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59 食用菌学报 2023.30（4）：2023.04.元蘑多糖分离纯化和结构表征及体外降血糖活性石 越，张玲赫，努尔买买提*，李文文（伊犁师范大学微生物资源保护与开发利用重点实验室，伊犁师范大学生物与地理科学学院，新疆 伊宁 835000）摘 要：采用水提醇沉法提取元蘑（Hohenbuehelia serotina）粗多糖，计算其提取率、测定其总糖和蛋白含量。用葡聚糖凝胶柱层析法分离纯化得到均一多糖（HSP），采用高效液相色谱法分析 HSP 的相对分子质量，离子色谱法分析 HSP 单糖组成，傅里叶红外光谱法分析 HSP 的官能团，并测定其降血糖活性。结果表明：元蘑粗多糖提取率为（11.83 0.08）%，总糖含量为（38.27 0.66）%，蛋白含量为（1.84 0.02）%。HSP 的总糖含量为（87.69 1.34）%，蛋白含量为（0.97 0.11）%，相对分子质量为 7.78106。HSP 是一种杂多糖，其单糖由葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸组成，摩尔比为34.99:5.68:4.85:2.31:1.19:1:0.16:0.13。HSP 中存在糖醛酸、吡喃糖环的官能团。此外，3.0 mgmL-1的 HSP 对-淀粉酶、-葡萄糖苷酶的抑制率分别为 60.45%、55.33%，表明 HSP 具有较强的体外降血糖活性。关键词：多糖提取；高效液相色谱法；离子色谱法；红外光谱法；降血糖Isolation,Purification,Structural Characterization and In Vitro Hypoglycemic Activity of Hohenbuehelia serotina PolysaccharideSHI Yue,ZHANG Linghe,NUER Maimaiti*,LI Wenwen(Key Laboratory of Microbial Resources Protection,Development and Utilization,College of Biological and Geographical Sciences,Yili Normal University,Yining 835000,Xinjiang,China)Abstract:Crude polysaccharide of Hohenbuehelia serotina was obtained by water extraction and alcohol precipitation,and then a polysaccharide fraction named HSP was purified from the crude polysaccharide extract by dextran gel column chromatography.The crude polysaccharide was determined for extraction rate,total sugar content and protein content.HSP was measured for its total sugar and protein contents,determined for relative molecular weight by HPLC,analyzed for monosaccharide composition by ion chromatography,and analyzed for functional groups by Fourier infrared spectroscopy.HSP was also studied for its hypoglycemic activity.The results showed that the extraction rate,total sugar content,and protein content of the crude polysaccharide were(11.830.08)%,(38.270.66)%,and(1.840.02)%,respectively.The total sugar and protein in HSP were(87.691.34)%and(0.970.11)%,respectively.The relative molecular weight of HSP was found to be 7.78106.HSP is a heteropolysaccharide,comprising glucose,galactose,xylose,arabinose,galacturonic acid,fucose,rhamnose,and glucuronic acid in the molar ratio of 34.99:5.68:4.85:2.31:1.19:1:0.16:0.13.There are uronic acid and pyranose ring functional groups in HSP.In addition,the inhibitory activities of 3.0 mgmL-1 收稿日期：2023-02-15 原稿；2023-04-10修改稿基金项目：伊犁师范大学微生物资源保护与开发利用重点实验室科研项目（YLUKLM2023004）作者简介：石 越(1998)，女，在读硕士，主要从事微生物生态研究。*本文通信作者 E-mail:5966007 60 第 30 卷食 用 菌 学 报HSP on-amylase and-glucosidase were 60.45%and 55.33%,respectively,indicating that HSP had good hypoglycemic activity in vitro.Key words:Polysaccharide extraction;high performance liquid chromatography;ion chromatography;infrared spectrometry;hypoglycemic元蘑（Hohenbuehelia serotina）又名冻蘑、黄蘑等1。元蘑菌盖直径912 cm；扁状半圆，与肾脏相似；具有一定黏度，有短绒毛，主要为黄绿色。元蘑主要生长于腐烂的阔叶树或桦树上，分布于黑龙江、吉林、河北、山西、陕西、四川、云南、西藏等地区。元蘑含有多种生物活性物质，如微量元素、多糖、氨基酸、黄酮类物质等，是我国东北地区著名野生食用菌之一2，具有抗肿瘤3、抗辐射4、预防衰老5等功效，具有较高的食用价值。食用菌多糖具有抗氧化6、抗肿瘤7、增强机体免疫力5等活性，随着现代科学技术不断发展，关于食用菌多糖生物活性的研究也更加深入。元蘑多糖是一类具有多种生物活性的大分子化合物8-11，但关于其降血糖的研究较少，笔者对元蘑多糖进行提取纯化，并对其纯化组分进行体外降血糖研究，以期为元蘑多糖的开发利用提供参考。1 材料与方法1.1 材料子实体干品购于吉林省白山市抚松县沿江乡白水滩村，经伊犁师范大学张相锋采用形态学和分子生物学鉴定为元蘑（H.serotina）；子实体干品保存于伊犁师范大学微生物资源保护与开发利用重点实验室。1.2 主要试剂和仪器对硝基苯基-D-吡喃半乳糖苷（p-nitrophenyl-D-galactopyranoside,pNPG），BCA蛋白浓度测定试剂盒，T500、T300、T100、T70、T10葡聚糖标准品（北京索莱宝科技有限公司）；Sephadex G-200葡聚糖凝胶，岩藻糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、D-甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、-淀粉酶、阿卡波糖、-葡萄糖苷酶的单糖标准品（上海源叶生物科技有限公司）；葡萄糖标准品、葡聚糖标准品（天津江天化工技术有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。FA2104N电子天平（浙江赛德仪器设备有限公司）；HH-S6数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司）；R-300EL旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司）；H1750R高速冷冻离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；UPR-15TNZ超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）；LC-10N-50A台式预冻真空冻干机（上海力辰仪器科技有限公司）；ZWY-2102C智能恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；透析袋（湖南启萌生物科技有限公司）；Synergy HTX多功能酶标仪（美国Bectone Dickinson公司）；SBS-100自动收集器（上海嘉鹏科技有限公司）；HWCL-5油浴锅（郑州长城科工贸有限公司）；1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；ICS-5000+离子色谱仪（美国Varian公司）；IS50傅里叶红外光谱仪（美国Thermo Nicolet Corporation公司）。1.3 元蘑粗多糖的总糖和蛋白含量测定采用水提醇沉法12提取元蘑粗多糖；采用苯酚-硫酸法13测定元蘑总糖含量；采用BCA法14测定元蘑多糖样品中蛋白含量。1.4 元蘑多糖分离纯化将元蘑粗多糖用 Sephadex G-200 进行分离纯化。用去离子水进行洗脱，样品质量浓度为20 mgmL-1，上样量为1 mL，流速为0.25 mLmin-1，每管收集2 mL。用苯酚-硫酸法13测定样品在490 nm处的吸光度值，以管数为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制洗脱曲线。收集合并洗脱液，冻 61 石 越，等：元蘑多糖分离纯化和结构表征及体外降血糖活性第 4 期干得到单一组分元蘑多糖，命名为HSP。1.5 元蘑多糖结构特征1.5.1 相对分子质量测定精确配制2 mL 1.0 mgmL-1 HSP样品，过0.22 m的水相滤膜，通过HPLC测定样品的相对分子质量及多糖含量。色谱柱为TSK-GEL G4000PWXL，流动相为超纯水，流速0.6 mLmin-1，进样量20 L，柱温30；检测器为示差检测器。以葡聚糖T500、T300、T100、T70、T10（相对分子质量分别为5105、3105、1105、7104和1104）为标准品，分别配制成质量浓度为1 mgmL-1的标准品溶液，以保留时间为横坐标，标准葡聚糖相对分子质量（Mw）的对数lgMw为纵坐标，绘制标准曲线，根据待测HSP在相同色谱条件下的保留时间，代入标准曲线，计算其相对分子质量15。1.5.2 单糖组成测定精确称取2 mg HSP，加入2 mL三氟乙酸（2 molL-1），用酒精灯封口后在120 油浴中水解3 h 使其完全水解，旋转蒸发除去三氟乙酸，再加入2 mL无水乙醇旋转蒸发，3次重复，除去残留的三氟乙酸，将产物完全溶于2 mL超纯水中制得样品溶液。以岩藻糖（fucose,Fuc）、鼠李糖（rhamnose,Rha）、阿拉伯糖（arabinose,Ara）、半乳糖（galactose,Gal）、葡萄糖（glucose,Glc）、木糖（xylose,Xyl）、半乳糖醛酸（galacturonic acid,GalA）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid,GlcA）8种单糖标准品为对照，配成50 mgL-1的标准品混合液，用0.22 m滤膜过滤后，用离子色谱法检测其单糖组成16。色谱条件：色谱柱为PA20，流动相A相为超纯水、B相为200 mmolL-1 NaOH，流速0.45 mLmin-1，进样量1 mL；柱温30。1.5.3 红外光谱检测取1.5 mg HSP与150 mg溴化钾粉末混合均匀，使用压片机进行压片，将压片在4004 000 cm-1条件下进行傅里叶变换红外光谱检测17。1.6 元蘑多糖降血糖活性1.6.1 对-淀粉酶的抑制活性采用DNS比色法18，以阿卡波糖为阳性对照，测定不同质量浓度HSP对-淀粉酶的抑制率。取不同质量浓度（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mgmL-1）HSP各1.2 mL，与等体积的-淀粉酶溶液（2 UmL-1）混匀，37 水浴5 min。再加入1.2 mL 1%淀粉溶液（37 水浴5 min）混匀，37 水浴15 min后加入2 mL DNS溶液终止反应，沸水浴5 min，显色后冰水浴15 min，稀释至原质量浓度的1/4，测定540 nm处的吸光度值，分别以PBS代替样品和-淀粉酶溶液做阴性对照和空白对照。1.6.2 对-葡萄糖苷酶的抑制活性采用PNPG法19，以阿卡波糖为阳性对照，测定不同质量浓度HSP对-葡萄糖苷酶的抑制率。取不同质量浓度（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mgmL-1）HSP各50 L，分别加入100 L-葡萄糖苷酶溶液（1 UmL-1），反应10 min；再加入100 L pNPG（5 mmolL-1），反应20 min；最后加入1 mL Na2CO3溶液（1 molL-1）终止反应，测定405 nm处吸光度值，分别以PBS代替样品和-葡萄糖苷酶溶液做阴性对照和空白对照。1.7 数据处理数据均以3次实验结果的平均值标准差表示。采用Origin2018、SPSS 22.0软件进行数据处理、分析。2 结果与分析2.1 元蘑粗多糖提取率元蘑粗多糖的提取率为（11.83 0.08）%。62 第 30 卷食 用 菌 学 报2.2 元蘑粗多糖及HSP的总糖和蛋白含量多糖标准曲线方程为y=6.662 1x+0.255，R2=0.992 5。元蘑粗多糖中总糖含量为（38.27 0.66）%，HSP的总糖含量为（87.69 1.34）%。蛋白标准曲线方程为y=1.857 9x+0.286 2，R2=0.991 9。元蘑粗多糖中蛋白含量为（1.84 0.02）%，HSP中蛋白含量为（0.97 0.11）%。2.3 元蘑多糖结构特征2.3.1 相对分子质量由图1可知，元蘑粗多糖主要由相对分子质量为9.12106、2.54106、3.72104的3个组分组成。经G-200葡聚糖凝胶柱层析分离纯化后，获得组分HSP，由图2可知，其HPLC图谱呈现一个对称的单峰，表明HSP为均一多糖，其相对分子质量为7.78106。图1 元蘑粗多糖高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatogram of H.serotina crude polysaccharide图2 HSP的高效液相色谱图Fig.2 High performance liquid chromatograpm of H.serotina polysaccharide fraction(HSP)63 石 越，等：元蘑多糖分离纯化和结构表征及体外降血糖活性第 4 期2.3.2 HSP单糖组成HSP是一种杂多糖，葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸的摩尔比为34.99:5.68:4.85:2.31:1.19:1:0.16:0.13，葡萄糖含量最高（图3）。注：18分别为岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸。Note:1-8 indicate fucose,rhamnose,arabinose,galactose,glucose,xylose,galacturonic acid,and glucuronic acid,respectively.图3 元蘑多糖离子色谱图Fig.3 Ion chromatogram of HSP 2.3.3 红外光谱分析结果在 3 392 cm-1处出现强而宽的吸收峰，可能是其分子中的氢键引起 O-H 伸缩振动；在2 910 cm-1 处出现的吸收峰，表明存在C-H的伸缩振动，且这两处吸收峰都是多糖的主要特征吸收峰20；在1 645 cm-1处出现强吸收峰，表明存在-COOH的 C=O不对称伸缩振动21；在1 420 cm-1处出现的弱吸收峰，表明可能存在-COOH的C-O伸缩振动22，说明其含有糖醛酸23。红外光谱检测结果与离子色谱分析一致，显示HSP中含有糖醛酸。在1 0001 200 cm-1 范围内出现吸收峰，表明存在吡喃糖环的C-O-C和C-O-H伸缩振动24（图4）。图4 元蘑多糖傅里叶变换红外光谱图Fig.4 Fourier transform infrared spectrum of HSP 64 第 30 卷食 用 菌 学 报2.4 降血糖活性2.4.1 对-淀粉酶的抑制活性在实验质量浓度范围内，随着质量浓度增加，HSP对-淀粉酶的抑制率呈上升趋势；在质量浓度为3.0 mgmL-1时，对-淀粉酶的抑制率高达60.45%（图5）。注：数据为平均值标准差（n=3），不同小写字母表示同一样品不同质量浓度比较差异显著（P0.05）。Notes:values are means SD(n=3),different lowercase letters indicate a significant difference between different mass concentrations of the same sample(P0.05).图5 元蘑多糖对-淀粉酶的抑制活性Fig.5 Inhibitory activity of HSP on-amylase2.4.2 对-葡萄糖苷酶的抑制活性在实验质量浓度范围内，随着质量浓度增加，HSP对-葡萄糖苷酶的抑制率呈上升趋势；在质量浓度为2.03.0 mgmL-1时，对-葡萄糖苷酶的抑制率差异不显著（图6）。注：同图5。Note:footnotes as in Fig.5.图6 元蘑多糖对-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.6 Inhibitory activity of HSP on-glucosidase 65 石 越，等：元蘑多糖分离纯化和结构表征及体外降血糖活性第 4 期3 讨论笔者研究表明元蘑多糖的单糖组成包括葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸，为大部分具有降血糖活性的多糖共有的单糖。隋玉等25采用水提醇沉法得到元蘑粗多糖的单糖组成为葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸，与笔者获得元蘑多糖的单糖组成有差异，原因尚需进一步研究。由于单糖组成能够影响多糖的一级结构与高级结构，且能够影响多糖的活性强弱26，多糖的单糖组成不同可能导致其生物活性不同。后续将对元蘑多糖的初级结构进行进一步探究或通过结构修饰研究其构效关系。多糖降血糖机制主要包括调节相关酶活性、调节肝脏糖代谢、调节肠道菌群及提高胰岛素的敏感性等27-29。人体肠道内存在多种酶，如-葡萄糖苷酶、淀粉酶和麦芽糖酶等；其中，-葡萄糖苷酶能够催化-（1，4）-糖苷键水解，使寡糖水解生成葡萄糖。因此，可以通过抑制-葡萄糖苷酶活性降低餐后血糖水平，从而达到预防糖尿病目的30。食用菌多糖可以通过调控糖代谢相关因子的表达和减轻氧化应激反应等多种途径达到降血糖目的31，笔者发现元蘑多糖具有抑制-葡萄糖苷酶、-淀粉酶的活性，其作用机制尚待进一步研究。参考文献1 杨立红,刘林德,姜华,等.野生元蘑多糖的分离鉴定及其清除氧自由基作用 J.食品科学,2007(11):81-85.2 刘姿彤,钱华,王延锋,等.元蘑富硒栽培试验初报 J.食药用菌,2022,30(6):424-427.3 郭松,李春连,钟春英,等.微波辅助元蘑子实体多糖提取工艺优化及抗氧化活性研究 J.食品科技,2023,48(4):190-198.4 滕星,谭笑,赵新颖,等.元蘑营养成分在排湿热风烘干模式下的变化特征 J.食品安全质量检测学报,2021,12(13):5396-5402.5 宋振康,张海悦,尹家乐,等.响应面法优化元蘑多糖提取工艺及抗疲劳活性的研究 J.食品科技,2020,45(6):254-260.6 肖阳,沈维治,杨琼,等.肉桂木栽培的食用菌多糖抗氧化与降血糖作用 J.中国农学通报,2022,38(20):132-137.7 郑金玲.铜色牛肝菌多糖的制备及其小鼠体内抗肿瘤活性的研究 D.昆明:昆明理工大学,2021.8 郭松,李春连,钟春英,等.微波辅助元蘑子实体多糖提取工艺优化及抗氧化活性研究 J.食品科技,2023,48(4):190-198.9 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