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1、 DNA提取和常见问题 分析及对策 主讲人： 关锰 生物秀-专心做生物 DNA简单介绍 DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象。 为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高 分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 DNA提取原则 . 保证DNA结构的完整性 . 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质
2、 排除有机溶剂和金属离子的污染 . 蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度 . 排除其他核酸分子的污染 DNA提取的几种方法 一、染色体DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它 DNA提取的几种方法 二、非染色体DNA的提取 质粒DNA的提取 • 碱裂解法 • 煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取 • 差速离心结合SDS裂解法
3、 CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基 三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜， 并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通 过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙 醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷 的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 生物秀-专心做生物
4、 CTAB法流程图 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 植物材料 裂解液 异丙醇沉淀 液氮研磨 抽提 离心洗涤 DNA溶液 细胞裂解 上层溶液 干燥溶解 CTAB中各个组分的作用 CTAB提取缓冲液的经典配方 . Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； . EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离
5、子，抑制DNase活性； . NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； . CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； . β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使 酚容易去除。 CTAB提取缓冲液的改进配方 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚 形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少 DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效 去除多糖。 除蛋白质： ? 氯仿
6、/异戊醇抽提(氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机 相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程 中出现的气泡）。 ? 使用变性剂变性 (SDS.异硫氰酸胍等） ? 高盐洗涤 ? 蛋白酶处理 除多糖： > 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积 的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 > 用多糖水解酶将多糖降解。 > 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以 与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 除酚类物质：
7、 > 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基 乙醇.抗坏血酸.半胱氨酸.二硫苏糖醇等 > 加入易与酚类结合的试剂：如PVP.PEG(聚乙二 醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类 与DNA的结合 除盐离子： 70％的乙醇洗涤 TE中成分的作用 > TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase > pH值为8.0，可防止DNA发生酸解 称取
8、样品，液氮研磨，加入预热的(65℃ ) CTAB及β-巯基乙醇 保温1h,期间不停的摇均 吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒 混匀,10000rpm,10min 取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀, 10000rpm,10min 取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4 ℃ /-20 ℃保温沉淀 10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干 用TE溶解DNA,然后低温保存
9、 应注意的问题 材料准备： 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融。 液氮研磨： 研磨样品时要有液氮的保护，在整个过程中都不要让液氮 挥发干净。避免材料回温和反复冻融带来的降解。此外尽 量将样品研磨的很细，这样可以提高DNA产量。 细胞裂解： 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。 高温温浴时，定时轻柔振荡。 应注意的问题 DNA沉淀：用乙醇或异丙醇都可以。异丙醇沉淀的效率要高于无水乙 醇，试验中只需要0.6倍体
10、积的异丙醇沉淀；而需要2倍体 积的无水乙醇。但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀， 且在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去 。 DNA干燥：晾干DNA，让乙醇充分挥发。 DNA溶解：若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。 基因组DNA的检测 > 高质量的基因组DNA带型 单一无拖尾现象 > DNA浓度及纯度的检测 A260=1 约 50 μg/ mL > 双链 DNA， A260/280 约为1.8 DNA提取常见问题 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
11、 原因 1. DNA中含有蛋白、多 糖、多酚类杂质 2. DNA在溶解前，有酒 精残留，酒精抑制 对 后续酶解反应 策 3. DNA中残留有金属离 子 4. 有RNA的存留 • 重新纯化DNA，过吸附 柱去除蛋白、多糖、 多酚等杂质 • 重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发 • 增加70％乙醇洗涤的 次数（2-3次） • 加入RNase降解RNA 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 DNA提取常见问题 问题二：DNA降解。 原 因 1
12、 材料不新鲜或反复冻 融 2. 未很好抑制内源核酸 酶的活性 对 策 3. 提取过程操作过于剧 烈，DNA被机械打断 4. 外源核酸酶污染 5. 反复冻融 1. 尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融 2. 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液 3. 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量，细胞裂解后的后续操作应 尽量轻柔 4. 所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌 5. 将DNA分装保存于缓冲液中，避免 反复冻融 DNA提取常见问题 问题三：DNA提取量少。 原 因 1. 实验材料不佳或量少 2. 破壁或裂解不充分 对 策 3. 吸附或沉淀不完全 4. 洗涤时DNA丢失 1. 尽量选用新鲜（幼嫩） 的材料 2. 植物要匀浆研磨充分 3. 增加吸附的时间，或低 温沉淀 4. 小心操作
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