鱼类环境DNA保存条件的比较研究_刘洋.pdf

为探索环境水样中鱼类 DNA 的最佳保存方法和保存时间,选取饲养鱼的水样为研究对象,在无核酸污染的环境中,采用 0.45 m 孔径滤膜对相同体积的水样进行预处理,并对富集环境 DNA(eDNA)的滤膜进行不同保存方法和不同保存时间捕获的 eDNA 质量、鱼类 12S rRNA 基因文库浓度、基于 ASVs 方法的鱼类 12S rRNA 扩增子测序结果的比较研究。研究结果显示:-20 冷冻、-80 冷冻、无水乙醇-常温、75%乙醇-常温、Longmires 保存液-常温以及 TK 保存液-常温等6 种保存方法捕获的 eDNA 效果最好的是 TK 保存液-常温,其次为冷冻保存(-20、-80)。-20 冷冻、-80 冷冻和 TK 保存液-常温等 3 种保存方法在同一保存时间下具有良好的稳定性,且在保存时间 2周内的测试条件下,也能稳定保存滤膜,最大程度还原水样中鱼类的遗传信息。研究对 eDNA 样本最佳保存条件的探索,将为第三方基因检测实验室对鱼类 eDNA 保存策略提供技术基础,便于 eDNA 宏条形码技术的开展。关键词 eDNA;保存条件;DNA 提取;扩增子测序;ASVs 方法中图分类号 Q78;Q958.8文献标识码 AStudy on the environmental DNA preservation conditions of fishesLIU Yang1 YING Fang2 YANG Jun3 WANG Huanying1 HONG Wenjie1 WANG Tingzhang1 1.Zhejiang Tianke High-tech Development Co.Ltd.Key laboratory of Microbiol technology and Bioinformatics ofZhejiang Province Hangzhou 310012 China 2.Zhejiang Hangzhou Ecological and Environmental Monitoring Center Hangzhou 310012 China 3.Hangzhou West Lake Administration Hangzhou 310002 China Abstract The optimal preservation method and preservation time for DNA from the simulated water samples of reared fish was stud-ied.Water samples at the same volume were pretreated with 0.45 m filter membranes inanucleic acid-free environment.Comparison of the obtained quality of eDNA PCR concentrations of fish 12S rRNA gene and the amplicon sequencing results based on the availa-ble amplicon sequence variant method by combination of different preservation method and preservation time.The results showed that with six preservation methods which were-20 freezing -80 freezing ethyl alcohol at room temperature 75%ethanol at room temperature Longmire buffer at room temperature and TK buffer at room temperature the TK buffer at room temperature was the best eDNA captured methods followed by freezing -20 -80 .And the-20 -80 and TK buffer at room temperature have good stability under the same preservation time respectively and could stably preserve the filter membrane within two weeks to maxi-mize the genetic information of fish in water samples.It was providing technical reference for third-party gene detection laboratories for fish eDNA preservation strategies and facilitating the development of eDNA metabarcoding technology.Keywords environmental DNA preservation conditions DNA extraction amplicon sequencing available amplicon sequence variant method 鱼类是水域生态系统食物链的重要环节。对鱼类群落多样性的监测与研究,不仅反映水域生态系统的健康水平,还对正确开发、调控和管理渔业资源、固碳、应对气候变化和全球粮食安全等有重要意义1-3。环生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY 收稿日期:2023-03-24;最后修回日期:2023-04-19基金项目:国家重点研发计划项目(2022YFE0128600);杭州市农业与社会发展科研引导项目(20220919Y182)作者简介:刘洋,硕士,工程师,研究方向为环境微生物、环境 DNA 技术应用,E-mail:ly1587 通信作者:王庭璋,博士,副研究员,研究方向为环境微生物、生物信息学,E-mail:wtz8615 网络首发时间：2023-09-01 16:03:20网络首发地址：https:/ DNA(environmental DNA,eDNA)技术具有采样相对简单、对生态无损伤、无需捕获生物活体、无需依赖分类鉴定人员经验以及操作通量高、重复性好、结果准确等优点4-7。eDNA 技术被逐步应用于鱼类生物多样性监测和调查。eDNA 宏条形码技术通过环境样本中残留 DNA 片段检测物种6。高效捕获环境 DNA 是准确检测物种的前提。目前,eDNA 捕获步骤包括样本采集、保存和提取等8-9。国内外针对不同水域样本获取 eDNA 开展了相关研究。研究发现,滤膜法捕获的 eDNA 质量比沉淀法更高10;混合纤维素滤膜富集 eDNA 效果最佳11-13;液氮保存的滤膜获得的 DNA 质量最高9。尽管研究者们不断地优化 eDNA 捕获策略,但具体操作和参数尚无统一标准指导,不足以为样本保存提供全面参考。由于水样中的鱼类 eDNA 极易被分解9,14,过滤后及时有效地保存样品是 eDNA 技术测试的关键。滤膜常见的保存方法一般为乙醇保存和冷冻保存15,但研究者并未考虑长时间保存对 DNA 的影响9。为加快推进第三方基因检测实验室的 eDNA 技术在鱼类监测中的应用,探究 eDNA 的保存条件显得尤为重要。虽然已有相关研究表明,冷冻是 eDNA 保存的最佳保存方法,但在野外或运输途中,冷冻并非经济实惠的保存方式。本研究以鱼箱中的养鱼水为研究对象,结合 Ion Torrent 二代测序仪进行鱼类线粒体 12S rRNA 基因扩增子测序,探讨不同滤膜保存条件(保存方法和保存时间)下获取的 eDNA 质量和基于非聚类的 ASVs 方法分析的测序结果中定性监测到的鱼类种类与鱼缸中实际鱼类对比情况,提供适合 eDNA 的野外最优保存条件,为推进第三方基因检测实验室 eDNA 技术的应用提供技术支撑。1 材料与方法1.1 水样的采集水样采集于实验室的养鱼箱。塑料鱼箱(容积120 L),长 592 mm、宽 485 mm、高 360 mm。鱼箱提前经次氯酸浸泡并清洗,箱中注入的是纯净水。鱼购自杭州东山农贸市场,鲫、鲤、翘嘴鲌、花、条、鲢和黄颡鱼各一条。鱼在水箱中饲养 24 h,待水体中鱼类 eD-NA 有一定量的积累后移走鱼。采水样时,佩戴口罩和手套,提前消毒采样舀子。用舀子轻轻晃动混匀水体,分 3 次共采集表层水 200 mL 于无菌采样袋;并置 4 冰箱暂存,直至抽滤结束。水样选 0.45 m 孔径混合纤维滤膜,采用涡轮泵(浙江泰林 HTY-102)进行抽滤,结束后,用镊子将滤膜卷起放入 5.0 mL 的无菌试管中保存直至提取 eDNA。为避免交叉污染,抽滤装置的隔膜泵泵头提前经 121 高温灭菌,样本之间所用的滤杯和镊子均采用一次性无菌材质,且泵头上的钛片用火焰枪灼烧冷却后使用,同时用纯水作为阴性对照。1.2 方法1.2.1 eDNA 的提取选用凯杰 DNeasy PowerWater Kit,参照试剂盒说明书,根据实际情况适时调整,提取滤膜获得 eDNA。eDNA 采用 Nanodrop 2000 分光光度计和 Qubit R 2.0荧光计同时进行质检,并置于-20 保存备用。1.2.2 滤膜不同保存方法的比较对 6 种常用的滤膜保存方法(-20 冻存、-80 冻存、无水乙醇-常温保存、75%乙醇-常温保存、Long-mires 保存液-常温保存和 TK 保存液-常温保存),进行比较。将滤膜置于不同保存方法下 3 d 后提取DNA,且每组样本保存方法 3 个重复。抽滤后,滤膜不经保存直接提取 DNA 的 3 个平行样本作为对照组。1.2.3 滤膜保存方法稳定性的比较为比较适用的环境 DNA 保存方法的稳定性和重复性,分时段模拟养鱼水样,且鱼箱中的鱼均采用同样的物种。采集各次的模拟水样样本过滤,选择合适的保存方法,将滤膜置于不同保存方法下 3 d 后提取DNA,每组保存方法 3 个重复,并以滤膜不经保存直接提取 DNA 的 3 个平行样本作为对照组。1.2.4 滤膜不同保存时间的比较选择合适的滤膜保存方法,分别考察放置 3 d、一周和两周后提取的 DNA 及线粒体 12S rRNA 基因扩增子测序的结果,每组样本保存时间 3 个重复。抽滤后,滤膜不经保存直接提取DNA 的3 个平行样本作为对照组。1.2.5 通用引物设计针对淡水鱼的线粒体 12S rRNA 设计通用引物。收集整理 NCBI、MitoFish 等公共数据库和浙江省本土自建鱼类数据库中所有鱼类完整线粒体 12S 基因序列,通过 ClustalW 软件进行多序列比对,对保守区域采用 Primer Premier 5.0 设计引物,并以不同引物组进行鱼类 PCR 扩增模拟。从覆盖度、区分度、扩增片段长度等方面进行比较筛选,最终确定 1 对 PCR 扩增产物长度为 194221 bp 的 12S rRNA 基因通用扩增淡水鱼的 PCR 引物(TK_12S-F:TCGTGCCAGCHRCCGCGGT,TK_12S-R:ARTRGGGTMTCTAATCCYAG)。基于 Ion Torrent 二代测序平台和一步 PCR 扩增法的文库构建思路,正向引物和反向引物的 5端分别添加不同的功能核苷酸序列得到建库引物。1.2.6 PCR 扩增与测序 PCR 反应体系 50 L:2Phanta Max Master Mix 生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY 25.0 L,建库正向引物(10 mol/L)1.0 L、建库反向引物(10 mol/L)1.0 L,Nuclease-free H2O 20.0 L,DNA 模板 3.0 L。采用一步 PCR 法构建文库,其中PCR 扩增条件采用两步梯度法,扩增条件:95 预变性 5 min;95 变性 30 s,65 退火 30 s,72 延伸30 s,共 5 个循环;95 变性 30 s,60 退火30 s,72 延伸 30 s,共 30 个循环;72 再延伸 5 min。同时设置阳性对照和阴性对照。PCR 扩增产物经 2.0%琼脂糖凝胶电泳检测后,采用天根琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒,对 PCR 产物目的条带进行割胶回收、纯化,Qubit R2.0 检测文库浓度;将筛选的文库按照一定比例混合后,在本公司的Ion Torrent 二代测序仪上进行高通量测序。1.2.7 数据分析提取的 DNA 质量数据,采用 SPSS 软件对其进行分析,为评估差异,差异显著系数为 P0.05。Ion Torrent 二代高通量测序得到的原始数据经base calling 转化为序列数据,以 FASTQ 文件格式存储,包括 reads 的序列和碱基的测序质量。对数据去除潜在污染序列、接头和 barcode 序列后,使用 QIIME2 进行 N 较多或者低质量序列过滤,再进行嵌合体过滤,得到可用于后续分析的有效数据。随机抓取 5 万有效数据进行分析,采用 DADA2 算法对有效数据进行聚类,获得 ASVs。最后,对比本公司构建的鱼类数据库进行物种分类学注释,鱼类物种注释阈值设置为 98%。2 结果与分析2.1 不同保存方法对提取的 DNA 质量的影响采用同样的试剂盒对 6 种不同方法保存的滤膜进行 DNA 提取,eDNA 质量分析结果如表1 所示。从表 1可以看出,不同保存方法,其 Qubit 检测浓度均低于对应 Nanodrop 浓度。TK 保存液-常温保存条件下获得的eDNA 浓度最高。通过比较发现,虽然乙醇-常温保存法(100%和 75%浓度)Nanodrop 具有一定的浓度,但Qubit 浓度均低于 0.1 ng/L,不能满足文库构建的模板需求。通过 t 检验的 P 值可以看出,与对照组相比,乙醇-常温保存法和 Longmires 保存液-常温存在显著差异(P0.05)。从差异不显著的方法中筛选合适的保存方法,根据 Qubit 平均浓度比较可知,TK 保存液-常温-80-20 对照组。A260/A280是衡量 DNA 纯度的指标,一般认为在1.8 2.0 范围内的 DNA 纯度好,表 1 的 A260/A280 eDNA 质量比较结果表明,对照组与-20、-80 和TK 保存液-常温的 A260/A280均介于 1.8 2.0,且与对照组相比,其 t 检验的 P 值均0.05。而乙醇保存的A260/A2802.0,Longmire s 保存液-常温的 A260/A2801.8,与对照组相比,其 P 值均0.05,具有显著差异。但与对照组相比,-20、-80和 TK 保存液-常温获得的 eDNA 的 A260/A230介于 1.221.89,差异不显著;不过乙醇保存方法和 Longmires 保存液具有显著差异(P0.05)。从提取的 eDNA 稳定性考虑,对照组和-20、-80、TK 保存液-常温的保存方法相比较更稳定,适用于滤膜的保存。总之,Longmires 保存液保存虽可以获得一定的eDNA 浓度,但 eDNA 纯度较差;乙醇保存的 Nanodrop有一定浓度,但 Qubit 浓度均低于 0.1 ng/L,且 eDNA纯度较差。综上所述,TK 保存液-常温为最优保存方法,其次是-20 和-80,且都优于对照组,因此选择-20、-80 和 TK 保存液-常温并以对照组作对比的方式开展后续实验。表 1 不同保存方法获得的 eDNA 质量比较Table 1 Comparison of eDNA concentration and purity obtained by different preservation methods保存方法Preservation methodDNA 质量浓度DNA mass concentration/(ng/L)DNA 质量浓度DNA mass concentration/(ng/L)QubitNanodropA260/A280A260/A230对照组39.20.7353.11.961.880.011.530.11-20 41.42.5052.16.511.930.011.560.16-80 43.33.6750.84.141.950.011.360.08无水乙醇-常温0.16.871.032.050.150.740.0775%乙醇-常温0.05);冷冻的保存方法与对照组相比差异不显著(P0.05),而 TK 保存液-常温与对照组相比差异显著(P0.05),表明 TK 保存液-常温对滤膜具有稳定的保存性,不会随着保存时间的延长而发生改变。虽然冷冻保存(-20 和-80)捕获的 eDNA 浓度不及 TK 保存液-常温的,但保存两周内获得的平均 eDNA 浓度比较稳定,略高于对照组(P0.05)。不同保存方法在不同保存时间下捕获的 eDNA 浓度 Qubit 结果同样表明 TK 保存液-常温保存法稳定性好,且捕获的 eDNA 浓度也最优图 2(d)(f)。2.4保存方法和保存时间组合捕获 eDNA 的鱼类文库比较 比较 3 种保存方法在 3 d、一周和两周保存时间下获得鱼类 12S rRNA 基因的 PCR 产物浓度。以各条件获得的 eDNA 为模板,模板量均为 20 ng 的 PCR 文库Qubit 浓度如图 3 所示。结果表明,-20、-80 和TK 保存液-常温保存方法均在保存一周获得的鱼类文库浓度最高,文库浓度分别为(1.640.09)、(1.23(a)不同保存方法保存 3 d 捕获的 eDNA 浓度(Nanodrop 2000 测定);(b)不同保存方法保存一周捕获的 eDNA 浓度(Nanodrop 2000 测定);(c)不同保存方法保存两周捕获的 eDNA 浓度(Nanodrop 2000 测定);(d)不同保存方法保存 3 d 捕获的 eDNA浓度(Qubit 2.0 荧光计测定);(e)不同保存方法保存一周捕获的 eDNA 浓度(Qubit 2.0 荧光计测定);(f)不同保存方法保存两周捕获的 eDNA 浓度(Qubit 2.0 荧光计测定)。图 2 不同保存方法的不同保存时间下捕获的 eDNA 浓度比较Figure 2 Comparison of eDNA concentration obtained bycombination of different preservation methods and preservation times0.18)和(1.850.06)ng/L。对不同的保存时间,TK保存液-常温保存的文库浓度高于冷冻保存,且保存一周的条件下,文库平均浓度 TK 保存液-常温-20 -80 对照组(0.790.05)ng/L。通过 t 检验分析表明,冷冻保存(-20、-80)与对照组之间差异不显著(P0.05);TK 保存液-常温和-20 之间差异显著(P=0.015 0.05);TK 保存液-常温、-80 和对照组之间差异非常显著(P0.05)图 4(a)。Shannon 指数可以用来表征物种多样性,值越大,物种越丰富,图 4(a)中结果表明,Shannon 指数组间的差异不显著(P0.05)。不同条件下,采用 12S rRNA 基因的宏条形码技术能定性鉴定到鲫鱼(Carassius auratus)、鲤鱼(Cyprinus carpio)、翘 嘴 鲌(Culter alburnus)、花(Hemibarbus maculatus)、条(Hemiculter leucisculus)、鲢鱼(Hypoph-thalmichthys molitrix)和黄颡鱼(Tachysurus fulvidraco)图 4(b),与饲养鱼箱中养殖的鱼物种一致,表明以上保存条件获得的 eDNA 均能对采集水样中的鱼类多样性进行准确定性鉴定。3 讨论随着 eDNA 技术的推广和应用,研究者们针对eDNA 实验过程的优化开展了大量的研究工作,但对eDNA 保存的方法和保存时间还未形成统一的标准,这不利于第三方基因检测实验室开展 eDNA 技术业务的推广。本研究以鱼箱中模拟养鱼水为研究对象,通过捕获的 eDNA 质量、鱼类的多样性和监测的准确性,评估不同保存方法、保存时间对 eDNA 的影响,确定了适用于第三方基因检测实验室开展 eDNA 相关检测的保存方案。结果表明,水样采集后立即过滤,滤膜直接提取获得 eDNA 或者采用-20、-80 或 TK 保存液-常温保存方法在 2 周时间内,以上两种方法均可稳定保存 eDNA,但考虑到野外采样和运输过程,TK 保存液-常温为最优滤膜保存方法。图 4 不同保存方法的不同保存时间下鱼类物种多样性比较Figure 4Comparison of Fish diversity obtained by combination of different preservation methods and preservation times3.1 不同滤膜保存方法对 eDNA 捕获效果的影响研究表明水样采集后应立即抽滤,选择混合纤维素滤膜捕获水样中的 eDNA,组合凯杰 DNeasyPower-生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Water Kit 进行 DNA 提取效果更好。由于滤膜的提取不一定能够在水样过滤结束后立刻展开,滤膜有效、稳定和长时间保存是影响 eDNA 质量的重要因素,且对低含量物种的检测也是至关重要的。故本研究选择了本公司研发的 TK 保存液和另外 5 种常见的滤膜保存方法进行比较(表 1),结果显示,TK 保存液-常温效果最优、冷冻保存(-20、-80)次之,但均优于 Long-mires 保存液-常温和乙醇-常温保存。乙醇保存法在提取环节对乙醇的去除过程很繁琐,对 DNA 提取质量影响较大,这一研究结果与 Kelly 等16和陈治等17的研究结果 一致;Kumar 等18、Johan 等19研究 发现Longmires 保存液-常温可以在不超过 24 h 条件下储存滤膜,这就可以解释,采用 Longmires 保存液-常温保存 3 d 后获得的 eDNA 质量差。因此,在实验室条件或者运输途中,对滤膜可以优选 TK 保存液-常温,其次为冷冻冰箱或干冰保存,但在野外没有冷冻的条件时,采用添加 TK 保存液-常温保存滤膜,可节约采样成本或运输成本。此外,本研究比较了合适的保存方法的稳定性,从提取浓度结果看,TK 保存液-常温、-20 和-80 保存方法自身的稳定性较好,且获得的 eDNA 浓度 TK 保存液-常温-20 冷冻-80 冷冻对照组(抽滤结束后滤膜直接提取)。因此,如果非加急样本,推荐抽滤结束后采用合适的方法暂时保存滤膜,优选 TK保存液-常温,其次为冷冻保存。3.2 保存方法和保存时间对 eDNA 捕获效果的影响比较不同保存条件下 3 d 滤膜的 eDNA 质量仅是考虑了滤膜样本寄送给第三方基因检测实验室运输过程中的时间,但第三方基因检测实验室对滤膜样本DNA 的提取不一定能够在收到滤膜样本即可开展,李红婷等9也建议开展滤膜的长期保存方法,因此考虑滤膜一段时间的有效保存方法具有现实意义。本研究对 3 种合适的保存方法分别在保存 3 d、1周和 2 周条件下捕获的 DNA 浓度、鱼类 12S rRNA 基因文库和鱼类生物多样性等进行比较,结果表明 TK保存液-常温、-20 和-80 保存方法在 2 周内各自均能稳定地对滤膜进行保存,且 TK 保存液-常温在不同保存时间捕获的 eDNA 浓度均最高。针对鱼类 12S rRNA 基因的文库浓度,本研究设计了鱼类 12S rRNA的淡水鱼通用引物,从分子技术层面筛选出最优的一组引物用于鱼类多样性检测,结果表明保存一周可以获得的文库浓度 TK 保存液-常温-20-80。通过 DADA2 模型的算法可以削弱 PCR 和测序过程中的错误,以去重复后得到的非聚类单核苷酸序列变体(Amplicon sequence variants,ASVs)作为最小分类单元,对测序结果进行分析,结合本公司自建的鱼类数据库进行物种注释,表明几种保存方法和保存时间的组合均能准确对水样中鱼类多样性进行鉴定。综上所述,TK 保存液-常温、-20 和-80 保存方法在 2 周内均可以稳定地对滤膜进行长时间的保存,尽管 1 周的文库浓度最高,但不同条件均能实现 eDNA 技术对鱼类生物多样性的准确监测,应优选 TK 保存液,不仅成功实现了常温保存,而且更加经济和便捷。4 结论与展望通过本研究数据分析,发现 TK 保存液-常温和冷冻(-20、-80)保存法均能稳定长时间(2 周)保存滤膜,准确监测鱼类生物多样性,且最优的为 TK 保存液-常温保存法。本研究将为 eDNA 的保存条件提供了技术指导,为第三方基因检测实验室开展 eDNA宏条形码技术的推广解决了实际问题。由于本研究仅考虑了保存 2 周时间内的滤膜情况,且是以模拟的养鱼水进行测试,并未考虑到真实水样环境的复杂性和差异性,后续实验将继续探索更长时间保存条件对结果的影响,并在开阔的湖泊开展测试,以摸索更长时间适用的 eDNA 保存方法并评估 eDNA 技术流程的稳定性和准确性20-25。参考文献 1 李晓玲.基于环境 DNA 技术的东海秋季鱼类物种多样性研究 D.上海 上海海洋大学 2022.2 刁曹鋆 王闻 线薇薇 等.环境 DNA 技术在渔业资源生物量评估中的研究进展 现状与展望 J.海洋科学 2022 46 2 135-144.3 郑亦佳 杨天燕 郭泽豪 等.不同保存条件下龙头鱼不同组织DNA 提取效果比较分析 J.浙江海洋大学学报 自然科学版 2020 39 03 216-221.4 李苗 单秀娟 王伟继 等.环境 DNA 在水体中存留时间的检测研究 以中国对虾为例 J.渔业科学进展 2020 41 1 51-57.5 赵明 赵梦迪 马春艳 等.环境 DNA 在水域生态中的研究进展 J.中国水产科学 2018 25 4 714-720.6 高旭.太湖鱼类环境 DNA 宏条形码快速监测技术应用研究 D.南京 南京大学 2020.7 ZHANG Y MARIIA P ELENA S et al.Holistic pelagic biodiver-sity monitoring of the Black Sea via eDNA metabarcoding approach From bacteria to marine mammals J.Environment International 2020 135 C 105307.8 THOMSEN P F WILLERSLEV E.Environmental DNA-An emer-ging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity J.Biological Conservation 2015 183 4-18.9 李红婷 张帅 邹柯姝 等.珠江河口水体环境 DNA 提取方法的建立及优化 J.南方水产科学 2022 18 3 30-37.10 RUAN H WANG R et al.Effects of sampling strategies and DNA extraction methods on eDNA metabarcoding a case study of estuar-ine fish diversity monitoring J.Zoological Research 2022 43生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY 2 192-204.11 LIANG Z KEELEY A.Filtration recovery of extracellular DNA from environmental water samples J.Environmental science&technology 2013 47 16 9324-9331.12 王月 刘焕章 李莎 等.基于微滴式数字 PCR 方法的鱼类环境 DNA 样本处理与保存技术优化 J.水生生物学报 2022 46 3 332-341.13 黎慧 阚霞 魏宁 等.一种水环境 eDNA 提取方法的建立 J.安徽农业科学 2019 47 9 108-115.14 单秀娟 李苗 王伟继.环境 DNA eDNA 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