阳虚型功能性胃肠病肠道菌群的差异性研究.pdf

现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 临床经验阳虚型功能性胃肠病肠道菌群的差异性研究钟伟琴，李丙生，许岸高【摘要】目的观察阳虚型功能性胃肠病患者与平和型健康者的菌群差异性，为功能性胃肠病的中医中药治疗提供客观依据。将中医体质理论与现代肠道微生态理念结合起来为中西医结合“精准”治未病的未来研究提供部分参考。方法本次试验研究阳虚型功能性胃肠病患者与平和型健康者的菌群差异性。以健康志愿者和功能性胃肠病患者为研究对象，建立中医证候诊断，按照实验的纳入和排除标准筛选志愿者分为阳虚型实验组与平和型对照组，收取志愿者的大便样本（）放入无菌容器内，于 小时内放入 冰箱内冷藏待检。提取粪便菌群总 ，使用 高通量测序检测粪便肠道菌群的丰富度及多样性，进行统计学分析出两者间肠道菌群结构的差异性。结果阳虚型功能性胃肠病患者与平和型健康人的肠道菌群丰度和多样性有一定变化，差异是不具统计学意义的（）。从阳虚型功能性胃肠病患者与平和型健康人两组志愿者的肠道菌群结构方面来看，在门水平上，两组肠道菌群的优势菌门主要均为：变形菌门，厚壁菌门，拟杆菌门。在属水平上，阳虚型功能性胃肠病患者菌群中对机体有益的乳球菌属（）、链型杆菌属（）数量明显不足（），表明阳虚型功能性胃肠病肠道菌群结构存在一定变化，且背向于机体有益方向发展。结论阳虚型功能性胃肠病肠道菌群结构存在一定变化，且背向于机体有益方向发展。其变化具有显著统计学意义。【关键词】肠道菌群；功能性胃肠病；体质辨证；高通量测序中图分类号：文献标志码：作者单位：广东省惠州市第一人民医院消化内科；广东省惠州市医学研究所通信作者：钟伟琴，：；李丙生，：；许岸高，：基金项目：广东省自然科学基金（）；惠州市科技计划项目（；）肠道微生物是寄生在我们肠道的一个庞大而复杂的微生态系统，肠道微生物自身以及它的代谢产物可以对人体健康进行调节 ，也可以在饮食和宿主之间起到一个重要的连接作用。肠道菌群的组成、种类、数量及其稳定性与遗传因素 、性别、分娩方式 、饮食结构 、生活环境、身体健康状况 等多种因素密切相关，其中，膳食因素被认为是最重要的因素之一，也是最容易被调控的因素 。随着年龄的增长，肠道菌群的数量、种类逐渐增多直至成年后形成一个复杂而稳定的微生态系统，继而随着机体老化，肠道微生态稳定性逐渐变差，这也是老年人容易患病的原因之一。大量研究表明，肠道菌群作为疾病的“晴雨计”，是潜在的疾病标志物 ，肠道微生态失调是“万病之源”。因此，肠道菌群动态平衡与人体健康而已至关重要。功能性胃肠病（）是由环境 、精神心理 、生理和社会因素相互作用而产生的一组功能性胃肠道疾病 。目前我们仍无法通过器质性疾病解释 的临床特征，认为它可能是由饮食、运动障碍、胃肠道动力失调、肠道菌群失调、内脏高敏感、黏膜免疫功能紊乱、中枢神经系统功能改变等众多因素交互作用，从而产生了各类临床症状 。但越来越多的研究开始发现 的确存在一些器质性的改变，新的罗马标准重新定义它为一种脑 肠相互作用、脑肠互动障碍的疾病 。肠道菌群作为脑 肠互动的重要环节 ，其与 发生、发展存在密切联系，菌群干预 治疗 也被越来越多的学者们重视。根据中医理论，体质是人体在先天遗传影响和后天获得的基础上发育形成的相对稳定特征。其中除了平和质外，其他 种体质都属于偏颇体质 。人体是一个有机整体，各脏腑组织间及其与外界环境之间始终保持着即对立又统一的相对动态平衡状态，从而维持着机体的正常生命活动。这种平衡状态一旦遭到破坏又不能及时自我调节时机体就会生病 。肠道菌群作为寄生在人类肠道的“神秘器官”，与人类保持着互惠互利的共生关系 ，一旦这种关系被破坏终将致病，故肠道菌群失调被认为是“万病之源”。而人体体质作为人类生命活动的一种重要形式，受先天以及后天的共同作用，与疾病和健康也有着密切关系，体质偏颇被指为“百病之因”。既然肠道菌群失调与体质偏颇都是人体健康和疾病的重要枢纽，那么通过在疾病中维持肠道微生态平衡和调节体质偏颇来维系健康、治愈疾病或许可以为很多疾病治疗提供新方向。阳虚质是指的人体因阳气不足，而以虚寒为主要特征表现的一种体质状态。其成因与天赋不足、养育不当等先天因素及个人习惯、生活环境、疾病影响等后天因素密切相 现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 关，这与肠道菌群的结构及其稳定性与遗传因素、饮食结构、生活环境、身体健康状况等多种因素密切相关的特点如出一辙。而且阳虚质发病易倾向于精神 食欲不振、腹泻、完谷不化、大便糖稀、腹部胀痛等病症，与功能性胃肠病患者病症相差无几。目前在国内外少有将功能性胃肠病与体质辨识、肠道菌群联系起来做回顾性研究。故而本文初步探索阳虚型体质功能性胃肠病患者与平和型健康者的菌群差异性，为功能性胃肠病的中医中药治疗提供客观依据。将中医体质理论和现代肠道微生态理念结合起来为中西医结合“精准”治未病的未来研究提供部分参考。对象与方法 对象按照实验纳入与排除标准筛选 例志愿者作为受试对象 。例均符合以下条件。纳入标准：年龄为 岁，不限性别；正常（），营养状态良好；住惠州半年以上，生活习惯良好，月内保持日常饮食 饮食幅度变化不大；志愿者在开始实验的一个月内无发生任何疾病，实验期间无饮用酸奶、益生菌制剂，无使用抗生素等可能影响肠道菌群的药物或接受其他治疗的情况；个月内未参与其他实验研究，采样全程符合医院伦理委员会要求。其中 阳虚质患者纳入需半年以上有反复腹胀 腹痛 便秘 腹泻 餐后饱胀 早饱感 腹部烧灼感等腹部不适症状，伴有或不伴有恶心、嗳气、呕吐等，经“中医体质辨识量表”评估及中医科门诊诊查后符合阳虚型体质；健康人平和质纳入需半年以上无反复腹胀 腹痛 便秘 腹泻 餐后饱胀 早饱感 腹部烧灼感等腹部不适症状，伴有或不伴有恶心、嗳气、呕吐等，经“中医体质辨识量表”评估及中医科门诊诊查后符合平和质型体质。排除标准：其他中医证候者；具有严重胃肠道疾病者：炎症性肠病、肠易激综合征、慢性腹泻或便秘、胃肠道恶性肿瘤等；有重大手术史者（如胃肠切除术 肠道狭窄 梗阻 穿孔 癌变倾向者）；存在活动性感染：如肝炎病毒、病毒、感染等；近 个月内曾去过疫区；不洁性行为、使用违禁药物；妊娠及哺乳期妇女、烟酒嗜好者、对多种药物过敏 过敏体质者；近 个月内曾使用抗菌药物、质子泵抑制剂，服用益生菌、益生元、合生元制剂等；家族性自身免疫性疾病（如炎症性肠病、型糖尿病、慢性淋巴细胞性甲状腺炎（桥本病）、毒性弥漫性甲状腺肿（病）、类风湿关节炎等）近期使用过免疫抑制剂或化学药物。本实验在开始前已通过惠州市第一人民医院伦理委员会审查、批准，受试者在参与实验前均已阅读并签署实验知情同意书。方法实验仪器：低温冰箱、低温冰箱、低温冰箱、电子天平 、移液器、高压灭菌锅、低温高速离心机 、涡旋混合器 、凝胶成像系统、电泳仪 。实验试剂：、氯仿 异戊醇（）、酚 氯仿 异戊醇（）、异丙醇、无水乙醇、引 物、凝 胶 回 收 试 剂 盒、（溴化乙锭）、西班牙琼脂糖、。实验过程及取材：按照实验纳入与排除标准筛选志愿者共 例，记录志愿者的一般情况，主要包括姓名、年龄、性别、身高、体重、联系电话及收集标本日期。对于符合实验要求的志愿者，收集其粪便标本。采集步骤由专人统一规范讲解，具体步骤如下：排便前先解干净小便，避免尿液污染标本；排便至干净的盒子里，采集标本前先清洁双手，用统一发放的无菌粪便取样器截取样本中段里部新鲜粪便样本 左右浸泡在装有细胞保存液的试管中，采集标本后在 小时之内交给实验负责人，在 小时之内储存在 超低温冰箱中保存。本实验主要为回顾性研究，根据实验纳入与排除标准分为实验组阳虚型功能性胃肠病患者（组）及健康组平和质健康人（组）。受试者要求生活习惯良好，月内保持日常饮食 饮食幅度变化不大；在开始实验的一个月内无发生任何疾病，实验期间无饮用酸奶、益生菌制剂，无使用抗生素等可能影响肠道菌群的药物或接受其他治疗的情况；经“中医体质辨识量表”评估及中医科主任门诊诊查后符合体质类型。将收集的标本进行 测序：提取粪便标本总 、文库构建（扩增）、扩增产物回收、文库浓度和大小检测、上机测序，最后进行微生物信息数据的获取。微生物数据分析对所得数据主要进行 多样性分析、多样性分析及肠道菌群群落结构组成及差异性分析。首先利用 软件计算样品的 多样性指数的值，并做出相应的稀释曲线。再用 通过利用系统进化的信息来比较样品间的物种群落差异进行 多样性（）分析，检验不同标本的物种多样性差异。最后用 统计软件分析数据。对数据进行正态性及方差齐性检验，若两组间符合正态分布且方差齐，采用配对样本 检验；若不符合正态分布则使用非参数检验，其中 为差异有统计学意义，为差异有显著统计学意义。计量资料若符合正态分布用均数 标准差（珋 ）表示，若不符合正态分布资料则用中位数（四分位数间距）（）表示，计数资料用百分数表示。结果 受试者一般资料本次课题实验共招募 名志愿者，其中排除 名志愿者的不合格标本（标本污染），共纳入 名志愿者。受试对象基本信息如下表 所示。现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 表 受试对象基本资料受试对象基本情况 年龄（岁）性别（男 女）身高（）体重（）注：正态分布计量资料以均值 标准差（珋 ）表示。高通量测序基本数据本研究选取来自 （阳虚患者）、（平和质健康人）两组，个志愿者共 份粪便标本，提取其总 后采用 测序平台进行测序获得的 ，不同样本对应的 数量差距较大，为避免样品数据大小不同对分析时产生偏差，我们将样品的测序深度尽可能提升后，再对每个样品进行随机抽平处理。如果测序深度用 多样性指数来衡量，指数是指实际测检的 数量，指数则是用于估算样品 的总数。分析得出结果如下图 所示。从图 的稀释曲线中可以看出，随着测序条数的增加，的数目从迅速增加到逐渐趋于平缓，在测序量增加到一定数目后，继续增加测序数量并不能发现更多新的物种，表明了本次样本序列量充分，已经达到足够的深度。图 样品物种丰富度 指数稀释曲线图注：横坐标指的是某样品中随机抽的 数目，纵坐标则是某样品的物种多样性（）；图中每一条曲线代表一个样品，随着测序深度的增加，当曲线趋于平缓时表示此时的测序数据量比较合理；若曲线趋于上升趋势，则表示测序深度不够，还需要增加测序量。多样性分析 稀释性曲线由上我们已经知道足够的测序深度能反映样本中大多数细菌的多样性信息，在测序深度足够的情况下即使增加测序条数，数量也不再增加。我们利用 软件和 语言工具依据各样品的测序量在不同测序深度时的 指数（反映样品中微生物多样性的指数），绘制出 指数稀释曲线（如图 ）同样得出了上述结论。多样性指数分析分别对 的各个指数进行秩和检验分析（若两组样品比较则使用 中的 函数，若两组以上的样品比较则使用 中的 函数），对不同条件下显著差异的 指数进行秩和检验筛选得出了表 。图 指数稀释曲线表 指数差异检验 （）（）注：第一行 是 指数；第二行 是 指数对应的秩和检验的 值；第三行至第 行分别为 组样品的均值。现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 多样性分析有多种衡量指标，常用的有 指数、指数、指数、指数。其中 指数、指数是衡量菌群丰度的指标，反映了群落中物种的总数。指数、指数反映的是菌群结构的多样性。由表 我们做出组间 多样性盒形图（图 ）。图 组间 多样性盒形图根据 多样性分析发现，图 样本的 指数明显下降（小于 ），表明阳虚型功能性胃肠病患者与平和型健康人的细菌丰度有明显差异，具统计学意义；而 指数及 指数未见明显下降（），表明阳虚型功能性胃肠病患者与平和型健康人的细菌多样性无明显差异。上述结果表明：阳虚型功能性胃肠病患者与平和型健康人的肠道菌群丰度有明显差异，而多样性无差异（如表 ，图 ）。多样性分析 分析下图 的 图中，橘色代表平和质健康人（组）样本分布情况，蓝色代表阳虚型功能性胃肠病患者（组）样本分布情况，各样本在图中的距离越近，菌群的相似度越高。我们可以直观地看出，两者的肠道菌群有聚集也有分散，但该图不能得出具体统计学结论，我们还需借助其他方法进一步分析。图 分析图 分析因上述 分析中未对不同分组的样本点之间的差异是否显著做出相应的统计检验结论，故而我们对不同分组的样品之间 多样性是否显著差异采用 分析进行检验。如下图 ：图 分析图图 表明本次实验组阳虚型功能性胃肠病患者与对照组平和型健康人肠道菌群组间和组内菌群结构无明显差异；值为 ，表明该检验可信度不高。肠道菌群群落结构差异性分析 门水平的差异分析在门水平上对 份样本进行分析，两组志愿者标本在门水平主要被划分为以下十五个门：拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌 门、梭 杆 菌 门、放 线 菌 门、疣 微 杆 菌 门、互 养 菌 门、广古菌门、糖化细菌门、黏胶球形菌门、脱铁杆菌门、蓝 细 菌 叶 绿 体 细 菌 门、芽单胞菌门、热脱球菌门、其他细菌门。两者肠道菌群中主要优势菌门均为：厚壁菌门，拟杆菌门，变形菌门，两组标本中以上三个菌门占比均大于 ，见下图 、图 。现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 图 不同分类水平中不同 的物种 柱状图 属水平的差异分析通过秩和检验可以找出在不同组间有明显差异的属共 个，显著性筛选的阈值为 ，同时对所有的 值进行了 校验，结果在 列（如下表 ）。图 样品门分类水平中物种 柱状图表 差异显著物种列表 （）（）（）（）注：第 列是物种名称；第 列至第列分别为组样品均值；第列是秩和检验的 值；第列是 值；第列至第列分别为组样品 （丰度）的中位值。根据每组样品的均值或中位值判断富集信息，根据各样品的秩计算 值，值与均值及中位值无直接关系图 样品属分类水平中物种 柱状图 由上可知，两组志愿者标本在属水平 上 乳 球菌属（）、链型杆菌属（）差异具有统计学意义（），在上述两种属类水平表达上，组（平和质健康人组）比 组（阳虚型功能性胃肠病患者组）有明显优势。乳球菌被公认安全的食品级微生物（，），目前广泛使用于乳制品和植物产品中。而链型杆菌属 ，则被证实了在高心血管风险的患者、终末期肾病患者、慢性功能性便秘患者肠道中此菌显著减少缺失。由此可见平和质健康人菌群比阳虚型功能性胃肠病患者菌群拥有的益生菌更多。讨论本次实验观察研究阳虚型功能性胃肠病患者与平和型健康者的菌群差异性。由于饮食习惯、年龄、地理位置、甚至种族等各种原因都会影响肠道菌群的数量及结构，本次实验为了减少可能影响肠道菌群的原因，我们主要纳入住于惠州地区半年以上，年龄介于 到 岁的人群，不限性别，志愿者 均控制在正常范围内，且符合没有饮用酸奶等益生菌制剂及长期饮茶习惯，饮食作息习惯正常，无消化系统相关疾病等要求。个体差异也可能对肠道菌群造成影响，但本次实验使用自身前后对照的难度大，难以消除。按照实验的纳入与排除标准筛选志愿者，前期实验共收取 例标本，排除不合格标本 例，最终收集 名志愿者粪便标本，阳虚型实验组与平 和 型 对 照 组 各 例，提 取 粪 便 总 ，进 行 高通量测序检测粪便肠道菌群，其多样性分析结果显示：第一，阳虚型实验组与平和型对照组肠道菌群丰度及多样性有一定改变，但差异无统计学意义；第二，阳虚型功能性胃肠病患者肠道菌群结构存在一定变化。功能性胃肠病（）也称肠 脑互动异常 ，在消化门诊非常常见，可占消化科门诊就诊比例的 。它的主要症状包括餐后饱胀、早饱、嗳气、食欲不振、恶心和呕吐、上腹痛等，且常常与其他上消化道或下消化道疾病症状重叠 ，。患者常四处就医，重复检查但无定论或明显疗效，给个人和社会带来巨大经济负担。有学者根据最新的罗马 诊断标准，研究考察了多国一般人群中 的发病率以及健康损害累积效应。实验中 名成人志愿者参与研究，其中 人完成了调查。研究发现：有 症状的人数 人（），其中 的症状人群有多个症状；多症状人群精神及躯体状态差、生活质量 现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 差、需要药物治疗并且腹部手术的风险提高；多症状功能性肠胃病患者的生活质量得分显著低于器质性胃肠疾病患者 。可见它症状持续、迁延及重叠，经常严重影响患者的学习、工作、生活、心理健康和生活质量。所以尽早识别功能性胃肠病以及它的亚型并给予有效干预，能够尽可能的提高患者的生活质量。目前认为诸如多潘立酮、莫沙必利类的促动力药物可对胃肠道平滑肌收缩进行刺激，从而促进胃排空，加快小肠和大肠之间地传输，对餐后早饱等不适症状起到有效疗效，已经被认 为 是 的 经 验 性 用 药 。也 有 研 究 表 明，低 饮食 （分别是可发酵的、低聚糖、双糖、单糖和多元醇，是一些难以消化的碳水化合物的整合）可以帮助 患者更好地控制症状。而研究表明 患者肠道中存在菌群种类及数量的异常，通过使用肠道微生物制剂或抗生素来改善患者症状被证实是有效的。其中益生菌或许是通过对肠道粘膜形成保护、释放化学物质、产生免疫因子、抑制炎症反应的产生等等来减轻患者不适症状 。关于体质辨识层面探索功能性胃肠病与肠道菌群变化的研究，特别是阳虚型功能性胃肠病的相关研究在国内外均不多，大多数是对某个具体症状层面研究肠道菌群变化，且各研究结果存在一定差异。功能性胃肠病作为一组慢性、波动性发作的症候群，其主要症状常与其他上消化道或下消化道症状重叠。把它作为一个疾病状态的整体去研究或许更好。而中医整体观念下，研究患者的不同体质、中医的脏腑、形神与肠道菌群的关系也许能为功能性胃肠病中医辨证分型及中医中药治疗提供客观依据。本次人体实验的研究发现，变形菌门，厚壁菌门，拟杆菌门这三菌门在阳虚型功能性胃肠病的占比均大于 。除此之外，我们还发现乳球菌属（）、链型杆菌属（）在 组（平和质健康人组）和 组（阳虚型功能性胃肠病患者组）菌群中差异具有统计学意义（），阳虚型功能性胃肠病肠道菌群结构存在一定变化，且背向于机体有益方向发展。其中乳球菌属（）、链型杆菌属（）等有益菌属数量明显缺失，这些结果也说明了体质偏颇下肠道菌群结构发生一定改变，初步阐明调节体质偏颇及维持肠道内环境平衡对功能性胃肠病治疗有帮助。本实验初步探索了阳虚型功能性胃肠病患者与平和型健康者的菌群差异。基于本次研究结果，可以初步了解人体肠道菌群失调在体质偏颇的体现。但是人体胃肠道的细菌是一个巨大而复杂系统，菌群的检测结果也受多种因素影响，因此，在条件允许的情况下，我们可以通过增加实验的样本量，适当延长实验时间，增加实验对照组，同时缩短粪便标本的取样时间间隔等方式，尽量达实验误差，增加实验结果可信度。总之，本次研究通过实验初步验证了调节肠道菌群、维持肠道菌群内环境稳定对功能性胃肠病患者治疗、康复有益。且通过中医调整体质偏颇或许对功能性胃肠病患者治疗有帮助。根本次实验结果，我们可以进一步对功能性胃肠病的不同中医辨证分型及中医中药治疗进行研究，将中医体质理论与现代肠道微生态理念结合为中西医结合“精准”治未病的未来研究提供部分参考。参考文献 王芹，等肠道微生物次级代谢产物及疾病治疗的研究现状 中国临床药理学杂志，（）：，（）：，（）：，：张星星，等亚健康状态人群肠道菌群结构明显失调：基于某医院 例护理人员分析 南方医科大学学报，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：王琦 以九体辨识为核心技术打造中医“治未病”健康工程升级版 天津中医药，（）：赵心源，朱燕波，李玉琼，等组态视角下中医体质与健康相关生命质量的关系研究 北京中医药大学学报，（）：，现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 ，（）：谭晓颖，张晓慧，许岸高饮用普洱熟茶对人肠道菌群的影响 临床消化病杂志，（）：，：，（）：，：，：，：，：，（）：，：，：，（）：，：（收稿日期：）（本文编辑：顾红祥）临床经验伴有幽门螺杆菌感染的胃肠炎患儿 细胞免疫应答及对疾病严重程度的影响李静，赵煜，张书红【摘要】目的探究伴有幽门螺杆菌（，）感染的胃肠炎患儿辅助性 细胞（，）辅助性 细胞 （，）细胞免疫应答及对疾病严重程度的影响。方法选取 年月至 年 月天津市儿童医院收治的 例胃肠炎患儿作为研究对象，根据 感染情况，分为重度组（）和非重度组（）。收集两组患儿临床资料，采用多因素 回归筛选胃肠炎患儿 重度感染的影响因素，构建列线图预测模型。通过相加交互模型分析高白细胞介素 （，）、干扰素 （，）水平对胃肠炎患儿 重度感染的交互作用，并使用受试者工作特征（，）曲线分析高 、水平以及二者交互作用对大 重度感染的诊断价值。结果 例胃肠炎患儿中 重度感染率为 （）。年龄、既往病史、爱啃手指、家庭成员肠胃病史、是胃肠炎患儿 重度感染的危险因素（）。定量和定性分析结果显示，高 、水平在胃肠炎患儿 重度感染风险中存在交互作用。分析结果显示，高 、水平二者协同作用对胃肠炎患儿 重度感染风险的诊断价值大于二者单独的诊断价值。结论 重度感染的胃肠炎患儿存在 失衡，以 反应占优势。【关键词】幽门螺杆菌；胃肠炎；免疫应答；白细胞介素 ；干扰素 中图分类号：；文献标志码：作者单位：天津市儿童医院消化科通信作者：李静，：基金项目：天津市科技计划项目（）幽门螺杆菌（，）感染与患者肠胃疾病的发生关系密切，且受地域、年龄及家庭环境等因素影响，在全球均有发生 。据调查显示 ，社会经济水平与 感染类有关，发展中国家感染率明显高于发达国家。早期感染 时症状不明显，具有较强的隐匿性，随着时间延长可使患儿逐渐出现恶心呕吐、腹痛、食欲降低等消化道症状；可通过释放尿素酶而引起细胞损害，激发机体产生剧烈炎症反应，若不及时进行治疗，可明显增加消化性疾病发病风险，同时还可能影响患儿正常生长发育，造成缺血、营养不良等后遗症，不利于患儿健康 。感染难以根治，反复发作更易