应用CRISPR_Cas9系统对鸡马立克氏病病毒基因编辑的研究进展.pdf

山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医 2023年第年第年第年第44卷卷卷卷 94 应用CRISPR/Cas9系统对鸡马立克氏病病毒基因编辑的研究进展 杨 晓，苏 帅*（山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271018）摘要：鸡马立克氏病病毒（MDV）属于疱疹病毒，基因组巨大，编码百余个基因，绝大多数的基因功能未知，在一定程度上滞后了MDV致病机理的研究。MDV在鸡体内的增殖不受母源抗体干扰使其作为理想的重组疫苗载体一直备受关注。CRISPR/Cas9系统已经广泛应用于基因编辑，具有高效、快捷优势。本文针对近五年利用CRISPR/Cas9系统研究MDV基因功能及重组MDV的进展进行总结，对于MDV的致病与免疫研究具有重要的参考意义，也为其它家禽病毒基因编辑的研究提供参考。关键词：CRISPR/Cas9；马立克氏病；病毒；基因编辑 中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：1007-1733（2023）08-0094-04 鸡马立克氏病病毒（Mareks disease virus,MDV）属于疱疹病毒，基因组长约180 kb，编码100多个基因1。MDV感染鸡后会诱发免疫抑制与肿瘤性疾病，主要以肝脏、脾脏、肾脏等器官肿瘤为主要临床症状，具有高度的空气传播能力。近年来，国内的报道证实我国鸡群MDV毒力不断增强，但其致病机理并不清楚2。MDV是能用疫苗免疫防控的致肿瘤病毒之一，其庞大的基因组为外源保护性抗原的重组提供了位点，促进了MDV重组载体疫苗的研制，为家禽疫病的综合免疫防控提供有效途径3。然而，由于MDV独特的基因组结构，对于病毒基因的敲除和插入等突变研究面临巨大挑战。CRISPR/Cas9系统编辑基因技术具有高效、快捷优势，尽管其主要用来编辑宿主细胞基因，但是已经成功应用于MDV研究4。本文针对CRISPR/Cas9系统在MDV研究的最新应用进行总结，为深入揭示MDV基因功能、致病机理以及重组载体疫苗的研制提供参考。1 MDV编码基因的生物学功能研究 MDV分为三个血清型，分别为血清、II、III型，其中血清I型是致病型MDV，按照毒力强弱划分为弱毒、强毒、超强毒和特超强毒四种 不同毒力的毒株5。I型MDV基因组长约180 kb，包含近200个开放阅读框，编码100多个基因，然而大部分基因的生物学功能并不清楚。对于MDV基因功能较直接的研究方式，是敲除基因比较分析突变株生物学活性的改变。研究报道，利用粘粒系统将MDV基因组分成相互重叠的5个大基因组片段，构建MDV的感染性克隆6。Ennis等研究者利用粘粒系统敲除掉MDV超强毒株Md5的pp38、meq基因，证实pp38与淋巴细胞中早期溶细胞感染有关，但不介导肿瘤的形成；meq并不是病毒复制的必须基因，并不影响MDV的复制7。2000年，细菌人工染色体（bacterial artificial chromsomeo,BAC）技术开始运用于MDV基因功能研究，先后构建了血清I型MDV疫苗株CVI988/Rispens、超强毒RB1B以及特超强毒648A的BAC感染性克隆8。国内，笔者实验室率先构建了第一株自然重组禽网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）的长末端重复序列（Long terminal repeat,LTR）的MDVGX0101的BAC感染性克隆9，利用该感染性克隆，通过敲除其meq基因，不但直接证实了meq基因是主要致肿瘤基因，还发现敲除meq后的MDV能够提供比CVI988/Rispens更好的免疫保护效果，这为 基金项目：山东省自然科学基金“LAT簇miRNAs调控鸡马立克病毒潜伏感染的致病机制研究”（ZR2020MC180）*通信作者 2023年第年第年第年第8期期期期（总第总第总第总第313期期期期）文献综述文献综述文献综述文献综述 95 MDV流行株的免疫提供理想的候选疫苗10。敲除MDV 1.8 kb mRNA基因后，病毒的致病性显著下降，证明了其在MDV引起鸡的免疫抑制中发挥重要作用11。粘粒与BAC技术在研究MDV基因功能领域具有里程碑式意义，实现了在细菌内修饰病毒基因的研究，方便了对MDV基因的定点修饰，推进了MDV基因功能的研究。然而，其局限性在于需构建感染性克隆。2 CRISPR/Cas9系统对于基因编辑的应用 CRISPR/Cas9系统已经成为对细胞基因组进行精准编辑的有效工具，其主要由一小段RNA（small guide RNA,sgRNA）和一种高效的DNA切割酶（Cas核酸酶）组成，通过sgRNA和靶基因之间形成复合物，从而完成对特定基因序列的识别，进而依赖Cas核酸酶对该段基因进行精准切割12，随后细胞启动非同源末端连接修复DNA双链断裂，最终完成靶基因的敲除13。而对于基因的插入则需要在细胞中同时引入含有DNA双链断裂处同源臂的目的基因，在细胞启动同源重组修复DNA双链断裂的同时，将目的基因重组进靶基因处，从而实现在基因组特定位点插入目的基因14。3 CRISPR/Cas9系统敲除MDV基因的研究 CRISPR/Cas9系统基因编辑技术的发展使得学者开始关注其在MDV基因编辑方面的应用。利用CRISPR/Cas9系统敲除MDV超强毒株Md5与GX0101的meq基因，构建的基因缺失株与利用BAC技术构建的meq基因缺失株具有相同的生物学活性，证实CRISPR/Cas9系统同样可以应用于MDV基因的编辑15。此外，也再次证实了meq基因在MDV致瘤作用中的重要地位，提供了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术发掘MDV致肿瘤性基因的方法。国内其他学者在重组REV LTR的MDV活疫苗rMDV-LTR16中，通过CRISPR/Cas9系统敲除其meq基因，为进一步疫苗免疫效果的评价提供了基础17。除了MDV编码蛋白的基因以外，CRISPR/Cas9系统同样对micRNA展示出高效的编辑功能。利用CRISPR/Cas9系统分别敲除MDV GX0101的meq簇miRNAs和mid簇miRNAs，病毒的致肿瘤性与致病性分别呈现显著降低与增高的不同趋势，表明meq簇miRNAs是MDV的主要致肿瘤因子，而mid簇miRNAs则发挥重要的抑制肿瘤作用。当前，利用CRISPR/Cas9系统也已经完成了对于GX0101基因组中最后一个micRNA基因簇-LAT簇miRNAs的敲除，基因缺失株相关的生物学功能有待于进一步的动物试验验证。利用CRISPR/Cas9系统对于血清III型MDV火鸡疱疹病毒（herpesvirus of turkey,HVT）基因缺失的研究，则证实了其编码的vNr-13基因具有抑制细胞凋亡能力，为研究MDV致肿瘤基因逃避宿主免疫提供了崭新的方向18。MDV具有潜伏感染的能力，其感染的淋巴细胞系一直作为肿瘤研究的细胞模型，其中MSB-1细胞系的应用最为广泛，其也是极少能够培养鸡传染性贫血病毒的细胞之一。利用CRISPR/Cas9系统敲除MSB-1细胞系的pp38基因，细胞的增殖效率显著增高，表明pp38基因不参与维持淋巴细胞系中MSB-1细胞的 转 化19。利 用CRISPR/Cas9编 辑 系 统 从MDCC-HP8淋巴母细胞系中敲除了MDV-miR-M4，缺失miR-M4的细胞系仍可以持续增殖，证明了miR-M4并不是维持MDV感染细胞转化表型和持续增殖所必需的基因20。4 CRISPR/Cas9系统将外源基因插入MDV基因组的研究 MDV主要激发宿主的细胞免疫，具有不受母源抗体干扰的优势，是理想的重组活疫苗病毒载体。表达传染性法氏囊病毒vp2蛋白的重组HVT活载体疫苗的成功应用，更是推动了MDV重组载体疫苗的研究。利用CRISPR/Cas9系统将新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）F基因插入HVT的US2基因中，构建了能够稳定表达NDV F基因的重组HVT，接种1日龄鸡后感染NDV具有70%的免疫保护效果，表明CRISPR/Cas9系统能够应用于MDV基因组中外源基因的插入21。利用CRISPR/Cas9系统在HVT的UL45和UL46基因之间插入一个H7N9山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医 2023年第年第年第年第44卷卷卷卷 96 亚型禽流感病毒HA基因的表达盒，成功构建了表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因的重组HVT活载体疫苗候选株22。最近，利用CRISPR/Cas9系统完成了将鸡传染性喉器官炎病毒的gD、gI基因以及H9N2亚型禽流感病毒的HA基因、传染性法氏囊病毒的vp2基因三基因插入HVT基因组中，构建了表达上述三种基因的重组HVT。这为研制重组疫苗用于家禽重要疫病的综合免疫防控提供了重要的参考。通过CRISPR/Cas9系统将mCherry表达盒以及H9N2亚型禽流感病毒的HA基因插入HVT的005/006开放阅读框，构建的重组病毒能够稳定的表达外源基因，为HVT重组活载体疫苗的研究提供了一个新的靶点。利用CRISPR/Cas9系统在CVI988/Rispens疫苗株中插入带有荧光蛋白标记的pp38基因，由于荧光蛋白的标记，更容易获得插入外源基因的重组MDV，提高了重组病毒的筛选效率，有利于推进表达外源基因的重组MDV研究。5 展望 MDV是危害家禽最为严重的免疫抑制与肿瘤病，也是研究肿瘤发生发展机制的理想病毒模型，例如人的鼻咽癌、卡波氏肉瘤23。尽管疫苗免疫能够较好的预防MDV肿瘤的发生，但是自从MDV分离鉴定以来，病毒的毒力一直呈现不断增强的趋势24。因此，对于MDV致病与免疫的研究一直是国内外学者关注的重点。分子生物学技术的发展极大推动了MDV基因功能、致病传播机制的研究。其中BAC技术的广泛应用更是解决了MDV基因修饰的难题，通过构建BAC感染性克隆，能够在细菌内实现对MDV基因精准的插入、缺失等修饰25。然而，对于MDV BAC感染克隆的构建需要精细的分子操作以及大量的试验时间。在MDV基因组中插入多个病毒的外源基因具有非常大的难度，三个以上的外源基因甚至很难完成。而CRISPR/Cas9系统则可以针对不同的MDV毒株完成基因的缺失和插入编辑，尤其是通过荧光蛋白的标记筛选，提高了重组病毒的成功率。当前家禽疫病的发生呈现多样化，基于减少疫苗免疫应激、提高疫苗免疫效果、降低疫苗免疫成本等诸多因素的限制，对于载体疫苗的研制已经成为家禽疫苗研制的焦点。因此，利用CRISPR/Cas9系统构建表达外源病毒基因的重组MDV具有重要的应用价值。然而，病毒准种现象也在MDV研究中日益凸显，相比BAC感染性克隆，CRISPR/Cas9系统对于MDV基因能否完美编辑，即获得能够稳定遗传的纯化病毒突变株是值得学者们思考的问题。MDV转化的淋巴细胞系在研究肿瘤细胞的侵袭、转化中具有得天独厚的优势，长期以来由于无法对其基因进行精准修饰，相关研究一直停滞不前；而CRISPR/Cas9系统实现了对其基因的编辑，今后将是MDV基因功能、潜伏感染以及肿瘤细胞转化研究的方向。总之，CRISPR/Cas9系统能够成功地应用于MDV基因的编辑，对于相继解析MDV编码基因的功能具有巨大潜力。参考文献 1 Vychodil T,Conradie AM,Trimpert J,et al.Mareks Disease Virus Requires Both Copies of the Inverted Repeat Regions for Efficient In Vivo Replication and Pathogenesis.J Virol.2021,95（3）:e01256-20 2 Shi MY,Li M,Wang WW,et al.The Emergence of a vv+MDV Can Break through the Protections Provided by the Current Vaccines.Viruses.2020,12（9）:1048 3 Umthong S,Dunn JR,Cheng HH.Towards a mechanistic understanding of the synergistic response induced by bivalent Mareks disease vaccines to prevent lymphomas.Vaccine.2019,37（43）:6397-6404 4 Teng M,Zhou ZY,Yao Y,et al.A New Strategy for Efficient Screening and Identification of Monoclonal Antibodies against Oncogenic Avian Herpesvirus Utilizing CRISPR/Cas9-Based Gene-Editing Technology.Viruses.2022,14（9）:2045 5 He L,Li J,Peng P,et al.Genomic analysis of a Chinese MDV strain derived from vaccine strain CVI988 through recombination.Infect Genet Evol.2020,78:104045 6 崔治中,苏帅,罗俊,等.鸡马立克病毒的研究进展J.微生物学通报,2019,46（7）:1812-1826.7 Ennis S,Tai SS,Kihara I,et al.Mareks disease virus oncogene Meq expression in infected cells in vaccinated and unvaccinated 2023年第年第年第年第8期期期期（总第总第总第总第313期期期期）文献综述文献综述文献综述文献综述 97 hosts.Vet Microbiol.2020,248:108821.8 Dunn JR,Reddy SM,Niikura M,et al.Evaluation and Identification of Mareks Disease Virus BAC Clones as Standardized Reagents for Research.Avian Dis.2017,61（1）:107-114.9 Su S,Cui N,Li Y,et al.Increased Horizontal Transmission of Recombinant Mareks Disease Virus Due to Reticuloendotheliosis Virus Long Terminal Repeat Is the Major Competitive Advantage of the Virus Being a Prevalent Strain.Front Microbiol.2019,10:2842.10 Sun P,Cui N,Liu L,et al.Attenuation of a recombinant Mareks disease virus lacking the meq oncogene and evaluation on its immune efficacy against Mareks disease virus.Poult Sci.2020（4）:1939-1945.11 Li X,Zhao C,Han B,et al.Gga-miR-181a modulates ANP32A expression and inhibits MDCC-MSB-1 cell.In Vitro Cell Dev Biol Anim.2021,57（3）:272-279.12 Cui Y,Xu J,Cheng M,et al.Review of CRISPR/Cas9 sgRNA Design Tools.Interdiscip Sci.2018,10（2）:455-465.13 杨明珠,陈晓春,宋佳诚,等.重组动物疱疹病毒活载体疫苗的构建与应用研究进展J.中国畜牧兽医,2022,49（1）:338-351.14 Eric Murillo-Rodrguez,Rocha N B.The End of Snoring Application of CRISPR/Cas9 Genome Editing for Sleep DisordersJ.Sleep and Vigilance,2018,2（1）:13-21.15 滕蔓,郑鹿平,刘金玲,等.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建马立克病病毒超强毒株原癌基因meq缺失株及其鉴定J.病毒学报,2020,36（4）:675-684.16 王金萍,路宏朝,张涛,等.CRISPR/Cas9技术在鸡抗病毒感染中应用的研究进展J.黑龙江畜牧兽医,2022（4）:28-34,41.17 张秀梅.利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建MDV疫苗株rMDV-LTR的Meq基因缺失株及Knock-in平台的条件摸索D.南宁:广西大学,2022.18 Reddy VRAP,Sadigh Y,Tang N,et al.Novel Insights into the Roles of Bcl-2 HomologNr-13（vNr-13）Encoded by Herpesvirus of Turkeys in the Virus Replication Cycle,Mitochondrial Networks,and Apoptosis Inhibition.JVirol.2020,94（10）:e02049-19.19 Zhang Y,Luo J,Tang N,et al.Targeted Editing of the pp38 Genein Mareks Disease Virus-Transformed Cell Lines Using CRISPR/Cas9 System.Viruses.2019,11（5）:391.20 Zhang Y,Tang N,Luo J,et al.Mareks Disease Virus-Encoded MicroRNA 155 Ortholog Critical for the Induction of Lymphomas Is Not Essential for the Proliferation of Transformed Cell Lines.J Virol.2019,93（17）:e00713-19.21 Jia W,Zhang X,Wang H,et al.Construction and immuneefficacy of a recombinant turkey herpes virus vaccine strain expressing fusion protein of genotype VII New castle disease virus.Vet Microbiol.2022,268:109429.22 Chang P,Ameen F,Sealy JE,et al.Application of HDR-CRISPR/Cas9 and Erythrocyte Binding for Rapid Generation of Recombinant Turkey Herpes virus-Vectored Avian Influenza Virus Vaccines.Vaccines（Basel）.2019,7（4）:192.23 朱志坚.miR-M2-5p调控马立克病病毒促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的机制研究D.雅安:四川农业大学,2020.24 Yang S,Liao Y,Zhang S,et al.Mareks disease virus encoded miR-M6 and miR-M10 are dispensable for virus replication and pathogenesis in chickens.Vet Microbiol.2021,262:109248.25 Sun A,Yang S,Luo J,et al.UL28 and UL33 homologs of Mareks disease virus terminase complex involved in the regulation of cleavage and packaging of viral DNA are indispensable for replication in cultured cells.Vet Res.2021,52（1）:20.（收稿日期：2022-10-31）（上接93页）常温保存效果的影响J.西北农业学报,2017,26（6）:820-826.10 杨国峰,贺佳仪,王长康,等.牛磺酸的生理功能及其在畜禽生产中的应用J.饲料研究,2022,45（1）:141-144.11 孙琪.不同抗氧化剂对猪精液常温保存的影响D.哈尔滨:东北农业大学,2009.（收稿日期：2023-01-30）