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纳米孔测序
11208120 杨文清

一、引言：
双螺旋结构的发现，遗传密码的破解，第一个完整基因组图谱的绘制⋯让科学家越来越多地认识到测序在生物学研究中的重要作用。从1977年Sanger和Coulson关于快速测序技术论文的首次发表，到2010年高通量测序的广泛应用，海量遗传信息被相继揭秘；从人类基因组计划，到人类基因组单倍型图计划，再到人类癌症基因组及个体基因组计划，人类对于自身的研究也日趋深入。千元基因组计划的提出，后基因组时代的到来。势必推动测序技术的突飞猛进，人类对于自然界的认识也必将走向一个新的阶段。
二、测序过程：
新型纳米孔测序法是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方法来进行高通量检测。此外，纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，所以测序的准确度非常高。对于长达1,000个碱基的单链 DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，根本无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜、快速地进行DNA测序成为可能。如 果对现有纳米孔测序法进行进一步发展和改进，那么它将有望成为第三代测序技术（也可称为下、下一代测序技术），从而帮助人们实现24小时内只花费 1,000美元完成二倍体哺乳动物基因组测序这一目标。
一个盛满电解质溶液的容器被一纳米孔膜隔成两半，如果施以比较小的电压，如约100mV电压，就能使用标准的电生理检测手段测量通过纳米孔的电流大小。很多生物电通道的开关都是靠小肽段分子是否堵塞通道来实现的。基于这个事实，加州大学圣克鲁兹分校的Deamer和哈佛大学的都不约而同地提出一个构想：如果DNA分子或者RNA分子也能堵塞某个通道，那么应该可以运用上述方法来检测电流。接下来，Deamer和 Branton等人证明了单链DNA和RNA分子能通过蛋白质组成的孔道，并且能检测到它们通过这种纳米级孔道时所造成的电流改变。他们使用的孔道蛋白是金黄色葡萄球菌α溶血素。这种蛋白以前曾被Bayley小组用作生物传感器。Bayley小组发现，α溶血素蛋白非常稳定，即使在接近 100℃的情况下也能维持正常的功能。Deamer和Branton等人发现，因为α溶血素蛋白孔径非常小，简直与单链核苷酸的直径相差无几，所以可以将折叠卷曲的核苷酸链解开，并仅允许它以单链的形式通过蛋白孔道。单链核苷酸分子穿过蛋白孔道时会造成局部电流改变，即相比没有分子穿过时的电流强度有所减小。基于这个现象，Deamer和Branton等人猜测，如果核酸分子中每一个核苷酸通过孔道时都能出现一种特定形式的电流改变，那么通过分析电流改变的情况不就能知道核酸的序列了吗？
为了验证这个想法，Deamer小组、Meller和Branton小组使用好几种不同的RNA分子和单链DNA分子进行了研究，以观察它们对电流的影响。结果发现，polyC RNA分子引起的电流强度下降比polyA RNA分子要强得多。此外，他们还发现，由30个A和70个C组成的RNA分子在序列从A转变成C时电流强度也会发生改变。不过不幸的是，这种嘌呤和嘧啶之间的明显差异没能在脱氧核糖核苷酸试验中发现。实际上，在RNA试验中观察到的polyA和polyC引起不同形式的电流改变是由碱基堆积和二级结构上的差异造成的。随后，使用不同DNA同聚物进行试验发现，脱氧嘌呤寡聚物和脱氧嘧啶寡聚物引起的电流改变差别并不大，只有不足5%。而且这种电流改变差异是由10~15个核苷酸（占据了α溶血素蛋白的跨膜区）引起的，它无法区别单个核苷酸引起的电流改变之间的差异。
虽然这些最初的纳米孔实验并没有获得预期结果，但它们至少显示出纳米孔在单分子技术方面的应用优势，例如高度的敏感性，同时也带动了纳米孔核酸分析 技术的研究热潮，并在理论及实验方面取得了一些成果。自从发现在电场力作用下，长达1000个碱基的单链DNA分子也能通过纳米孔之后，人们就更加坚信， 廉价的纳米孔测序技术一定会成为现实。
三、特点：
1. 获取较长的测序长度
纳米孔测序技术还有一个非常吸引人的优势，那就是测序距离长。因为纳米孔测序仪对通过的每个碱基进行测序，与前后的测序结果都无关。因此从原则上来 说，使用纳米孔测序技术，只要DNA链不发生断裂，并且能一直通过纳米孔，就可以一直检测下去。到目前为止，人们已经证明，长达25kb的ssDNA能够 一次性通过生物纳米孔，长达5.4kb的ssDNA能够一次性通过固态纳米孔。因此，如果检测技术能得到进一步的改善（能检测快速通过纳米孔的碱基），纳 米孔测序技术还是具有非常好的应用前景的。虽然现在还无法确切获悉纳米孔测序技术的准确度有多高，但可以确定插入、缺失等序列错误不会影响片段的读出长 度，因为相移在独立的单分子读序中并不是一个问题。只要所测序列是随机的，而不是系统的或具有位点依赖性的，那么足够高的序列覆盖率便可以保证任何水平的准确度。
此外，虽然目前的第二代测序仪的测序长度较短，但它们具有高通量的优势，因此可以将纳米孔测序技术和这些第二代测序技术结合起来，以弥补第二代测序仪在测序长度方面的不足。
考虑到在未来的测序技术发展趋势中，测序长度是至关重要的一个指标，因此还需要进一步研究，以弄清纳米孔测序技术在检测ssDNA时测序的极限长度 是多少。纳米孔测序技术在检测单链寡聚物（不到50个碱基）时可以进行高通量检测，此时核酸链通过α溶血素纳米孔的速度大约是5.8个低聚物/sec μM。因为核酸链大分子穿过纳米孔的速度与其在溶液中的摩尔浓度有关，而摩尔浓度又不能太高以免溶液太粘稠，因此还需要进行试验验证50kb长的 ssDNA是否能以一个合适的速度通过纳米孔。
2. 控制DNA通过纳米孔
DNA高速通过纳米孔的特性使得高速测序成为可能，但同时这种高速度也正是很多纳米孔测序技术的“阿喀琉斯之踵（意即弱点）”。因为速度太快，检测的信号质量就不高，甚至很多小的信号根本就检测不到。在120mV的条件下，DNA会以每个碱基 /1μs~20μs的速度通过α溶血素纳米孔。这就需要探测器的检测带宽达到MHz级，才能检测到皮安级的电流强度。
当DNA在电泳作用下通过纳米孔时，由于扩散作用的影响，降低了测序的质量。由于DNA分子的随机运动使得它通过纳米孔的时间，即通过时间的跨度非常大（这一点从理论上和试验上都已经证实了），因此，人们无法判断有多少碱基通过了纳米孔。而且，由于跨孔DNA分子与纳米孔表面间存 在的非特异性的相互作用还会受到非连续性的粘滑现象影响，所以相互作用会发生改变。这种相互作用改变的本质和频率会引起“逃避时间，解离时间）”发生非泊松分布，于是，同一种碱基分子通过纳米孔时的通过时间也会不同。而且，如果碱基分子通过纳米孔的时间小于平均通过时间，那么它极有可 能被漏检。
鉴于此，对于纳米孔测序技术来说，最为重要的一点就是如何控制并减慢DNA分子通过纳米孔的速度，同时尽量消除由于纳米孔表面相互作用给DNA分子跨孔动力学上造成的波动现象。降温和增加溶液的粘稠度可以在一定程度上减慢DNA分子通过纳米孔的速度，但这两种方法都不能消除因纳米孔表面相互作用造成 的跨孔动力学波动现象。
四、遇到的问题：
当单链DNA穿过生物纳米孔道或固态纳米孔道时检测电流。尽管如上所述，已经有试验清楚证明了可以通过检测电流强度改变的情况来区分不同的多聚核苷 酸分子，但到目前为止，还没有一种生物纳米孔或人工纳米孔能有一个非常合适的几何学结构，可以让人们在多聚核苷酸分子穿过纳米孔时检测单个核苷酸造成的电 流改变。人们目前可用的这些纳米孔都太长，没有一个长度短于5nm，而太长的纳米孔通道会造成一次有10~15个碱基的单链DNA分子穿过，所以无法对单个碱基分子进行检测。即使“无限短”的通道也无法达到所需的分辨率，这是由于电场区域决定了通道电子读出的区域，电场区域会向通道两侧各扩展大约一个通道 直径的长度。因为纳米孔的直径要能允许单链DNA分子（直径约1.5nm）通过，而电流的分辨率只能达到3nm，这就决定了只检测电流强度的变化无法达到 “空间”上的分辨率要求。而且单链核苷多聚物在150mV的电场中，以大约1个核苷酸/μs的速度通过纳米孔。但是要达到在皮安（pA）电流水平上检测单个核苷酸的精度就需要延缓单链核酸分子通过纳米孔的速度，至少要超过1msec以上。
五、总结：
如果纳米孔测序技术能够成功，那么它将是非常好的一种新的测序技术，因为它具有样品准备及其简单，不需要借助碱基，多聚酶，连接酶就能进行测序，而且测序长度可以达到10000-5000nt。因此，一个成功的纳米孔测序仪其测序费用应该非常低廉，极有可能达到NIH设定的只用1,000美元就能完成个人基因组测序的目标。同时，纳米孔测 序仪本身不会太贵。如果能在一个测序芯片上整合100个纳米孔以及相应的微流体系统和电子探针系统，那么对一个人类基因组进行六倍覆盖率的测序也只需要一 天的时间。不过，纳米孔测序技术还是面临着很大的问题。短期内的一个主要问题就是如何减慢DNA通过纳米孔的速度，使每一个碱基通过纳米孔的时间从微秒级 上升至毫秒级。
最近，有研究结果表明DNA酶处理能起到减缓的作用。如果纳米孔测序仪用到了溶血素七聚体，那么就还需要与之相配套的稳定载体。目前，这方面的工作 也取得了一定的进展。不过从长远来说，人工合成的固态纳米孔似乎更适合商用。人们可以通过监测隧穿电流或电容的改变来“读取”每一个通过纳米孔的碱基，不 过这种方法是否切实可行还需要进一步验证。还有一个一直存在的问题是：不论用哪种检测方法，DNA分子在通过纳米孔时发生的随机运动都会增加背景噪声。
综上所述，纳米孔测序技术具有非常诱人的应用前景，因此还得继续努力研究下去。而且随着研究的深入，我们越来越坚信，纳米孔测序技术一定会成功的。

杨文清
11208120