT3改善肝细胞肝癌免疫抑制微环境中NK细胞活性的机制研究.pdf

*基金项目苏州市科技发展计划(民生科技)项目(SYS2020188,SS202083)袁江苏省卫生健康委医学科项目(M2020004)袁苏州市科技发展计划(医疗卫生创新)项目(SKJY2021132)*作者简介袁琴袁女袁汉族袁生于 1986 年 3 月袁江西省新余市人袁硕士袁研究方向院肿瘤免疫遥*通信作者张露蓉袁电话院0512-67872504袁E-mail:南 通 大 学 学 报 渊 医 学 版 冤Journal of Nantong University(Medical Sciences)2023 颐 43渊3冤DOI:10.16424/32-1807/r.2023.03.003引文格式院 袁琴,姚霏,刘敏,等.玉屏风散通过 STAT3 改善肝细胞肝癌免疫抑制微环境中 NK 细胞活性的机制研究J.南通大学学报(医学版),2023,43(3)颐211-215.玉屏风散通过 STAT3 改善肝细胞肝癌免疫抑制微环境中NK 细胞活性的机制研究*袁琴1*袁姚霏1袁刘敏2袁张露蓉1*(江苏省苏州市中医医院1吴门医派研究院袁2肿瘤科袁苏州 215009)摘要目的院阐明玉屏风散在发挥抗肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)效应作用中对自然杀伤细胞(natural killer cell,NK 细胞)活性的影响及其机制遥 方法院采用 Hepa1-6 HCC 小鼠模型袁造模后 5 d袁用玉屏风散药液(20尧30尧40 g 生药/kg)进行灌胃给药袁2 周后处死小鼠遥瘤体质量称重用于抑瘤率的计算曰Western Blot 检测肿瘤组织中信号转导和转录激活因子 3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)/p-STAT3尧程序性死亡因子 1 的配体(ligandsfor programmed death factor 1,PD-L1)的蛋白表达情况曰ELISA 法检测肿瘤组织中吲哚胺 2,3-二氧化酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)尧TGF-茁 的表达情况曰从癌旁组织中分选出 NK 细胞袁流式细胞术和 ELISA 法检测 NK 细胞活性相关因子颗粒酶尧穿孔素(Granzyme,Perforin)尧IFN-酌 的表达情况遥 结果院与模型组相比袁不同剂量的玉屏风散(20尧30尧40 g 生药/kg)均显著抑制 HCC 小鼠肿瘤的生长(均 P0.05)袁且呈剂量依赖型袁其抑瘤率分别为 21.48%尧36.12%尧49.56%曰与模型组比袁玉屏风散(20尧30尧40 g 生药/kg)可抑制肿瘤组织中 STAT3/p-STAT3尧PD-L1 的蛋白表达袁以及 IDO尧TGF-茁 的分泌曰且对癌旁组织中 NK 细胞活性相关因子 Granzyme尧Perforin尧IFN-酌 的表达有明显促进作用遥 结论院玉屏风散是通过抑制STAT3 的活化来改善 HCC 免疫微环境中 NK 细胞的免疫活性袁从而抑制 HCC 的发生发展遥关键词肝细胞肝癌曰玉屏风散曰自然杀伤细胞曰信号转导和转录激活因子 3曰小鼠中图分类号R735.7文献标志码A文章编号1674-7887渊2023冤03-0211-05Study of the mechanism of improving NK cell activity in the immunosuppressive microenvironmentof hepatocellular carcinoma by Yupingfeng powder through STAT3*YUAN Qin1*,YAO Fei1,LIU Min2,ZHANG Lurong1*(1Suzhou Academy of Wumen Chinese Medicine,2Department ofOncology,Suzhou Hosptial of Traditional Chinese Medicine,Jiangsu Province,Suzhou 215009)AbstractObjective:To clarify the effect and mechanism of Yupingfeng Powder on natural killer cell(NK cell)activity inexerting its anti hepatocellular carcinoma(HCC)effect.Methods:Hepa1-6 in situ HCC mouse model was used.Five days aftermodeling,Yupingfeng powder solution(20,30,40 g crude drug/kg)was administered by gavage,and the mice were killed aftertwo weeks.Weigh the tumor mass for the calculation of tumor inhibition rate.Western Blot was used to detect the proteinexpression of signal transducer and activator of transcription 3(STAT3)/p-STAT3 and ligands for programmed death factor 1(PD-L1)in tumor tissue;ELISA method for detecting indoleamine 2,3-dioxygenase(IDO)and TGF-茁 in tumor tissue.NKcells were selected from the adjacent tissues,the NK cell activity related factors granzyme,perforin and IFN were detected byflow cytometry and the secretion of IFN-酌 was detected by ELISA.Results:Compared with the model group,differentconcentrations of Yupingfeng powder(20,30,40 g crude drug/kg)significantly inhibited the growth of tumors in HCC mice ina dose-dependent manner(P0.05),with tumor inhibition rates of 21.48%,36.12%,and 49.56%,respectively.Compared with themodel group,Yupingfeng powder(20,30,40 g crude drug/kg)can inhibit the protein expression of STAT3/p-STAT3,PD-L1,as well as the secretion of IDO and TGF-茁 in tumor tissue.And for the expression of NK cell activity related factorsGranzyme,Perforin,and IFN-酌 in adjacent cancer tissues has a significant promoting effect.Conclusion:Yupingfeng Powdercan improve the immune activity of NK cells in the microenvironment of HCC by inhibiting the activation of signaltransduction factor STAT3,thereby inhibiting the occurrence and development of HCC.Key wordshepatocellular carcinoma;Yupingfeng powder;natural killer cell;signal transducer and activator oftranscription 3;mouse211窑窑南 通 大 学 学 报(医 学 版)2023 颐 43渊3冤以肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)为主的原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率第 5 位、死因第 3 位1。肿瘤微环境异常是导致 HCC 产生免疫逃逸、易转移复发的重要因素2。自然杀伤细胞(natural killer cell,NK 细胞)作为一种独特的淋巴细胞，具有杀伤肿瘤细胞的能力，在机体固有免疫及过继免疫治疗中发挥着重要作用3。研究4显示，裸鼠肝原位移植瘤模型中外周血、肝脏、脾脏中NK 细胞毒性及其活化性受体表达随着肿瘤的生长而逐渐降低，其中肝脏中的变化最为显著；HCC 模型小鼠瘤体内注射 IL-12 能上调肿瘤组织内 NK 细胞的活化性受体、IL-12 及 IFN-酌，下调抑制性受体，从而抑制小鼠肿瘤的生长。因此，HCC 微环境中 NK 细胞的免疫活性处于抑制状态，提高 NK 细胞活性可改善 HCC 免疫微环境，是抗HCC 研究的重要方向。近年来，以中药干预肿瘤放、化疗的临床及实验研究倍受瞩目，抗肿瘤同时兼顾调节自身免疫细胞活性，有利于增强疗效。以现代手段也验证了中药可以调节免疫细胞和肿瘤微环境，增强机体免疫细胞抗肿瘤效应5-6。玉屏风散是中医扶正固表的名方，出自元 朱丹溪的 丹溪心法，由黄芪、白术、防风三味药材组方而成，其中君药黄芪和臣药白术以扶正为主，而佐使药防风则以祛邪为主，正是“扶正固本，标本兼治”的巧妙结合。大量研究7-8表明信号转导和转录激活因子 3(signal transducer and activator of tran原scription 3,STAT3)在人 HCC 组织中持续性高表达，与 HCC 的发生、发展关系密切；程序性死亡因子 1的配体(ligands for programmed death factor 1,PD-L1)是近年来备受关注的免疫抑制通路，研究9发现 STAT3的激活会增加肿瘤细胞表面 PD-L1 的表达。本课题组前期研究10显示玉屏风散能明显提高 Hepa1-6 原位植入 HCC 小鼠肿瘤及癌旁组织中 NK 细胞的比率；通过抑制 STAT3 的活化，调控 HCC 微环境的免疫状态，抑制微血管的形成从而发挥抗 HCC 的效应，但玉屏风散对 NK 细胞活性的影响及调控机制尚缺乏研究。因此，本文围绕玉屏风散通过调控STAT3 的活性，改善 HCC 免疫抑制微环境中 NK 细胞的活性，从而发挥抗 HCC 的机制展开研究，为玉屏风散应用于临床治疗 HCC 提供一定的实验基础。1材料与方法1.1药物与试剂玉屏风散：由黄芪、白术、防风组成，其中防风购于苏州市天灵中药饮片有限公司(批号：101115-1)；黄芪、白术购于苏州市春晖堂药业有限公司(批号均：100601)。PD-L1(货号：14-5982-82，eBioscience，Cambridge，英国)；山羊抗兔免疫球蛋白二抗(货号：ab205718，Abcam，Cambridge，英国)；兔特异性HRP辣根过氧化酶(货号：D110117，SangonBiotechCo.，Ltd.，上海，中国)；STAT3、p-STAT3 抗体(货号：9959、9914，Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA，美国)。1.2实验动物SPF 级近交 C57BL/6 纯系小鼠，雄性，体质量 1822 g，40 只，购自苏州爱尔麦特科技有限公司实验动物中心，动物许可证号：SCXK(苏)2018-0006。小鼠肝癌细胞株 Hepal-6 购于上海中科院细胞生物所(货号：SCSP-512)，用于 HCC 小鼠模型的制备。实验方案获苏州中医医院动物实验伦理委员会批准(批号：2020 伦动批 038)。1.3实验仪器仪器微量移液器，美国 Eppendorf公司；Leica DMIL 倒置显微镜，德国徕卡仪器有限公司；贺利氏二氧化碳培养箱，美国科峻仪器公司；Z320K 低温高速离心机，德国 HERMLE 公司；流式细胞仪，美国 BD 公司；普通天平，美国双杰有限公司；SHZ-22 水浴恒温振荡器，上海离心机械研究所；超低温冰箱，日本 SANYO 公司；电子天平(千分之一)，瑞士梅特勒-托利多公司。1.4玉屏风散冻干粉的制备与质量控制参照 丹溪心法 中玉屏风散的处方用量及配比，取适量药材，煎煮药材得玉屏风散水煎液，减压回流浓缩至浸膏，冷冻干燥，得到玉屏风散提取物。质量控制：应用HPLC 方法，检测升麻素苷、毛蕊异黄酮苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、补骨脂素、毛蕊异黄酮、亥茅酚苷、芒柄花黄素、苍术酮 9 个成分含量，作为玉屏风散冻干粉的质控标准。1.5移植性 HCC 荷瘤小鼠的造模和给药C57BL/6小鼠腹腔麻醉后，解剖暴露小鼠腹腔，在最接近体表的肝叶种植 Hepa1-6 小鼠 HCC 细胞后，缝合腹腔。在接种后第 5 天和第 10 天用高频超声观察肝脏接种部位有无异常回声区，记录异常肿块的回声类型、形态和大小等，判断有无造模成功。采用分层随机分组：模型组和玉屏风散低、中、高剂量组(分别合生药量20、30、40 g 生药/kg)，每组 10 只小鼠。从分组当天开始给药，模型组每天给予生理盐水 1 次，玉屏风散组每天给予 员 次药物。末次给药后，小鼠禁食 12 h，然后腹膜内注射 50 mg/kg 戊巴比妥钠麻醉，并通过CO2暴露处死麻醉的小鼠，称质量并收集肿瘤组织。肿瘤抑制率=(模型组的平均肿瘤质量-玉屏风散组212窑窑的平均肿瘤质量)/模型组的平均肿瘤质量伊100%。1.6HCC 小鼠癌旁组织中 NK 细胞的分选与纯化取原位 HCC 小鼠(或予玉屏风散 14 d 的原位 HCC小鼠)，颈椎脱臼法处死，取出肝脏组织(包括肿瘤和癌旁组织)放于装有冰冷 PBS 的培养皿中，加适量PBS 用注射器尾磨碎，经 200 目筛网过滤，滤液转至50 mL 离心管中。500 r/min 4 益离心 1 min，转移上清至另一个 50 mL 离心管中，4 益离心后弃上清。加入 3 mL 40%Percoll 溶液重悬沉淀，然后轻轻加于2 mL 70%Percoll 溶液(15 mL 离心管中)，常温 1 260 g离心 30 min 后吸取中间云雾状的白膜层至 15 mL离心管中，PBS 洗 2 次，4 益离心，收集单个核细胞。将分离出的单个核细胞计数，根据细胞数量按比例用磁珠分选(magnetic-activated cell sorting,MACS)缓冲液重悬，并加入相应量的小鼠血清，每 107个细胞加 40 滋L MACS 缓冲液和 4 滋L 小鼠血清，混匀，于 4 益封闭 30 min，以阻断 Fc 受体。然后加入biotin-antibody cocktail 抗体量为 10 滋L/10苑个细胞，混匀，4 益标记 20 min，避光，用 MACS 缓冲液洗1 次，4 益离心。MACS 缓冲液重悬，每 107个细胞加70 滋L MACS 缓冲液，然后加入 biotin-antibody cock原tail，20 滋L/107个细胞，混匀，4 益标记 20 min，避光，用 MACS 缓冲液洗 1 次，4 益离心。MACS 缓冲液重悬，过 LS 柱子，收集流出液，离心即得到纯化的NK 细胞。1.7ELISA 法测定 HCC 组织中吲哚胺 2,3-二氧化酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)和 TGF-茁 的表达情况将模型组和玉屏风散组小鼠的 HCC 组织用 RIPA 缓冲液进行匀浆，4 益 2 000 g 离心5 min后，取上清液(100 滋L)，根据试剂盒说明书测定 IDO和 TGF-茁 的表达水平。使用软件作图画出标准曲线，根据样品计算出相应的含量。1.8Western Blot 分析HCC 组织标本用 RIPA 缓冲液处理，将等量的蛋白质(50 滋g)上样到 10%SDS-PAGE 上并转移到聚偏二氟乙烯膜上；5 益下用 5%脱脂奶粉封闭 2 h，孵育一抗(STAT3 1颐1 000,p-STAT31颐1 000,PD-L1 1颐1 000)，4 益过夜；洗涤膜并与 HRP结合的二抗在 25 益温育 2 h；将膜用 Tris-20 的 Tris缓冲盐水洗涤 4 次，并通过荧光可见成像系统 BIO-RAD 成像系统(BIO-RAD,Hercules,CA,USA)检测。使用 Image Pro Plus 4.5 软件(4.5,Media Cybernetics,Inc.,Bethesda,MD,USA)通过光密度测定法测试每个条带的强度，将定量标准化为 GAPDH 表达的可比较值。1.9流式细胞分析术将分选好的每组 NK 细胞分成 2 管，50 滋L/管，加入用 PBS 稀释好的抗体 50 滋L，设定不染管(阴性对照管)和同型对照 IgG PE 管(1.25 滋L/100 滋L)，混匀后置 4 益避光孵育30 min。用预冷 PBS 洗涤 2 次，以去除未结合抗体，300 滋L重悬浮细胞，流式细胞仪进行检测，收集 50 000 个细胞用于分析。1.10统计学方法所有实验至少重复 3 次，结果表示为x 軃 依s。通过 ANOVA 然后进行 Dunnett 多重比较后测试(GraphPad Prism 5 Software,San Diego,CA,USA)评估不同治疗组之间的差异，P约0.05 为差异具有统计学意义。2结果2.1玉屏风散对 Hepa1-6 HCC 荷瘤小鼠肿瘤生长的影响解剖小鼠，剥取瘤体，肿瘤表面光滑，边界清晰，毛细血管网丰富，不同剂量玉屏风散组小鼠的肿瘤质量呈下降趋势(图 1A)。与模型组比较，不同剂量玉屏风散组可明显抑制肿瘤的生长(P约0.05)，且肿瘤重量的下降趋势具有一定的剂量依赖性(图 1B)；玉屏风散(20、30、40 g 生药/kg)组的抑瘤率分别为 21.48%、36.12%、49.56%(图 1C)。证实玉屏风散可明显抑制Hepa1-6 HCC 荷瘤小鼠的肿瘤生长。2.2玉屏风散对 Hepa1-6 HCC 荷瘤小鼠肿瘤组织中 STAT3/p-STAT3尧PD-L1 蛋白表达的影响与模型组相比，不同剂量玉屏风散组可显著抑制 STAT3 和注：A，模型组和不同剂量玉屏风散组中解剖出来的肿瘤组织的情况；B，不同剂量玉屏风散对 Hepa1-6 HCC 小鼠瘤重的影响；C，不同剂量玉屏风散对 Hepa1-6 HCC 小鼠的抑瘤率。与模型组比较，*P约0.05，*P约0.01。图 1玉屏风散抑制 Hepa1-6 HCC 小鼠肿瘤的生长CAB模型组顺铂组玉屏风散(g 生药/kg)203040模型组顺铂组玉屏风散(g 生药/kg)20304032106040200玉屏风散(g生药/kg)203040*袁琴，等.玉屏风散通过 STAT3 改善肝细胞肝癌免疫抑制微环境中 NK 细胞活性的机制研究213窑窑南 通 大 学 学 报(医 学 版)2023 颐 43渊3冤p-STAT3 蛋白表达，并呈剂量依赖性降低(P约0.05)；同时 PD-L1 蛋白的表达呈相同的下降趋势(P约0.05，图 2)。提示玉屏风散可能通过调节 STAT3/p-STAT3、PD-L1 蛋白的表达发挥其抗 HCC 作用。2.3玉屏风散抑制 Hepa1-6 HCC 荷瘤小鼠肿瘤组织中 IDO 和 TGF-茁 的分泌与模型组相比，不同剂量玉屏风散组可显著抑制肿瘤组织中 IDO 和 TGF-茁的分泌，并呈剂量依赖性降低(P0.05，图 3AB)。提示玉屏风散可能通过调控 STAT3/PD-L1 信号通路抑制HCC 小鼠肿瘤组织中 IDO 和 TGF-茁 的分泌，从而发挥抗 HCC 的效应。2.4玉屏风散抑制 Hepa1-6 HCC 荷瘤小鼠癌旁组织中 NK 细胞活性相关因子表达的影响与模型组相比，不同剂量玉屏风散组可显著提高癌旁组织中 NK细 胞 分 泌 IFN-酌 的 水 平，同 时 可 增 加 表 达Granzyme、Perforin 的 NK 细胞比率，并呈剂量依赖性(P0.05，图 4)。提示玉屏风散可提高 HCC 微环境中 NK 细胞活性，改善 HCC 免疫抑制微环境，发挥抗 HCC 效应。3讨论现代药理学研究11显示扶正方药能改善 HCC患者的细胞免疫功能，在提高患者生存质量、延长生存期、控制病情发展等方面起到重要作用。玉屏风散是中医扶正固表的名方，长期应用于改善 HCC 的免疫微环境，具有独特的优势。NK 细胞无需特异性抗原刺激即可杀伤靶细胞，其活化受表面受体传递抑制性或激活性信号调控，在 HCC 患者体内，肿瘤局部微环境的 NK 细胞的活性和数量明显降低，增加瘤内NK 细胞活性可引起 HCC 细胞的凋亡12。改善肿瘤微环境免疫抑制状态对控制 HCC 发展具有十分重要的意义。肿瘤微环境中 STAT3 是 NK 细胞调控的关键因子，STAT3 的激活会直接或间接抑制 NK 细胞的活性。因此玉屏风散可能是通过抑制 HCC 微环境中STAT3 的表达增加 NK 细胞的活性，从而改善HCC 微环境，起到控制 HCC 发生发展的重要作用。STAT3 是作为 IL-6 信号传递中的急性期反应因子被发现的。随后研究7显示 STAT3 在人 HCC 组织中是持续性高表达的，与 HCC 的发生、发展关系注：A，不同剂量玉屏风散对 HCC 小鼠肿瘤组织中 STAT3、p-STAT3 及 PD-L1 蛋白表达的影响；B，量化图，以 GAPDH 的表达作为内参。与模型组比较，*P约0.05，*P约0.01。图 2玉屏风散对 Hepa1-6 HCC 荷瘤小鼠肿瘤组织中STAT3尧p-STAT3 及 PD-L1 蛋白表达的影响注：A，不同剂量玉屏风散对 HCC 小鼠肿瘤组织中 IDO 表达的影响；B，不同剂量玉屏风散对 HCC 小鼠肿瘤组织中 TGF-茁 表达的影响。与模型组比较，*P约0.05，*P约0.01。图 3玉屏风散对 Hepa1-6 HCC 荷瘤小鼠肿瘤组织中 IDO尧TGF-茁 表达的影响BABAB注：A，不同剂量玉屏风散对 HCC 小鼠癌旁组织中的 NK 细胞中 IFN-酌 表达的影响；B，不同剂量玉屏风散对表达 Granzyme、Perforin的NK细胞比率的影响。与模型组比较，*P约0.05，*P约0.01。图 4玉屏风散对 Hepa1-6 HCC 荷瘤小鼠癌旁组织中 NK 细胞活性相关因子 Granzyme尧Perforin尧IFN-酌 的表达玉屏风散(g 生药/kg)A模型组203040STAT3p-STAT3PD-L1GAPDH玉屏风散(g 生药/kg)模型组203040STAT3p-STAT3PD-L110 0008 0006 0004 0002 0000玉屏风散(g 生药/kg)模型组203040*2 0001 5001 0005000100806040200*玉屏风散(g 生药/kg)模型组203040玉屏风散(g 生药/kg)模型组203040PerforinGranzyme玉屏风散(g 生药/kg)模型组203040玉屏风散(g 生药/kg)模型组203040*2 0001 5001 00050001 0008006004002000214窑窑密切，并与 HCC 的临床分期和病理分级呈正相关。STAT3 基因敲除后的 NK 细胞，其细胞毒性增强；表面激活性受体等表达升高，颗粒酶、穿孔素蛋白水平表达也升高；对肿瘤细胞的杀伤性增强13。研究8显示 STAT3 激活可以促进肿瘤细胞表达一系列免疫抑制分子，降低 NK 细胞对肿瘤细胞杀伤作用的敏感性。另外，研究9发现 STAT3 激活会增加肿瘤细胞表面 PD-L1 的表达，通过与 NK 细胞表面 PD-1 的结合从而抑制 NK 细胞对肿瘤的杀伤作用，降低 NK细胞的免疫活性。本研究结果显示玉屏风散可以明显抑制 HCC 小鼠肿瘤组织中 STAT3/pSTAT3、PD-L1蛋白的表达。STAT3 的激活会促进肿瘤细胞分泌IDO，而 IDO 可以抑制 NK 细胞激活性受体的表达，抑制 NK 细胞释放 IFN-酌，并且诱导 NK 细胞凋亡14；STAT3 的激活同时还可促进肿瘤细胞分泌大量的TGF-茁，抑制 NK 细胞激活性受体 NKG2D 和 NKp30的表达，并抑制 NK 细胞 IFN-酌 和颗粒酶的释放，从而削弱 NK 细胞对肿瘤的杀伤作用，而抑制肿瘤细胞 STAT3 的表达可以减少 TGF-茁 的释放，增强 NK细胞对肿瘤的杀伤作用15。玉屏风散可显著抑制肿瘤组织中 IDO 和 TGF-茁 的分泌，提示玉屏风散可能通过调控 STAT3/PD-L1 信号通路抑制 HCC 小鼠肿瘤组织中 IDO 和 TGF-茁 的分泌。在 HCC 细胞中阻断 STAT3 通路可以增强 NK 细胞的细胞毒性，并使NK 细胞活化相关分子表达增加，显著抑制 HCC 细胞的生长，从而延长患癌小鼠的生命16。本研究结果也证实了玉屏风散通过抑制 HCC 微环境中 STAT3的表达，增加 NK 细胞的活性，从而改善 HCC 微环境，对控制 HCC 的发生发展起重要作用。综上，不同剂量的玉屏风散对 HCC 小鼠的肿瘤生长具有明显的抑制效应，主要是通过降低肿瘤组织中 STAT3/p-STAT3、PD-L1 蛋白的表达，抑制肿瘤组织中 IDO 和 TGF-茁 的分泌，从而改善肿瘤微环境中 NK 细胞的活性发挥抗 HCC 的效应。为阐明中医扶正方药在 HCC 免疫治疗中临床有效性的科学内涵提供研究思路，也为玉屏风散在肿瘤免疫治疗的临床应用和规范化用药提供实验基础。参考文献1中华人民共和国卫生和计划生育委员会办公厅.原发性肝癌诊疗规范(2017 年版)J.中国实用外科杂志,2017,37(7):705-720.2朱迎,钦伦秀.肝癌免疫生物治疗的现状及评价J.中国实用外科杂志,2016,36(6):636-640.3VOSKOBOINIK I,WHISSTOCK J C,TRAPANI J A.Per鄄forin and granzymes:function,dysfunction and humanpathologyJ.Nat Rev Immunol,2015,15(6):388-400.4江金华,周智锋,李洁羽,等.原发性肝癌和癌旁组织中NK 细胞受体表达及意义J.细胞与分子免疫学杂志,2012,28(5):529-532.5MENG M B,WEN Q L,CUI Y L,et al.Meta-analysis:traditionalChinesemedicineforimprovingimmuneresponse in patients with unresectable hepatocellular car鄄cinoma after transcatheter arterial chemoembolization J.Explore,2011,7(1):37-43.6王长青,雷久士.中医药治疗原发性肝癌的研究进展J.中医药导报,2010,16(1):80-83.7李静,朴云峰,蒋政,等.STAT3 基因在人肝癌细胞株HepG2尧Bel7402尧SMMC7721 和肝癌组织中的表达及意义J.吉林大学学报(医学版),2010,36(3):531-535,609.8GOTTHARDT D,PUTZ E M,STRAKA E,et al.Loss ofSTAT3 in murine NK cells enhances NK cell-dependenttumor surveillanceJ.Blood,2014,124(15):2370-2379.9MARZEC M,ZHANG Q,GORADIA A,et al.Oncogenickinase NPM/ALK induces through STAT3 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