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DNA提取和常见问题
分析及对策

主讲人： 关锰

生物秀-专心做生物

DNA简单介绍

DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物

信息分子，是分子生物学研究的主要对象。 为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高 分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。

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DNA提取原则

. 保证DNA结构的完整性
. 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质
. 排除有机溶剂和金属离子的污染
. 蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度
. 排除其他核酸分子的污染

DNA提取的几种方法

一、染色体DNA的提取

CTAB法

SDS法 其它

DNA提取的几种方法

二、非染色体DNA的提取

质粒DNA的提取
• 碱裂解法
• 煮沸法

线粒体、叶绿体DNA的提取

• 差速离心结合SDS裂解法

CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）

CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基 三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜， 并与核酸形成复合物。

该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通 过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙 醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。

注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷
的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

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CTAB法流程图

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植物材料 裂解液
异丙醇沉淀

液氮研磨 抽提
离心洗涤
DNA溶液

细胞裂解
上层溶液
干燥溶解

CTAB中各个组分的作用

CTAB提取缓冲液的经典配方

. Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；

. EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性；

. NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；
. CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；

. β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使
酚容易去除。

CTAB提取缓冲液的改进配方

PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚

形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少 DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效 去除多糖。

除蛋白质：

? 氯仿/异戊醇抽提(氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机
相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程
中出现的气泡）。
? 使用变性剂变性 (SDS.异硫氰酸胍等）
? 高盐洗涤
? 蛋白酶处理

除多糖：

> 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积
的5M NaCl，高盐可溶解多糖。

> 用多糖水解酶将多糖降解。

> 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以
与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。

除酚类物质：

> 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基
乙醇.抗坏血酸.半胱氨酸.二硫苏糖醇等

> 加入易与酚类结合的试剂：如PVP.PEG(聚乙二 醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类 与DNA的结合

除盐离子：

70％的乙醇洗涤

TE中成分的作用

> TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase

> pH值为8.0，可防止DNA发生酸解

称取样品，液氮研磨，加入预热的(65℃ ) CTAB及β-巯基乙醇

保温1h,期间不停的摇均

吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒 混匀,10000rpm,10min

取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀,
10000rpm,10min

取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4 ℃ /-20 ℃保温沉淀

10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干

用TE溶解DNA,然后低温保存

应注意的问题

材料准备：
最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融。

液氮研磨： 研磨样品时要有液氮的保护，在整个过程中都不要让液氮 挥发干净。避免材料回温和反复冻融带来的降解。此外尽 量将样品研磨的很细，这样可以提高DNA产量。

细胞裂解： 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。 高温温浴时，定时轻柔振荡。

应注意的问题

DNA沉淀：用乙醇或异丙醇都可以。异丙醇沉淀的效率要高于无水乙

醇，试验中只需要0.6倍体积的异丙醇沉淀；而需要2倍体 积的无水乙醇。但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀， 且在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去 。

DNA干燥：晾干DNA，让乙醇充分挥发。

DNA溶解：若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。

基因组DNA的检测

> 高质量的基因组DNA带型 单一无拖尾现象
> DNA浓度及纯度的检测 A260=1 约 50 μg/ mL
> 双链 DNA， A260/280 约为1.8

DNA提取常见问题

问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。

原因

1. DNA中含有蛋白、多
糖、多酚类杂质
2. DNA在溶解前，有酒
精残留，酒精抑制 对
后续酶解反应 策
3. DNA中残留有金属离
子
4. 有RNA的存留


• 重新纯化DNA，过吸附 柱去除蛋白、多糖、 多酚等杂质
• 重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发
• 增加70％乙醇洗涤的 次数（2-3次）
• 加入RNase降解RNA

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DNA提取常见问题

问题二：DNA降解。
原
因

1. 材料不新鲜或反复冻 融
2. 未很好抑制内源核酸
酶的活性 对
策
3. 提取过程操作过于剧
烈，DNA被机械打断
4. 外源核酸酶污染
5. 反复冻融


1. 尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融
2. 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液
3. 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量，细胞裂解后的后续操作应 尽量轻柔
4. 所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌
5. 将DNA分装保存于缓冲液中，避免
反复冻融

DNA提取常见问题

问题三：DNA提取量少。
原
因

1. 实验材料不佳或量少

2. 破壁或裂解不充分 对 策
3. 吸附或沉淀不完全

4. 洗涤时DNA丢失
1. 尽量选用新鲜（幼嫩）

的材料

2. 植物要匀浆研磨充分

3. 增加吸附的时间，或低 温沉淀
4. 小心操作