抑制miR-145表达影响小鼠牙种植体周围炎炎症反应的实验研究.pdf

文章编号（）抑制 表达影响小鼠牙种植体周围炎炎症反应的实验研究李孔梅，叶枝茂，麦昱颖，王琪，李昊（广西医科大学口腔医学院 附属口腔医院口腔修复科，广西口腔颌面修复与重建研究重点实验室，广西 南宁；四川大学华西口腔医院口腔修复科，四川 成都）摘要 目的：探讨抑制 对小鼠种植体周围炎炎症反应的影响。方法：将 雄性小鼠 只随机分为正常对照组、炎症对照组、炎症 组、炎症 组。在各组上颌植入种植体，对 个炎症组拴丝形成种植体周围炎后，对炎症 组局部注射 抑制剂，在炎症 组局部注射 抑制剂的阴性对照剂，微计算机断层扫描观察各组种植体周围骨丧失情况，苏木素伊红染色观察种植体周围组织炎细胞浸润情况，实时荧光定量 检测种植体周围牙龈组织、趋化因子 基序配体（）、肿瘤坏死因子（）、白细胞介素（）、白细胞介素（）、基质金属蛋白酶（）的表达水平。结果：与正常对照组小鼠相比，个炎症组小鼠骨丧失量及炎细胞浸润明显增加（），牙龈组织中炎症相关因子、表达水平升高（）；抑制 表达后，种植体周围炎小鼠骨丧失量、炎细胞浸润情况改善，、表达减少，表达升高（）。结论：抑制 的表达可缓解种植体周围炎炎症反应，可能与其调节牙龈组织中炎症相关因子表达有关。关键词 种植体周围炎；趋化因子 基序配体；炎症因子中图分类号 文献标识码 ，（，；，）：，：，（），（），（），（）（）：，（），（），（）：，；基金项目：国家自然科学基金（）；广西医疗卫生适宜技术开发与推广应用项目（）通信作者：李昊，：种植义齿修复已成为临床治疗牙列缺损、牙列缺失的常用方法。然而，种植体植入术后因口腔卫生维护不佳、粘接剂残留等原因，种植体周围炎患者日益增加。有研究表明，种植修复术后 年种植体周围炎的发病率可高达 ，如不及时控制炎症的发展，易导致种植体松动脱落，造成修复治疗失败。因此，探讨种植体周围炎的发生、发口腔生物医学 年 月（第 卷第 期），展机制以及寻找控制炎症的有效方法，仍是当前口腔医学研究的热点之一。近年来，多项研究显示微小（，）在调控免疫细胞增殖与凋亡的进程中发挥重要作用，并能调节免疫炎症反应，对多种炎性疾病有重要影响。其中，有多种生物学功能，可调节肿瘤细胞迁移、单核细胞炎症反应等。还有研究发现，在种植体周围炎牙龈组织中表达明显上调，提示 可能对种植体周围炎的发生发展具有调控作用。然而调节 的表达对种植体周围炎有何影响，尚未见报道。本研究通过拴丝法构建小鼠种植体周围炎模型，并抑制其种植体周围牙龈组织中 表达，检测种植体周围骨丧失、炎细胞浸润及趋化因子 基序配体（，）等炎症相关因子的表达，初步探究调节 的表达对小鼠种植体周围炎炎症反应的影响。材料与方法 实验动物与材料 只 级 周龄雄性 小鼠购自广西医科大学动物实验中心，体质量 。动物实验经广西医科大学动物实验伦理委员会批准（批准号：）。氯胺酮（珠海同源），赛拉嗪（成都思天德），磺胺甲噁唑、甲氧苄啶（山西鑫煜），螺纹钛种植体（四川大学生物材料工程研究中心），（广州锐博），二甲苯（武汉吉鑫益邦），苏木素伊红（，）染色试剂盒（上海迈坤），、试剂盒、试剂（南京诺维赞）。（，瑞士），光学显微镜（，日本）。方法 实验性小鼠种植体周围炎模型的建立适应性喂养 周后，将小鼠随机分为正常对照组、炎症对照组、炎症 组、炎症 组，每组 只。所有小鼠腹腔注射氯胺酮（）和赛拉嗪（），进行全身麻醉。参照文献拔除左侧上颌第一、第二磨牙，饮用水中加入磺胺甲噁唑（）和甲氧苄啶（）周。拔牙区愈合 周后，在所有小鼠拔牙区植入种植体：在拔牙部位相应的牙龈组织翻瓣，在牙槽骨上钻一个直径为 、深度为 的孔，将一个表面光滑长度为 、直径为 的螺纹钛种植体植入上颌骨缺牙区，愈合 周。在种植体愈合期间，小鼠进食软食。在种植体植入 周后，炎症对照组、炎症 组与炎症 组小鼠的于种植体周围紧靠种植体头部顶端以 丝线拴丝，诱导形成实验性种植体周围炎。局部抑制 表达拴丝 周后，炎症 组及炎症 组 小 鼠 分 别 注 射 抑 制 剂 及阴性对照物（，），注射部位为左上颌种植体近中及远中牙龈乳头，在正常对照组及炎症对照组种植体周围相同部位注射等体积生理盐水。每周 次，连续 周。扫描每组随机选取 只小鼠，钝性分离每只小鼠左上颌种植体周围牙龈组织，并取左上颌骨组织进行 检测。所有样本以 射线 旋转角度扫描，并在 工作电压和 电流以及 各向同性体素分辨率下进行测量，重建图像。以每个种植体顶面为起始，将种植体周围直径为、高度为 的圆柱体作为感兴趣体积，量化种植体周围骨丧失情况，种植体周围骨丧失量总感兴趣体积总骨体积。染色将各组剩余的 只小鼠左上颌骨于 溶液中脱钙后，将种植体仔细旋出，其余组织包埋，并按近远中方向以 厚度连续切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精处理，苏木素浸泡，盐酸酒精分化，温水浴中返蓝，伊红上色，脱水透明，封片，置于光学显微镜 倍物镜下观察，计数每个种植体周围组织中 个视野（）中的炎细胞数，然后取平均值表示每组小鼠的炎性浸润水平。实时荧光定量 预冷研钵，将 中分离所得的小鼠左上颌种植体周围牙龈组织研磨粉碎，按照说明使用 常规提取总 后，逆转录成，用实时荧光定量 检测、肿瘤坏死因子（，）、白细胞介素（，）、基质金属蛋白酶（，）的 相对表达量，所有实验操作按照试剂盒说明进行。使用 作为内参。反应条件：预变性 ；变性，退火 ，延伸 ，共 个循环；延伸 。采用 法计算目的基因相对表达量。各基因引物序列见表。统计学分析采用 软件对数据 进行分析，各组间比较采用成组设计方差分析，组间比较采李孔梅，等抑制 表达影响小鼠牙种植体周围炎炎症反应的实验研究用 检验，检验水准。表 引物序列 基因名称引物序列（）：结 果 抑制 表达可减少小鼠种植体周围炎骨丧失 结果显示，与正常小鼠相比，炎症对照组、炎症 组、炎症 组环绕种植体颈部周围的骨丧失量明显增加（）；与炎症对照组、炎症 组相比，炎症 组环绕种植体颈部周围的骨丧失量降低（，图），提示抑制 表达可减少种植体周围炎的骨丧失。抑制 表达可减轻小鼠种植体周围组织炎细胞浸润 染色结果显示，与正常对照组相比，炎症对照组、炎症 组、炎症 组炎细胞浸润明显增加（）；抑制 表达后，与炎症 对 照 组、炎 症 组 相 比，炎 症 组的炎细胞浸润减少（，图），提示抑制 表达可减轻种植体周围炎小鼠种植体周围组织的炎细胞浸润。抑制 表达可影响小鼠种植体周围炎症相关因子表达实时荧光定量 结果显示，与正常对照组相比，炎症对照组、炎症 组的 表达量增加（），注射 抑制剂后，炎症 组的 表达量降低（）。与正常对照组相比，炎症对照组、炎症 组、炎症 组的、基因表达水平上升（）；与炎症对照组、炎症 组相比，炎症 组的、的基因表达量降低，而 的基因表达量增加（，图）。提示抑制 表达可下调、这些促炎蛋白的基因表达，增加抗炎因子 基因表达。：正常对照组；：炎症对照组；：炎症 组；：炎症 组；：种植体周围骨丧失定量分析，：与正常对照组相比，；：与炎症 组相比，。图 检测各组小鼠种植体周围骨丧失情况 讨 论种植体周围炎是一种以种植体周围结缔组织炎症及进行性边缘骨吸收为病理特征的疾病，既往研究显示钛种植体周围组织长期存在巨噬细胞等炎症细胞的免疫调节活动，多种因素刺激可导致免疫调节失衡而产生边缘骨吸收，提示调节巨噬细胞等炎症细胞反应可能成为治疗种植体周围炎的新途径。近年研究发现，在某些炎性疾病中可调节炎症细胞的生物学功能及炎症反应：刘玲等发现在小鼠动脉粥样硬化模型中，调节 表口腔生物医学 年 月（第 卷第 期），：依次为正常对照组、炎症对照组、炎症 组、炎症 组 染色图（）；：种植体周围炎细胞浸润定量分析，：与正常对照组相比，；：与炎症 组相比，。图 染色检测各组小鼠种植体周围组织炎细胞浸润 达可抑制局部巨噬细胞活化并降低核因子（，）磷酸化水平，降低炎症严重程度；王海鹰等发现 在炎症性肠炎患者外周血单核细胞高表达，并可能调节 细胞 比值，增加血清 水平。然而，调节 表达对种植体周围炎的影响未见报道。本研究发现，与正常对照组相比，炎症对照组、炎症 组、炎症 组小鼠种植体周围骨丧失量及炎细胞浸润明显增加，提示种植体周围炎模型构建成功。与炎症对照组、炎症 组相比，炎症 组的骨丧失量与炎细胞浸润减少。此外，与正常组相比，炎症对照组、炎症 组的 表达增加，而炎症 组的表达降低。这些结果提示，抑制 在种植体周围龈组织中的表达，可缓解种植体周围炎。：与正常对照组相比，；：与炎症 组相比，。图 实时荧光定量 检测各组小鼠种植体周围龈组织的炎症相关因子基因表达 作为 型趋化因子家族成员，是单核巨噬细胞的主要趋化因子之一，可高效募集单核、巨噬细胞到局部并产生 等多种炎症相关因子，调节局部炎症反应。本研究发现，在炎症对照组、炎症 组高表达，使用 抑制剂的炎症 组表达降低，提示 可能通过影响 的表达，调节种植体周围炎炎症反应。既往研究表明，在骨关节炎、牙髓炎、慢性牙周炎等全身或口腔炎性疾病中发挥重要作用，。牙周炎患者和种植体周围炎患者龈沟液中 表达水平较正常患者升高，且与炎症严重程度正相关。有关小鼠动脉粥样硬化模型及骨关节炎的研究显示，过表达 可导致 表达上调、炎症反应加重，提示 可能调节 表达，影响炎症进程。上调 表达可激活炎症相关经典信号通路 通路，并加重炎症反应。而 通路活化，可增强 的表达，促进巨噬细胞聚集。本研究还观察到，与正常对照组相比，各炎症组种植体周围龈组织的、表达水平升高，应用 抑制剂后，随着 与 表达水平降低，、表达减少，而 表达进一步增加，提示抑制 表达可调节炎症反应相关因子的表达，缓解炎症反应。巨噬细胞受到趋化因子、促炎因子等刺激后，可分泌、蛋白水解酶等促炎介质，而、在多种炎症疾病中起重要作用，二者还可协同促进炎症进一步发展。能增强中性粒细胞的吞噬功能，并激活破骨细胞，促进炎症部位骨吸收；可增加中性粒细胞在炎症反应部位的趋化性，使更多炎细胞聚集浸润于病变区域，。在种植体周围炎状态下，、也李孔梅，等抑制 表达影响小鼠牙种植体周围炎炎症反应的实验研究能促进炎症反应。激活的单核巨噬细胞还能分泌、等炎症相关因子。属于抗炎因子，具有抑制炎症、促进组织愈合和恢复免疫稳态等作用，与慢性牙周炎、种植体周围炎等炎症的发展和转归密切相关，提高其表达有利于减轻炎症局部组织损害。这种以金属离子为辅助因子的蛋白酶，可通过降解病变周围组织，加重炎症部位组织破坏，在种植体周围炎早期诊断中具有重要意义，降低其表达水平有利于缓解种植体周围炎。综上，本研究发现种植体周围炎牙龈组织中 表达增加，抑制 表达能缓解种植体周围炎炎症反应。后期研究将以体外细胞实验、基因敲除动物模型等进一步探索验证 对种植体周围炎的具体作用机制，为治疗种植体周围炎提供新思路及理论依据。参 考 文 献 ，（）：，：，：，（）：王鸿利，何琴，刘帆，等 通过靶向 抑制 诱导的血管内皮细胞氧化损伤和炎症中国免疫学杂志，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：张照欣，王新革，葛泽阳，等 钛种植体愈合期牙龈炎性浸润及巨噬细胞极化的研究 实用口腔医学杂志，（）：刘玲，蒋婷婷，杨宇龙，等 基于 通路丹皮酚调控 抑制小鼠动脉粥样硬化泡沫细胞炎症反应 安徽中医药大学学报，（）：王海鹰，石伟，孔祥伟，等 炎症性肠病患者外周血单核细胞 表达及与 水平的关系 中国现代普通外科进展，（）：彭中华，彭诗婷，庞河，等 调节血管生成及在骨重建修复中的运用 医学信息，（）：戈春城，田涛 种植体周围炎不同时期单核细胞趋化蛋白的水平变化 临床口腔医学杂志，（）：，（），（）：龚启梅，凌均棨 单核细胞趋化蛋白 与口腔疾病关系的研究进展 国际口腔医学杂志，（）：，王仁兰 和 在牙龈炎和牙周炎患者体液中的表达水 平 及 意 义 中 国 实 验 诊 断 学，（）：曹宇皎，谢红梅，田虹，等 龈沟液、与种植体周围炎 值的关系及联合诊断价值 分子诊断与治疗杂志，（）：，：，：，：，（）：，（）：，（）：陈慧文，胡苡，张卫平，等 种植体周围炎龈沟液中、和 的表达 上海交通大学学报（医学版），（）：，（）：，（）：王媛，张旭东 糖尿病患者种植术后早期种植体周围龈沟液中相关炎症因子表达 口腔颌面外科杂志，（）：王丽娟，王莉华 慢性牙周炎患者种植修复后临床疗效及对龈沟液炎性因子和基质金属蛋白酶水平的影响 临床口腔医学杂志，（）：（收稿日期：）（本文编辑：钟旖）口腔生物医学 年 月（第 卷第 期），