益气养阴活血法对特发性肺纤维化大鼠血管新生的影响.pdf

Western Journal of Traditional Chinese Medicine,2023 Vol.36 No.9中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 erator-activated receptor delta regulation of miR-15a in ischemia-induced cerebral vascular endothe-lial injury J.J Neurosci，2010，30（18）：6398-6408.12 YU J，WANG W N，MATEI N，et al.Ezetimibe Attenuates Oxidative Stress and neuroinflammation via the AMPK/Nrf2/TXNIP PAthway after MCAO in rats J.Ox-id Med Cell Longev，2020，2020：1-14.13 LU C，DU X，HE X L，et al.Neuroprotective effect of active components of Xiaoxuming decoction on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats during early recovery period J.Chin Pharmocol Bull，2016，32（7）：938-94414 张艾嘉，王爽，王萍，等.缺血性脑卒中的病理机制研究进展及中医药防治 J.中国实验方剂学杂志，2020，26（5）：227-240.15 朱根福,叶譞斐,陈根成.益气活血法治疗中风恢复期临床疗效观察 J.西部中医药，2014，27(7):64-66.16 张彥红，朱磊，陈杰，等.益脑康对动脉粥样硬化性缺血中风大鼠脑组织和血液ICAM-1表达的影响 J.中医药临床杂志，2013，25（7）：568-570.17 缪培，张通，米海霞.基于线栓法大鼠大脑中动脉闭塞的局灶性脑缺血模型的比较研究 J.中国康复理论与实践，2016，22（10）：1190-1195.18 SUN Y Y，YANG D，KUAN C Y.Mannitol-facilitated per-fusion staining with 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride（TTC）for detection of experimental cere-bral infarction and biochemical analysis J.J Neu-rosci Methods，2012，203（1）：122-129.19 武岳，于卉影.自噬对持续性正加速度暴露大鼠Beclin-1、LC3-表达水平及学习记忆、行为能力影响研究 J.临床军医杂志，2020，48（2）：137-140.20 孔志伟，姚婷婷.自噬相关基因Beclin1和LC3与子宫内膜异位症的研究进展 J.医学综述，2019，25（21）：4166-4173.21 LIPPAI M，LW P.The role of the selective adaptor p62 and ubiquitin-like proteins in autophagyJ.Biomed Res Int，2014，2014：832704-832714.收稿日期：2023-02-18*基金项目：国家自然科学基金（81904104）；广东省中医药局科研基金（20211203）；广州中医药大学2017年高水平大学建设计划（A1-AFD018171Z11096）；广东省中医院中医药科学技术研究专项（YN2018ZD07）。作者简介：邓敏贞（1987），女，博士学位，副研究员。研究方向：脑病的中医药治疗。通讯作者：孙景波（1962），男，博士学位，研究员。研究方向：脑病的中医药治疗。益气养阴活血法对特发性肺纤维化大鼠血管新生的影响陈炜，张念志，胡梦娟安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031摘 要 目的：研究益气养阴活血法对特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）大鼠血清低氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor，PEDF）和内皮生长抑制素（end-ostatin，ES）的影响。方法：将128只大鼠随机分为空白组、模型组、泼尼松组、参七虫草组，每组32只，采用气管滴注博来霉素方法进行IPF造模，第7、14、21、28天检测大鼠血清HIF-1、PDGF、PEDF、ES含量。结果：造模后第 7、14、21、28 天，模型组、泼尼松组、参七虫草组大鼠血清 HIF-1、PDGF、PEDF、ES 含量高于空白组（P0.01）；与模型组比较，泼尼松组与参七虫草组各时间点大鼠血清HIF-1、PDGF含量降低（P0.01），PEDF、ES表达升高（P0.01）；各时间点大鼠血清各指标泼尼松组与参七虫草组比较差异无统计学意义（P0.05）。结论：益气养阴活血法可干预IPF大鼠肺纤维化进程，机制可能与调节血管新生相关因子从而抑制血管新生有关。关键词 特发性肺纤维化；血管新生；益气养阴活血法中图分类号 R223.1+1 文献标识码 A 文章编号 2096-9600（2023）09-0014-05The Effects of Benefiting-Qi Nourishing-Yin Activating-blood Method on Angiogenesis in Rats with Idiopathic Pulmonary Fibrosis CHEN Wei,ZHANG Nianzhi,HU Mengjuan The First Affiliated Hospital of Anhui University of CM,Hefei 230031,ChinaAbstractAbstract Objective:To discuss the influence of benefiting-Qi nourishing-Yin activating-blood method on DOI：10.12174/j.issn.2096-9600.2023.09.0414中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 2023年第36卷第9期HIF-1,PDGF,PEDF and ES in rats suffering idiopathic pulmonary fibrosis(IPF).Methods:All 128 rats were randomized into the blank group,the model group,prednison group and Shenqi Chongcao group,with 32 ones in each group,tracheal dripping of bleomycin was adopted to carry out IPF modeling,to detect the contents of HIF-1,PDGF,PEDF and ES in rat serum on the 7th,14th,21st and 28th day.Results:On the 7th,14th,21st and 28th day,the contents of HIF-1,PDGF,PEDF and ES in the model group,prednison group and Shenqi Chongcao group increased,but higher than these of the blank group(P0.01);compared with the model group,the contents of HIF-1 and PDGF in prednison group and Shenqi Chongcao group were lower at different time points(P0.01).The contents of PEDF and ES of the model group,prednison group and Shenqi Chongcao group were higher than these of the blank group(P0.05).Conclusion:Benefiting-Qi nourishing-Yin activating-blood method could intervene the process of pulmonary fibrosis of IPF rats,and its mechanism might be related to regulating angiogenesis associated factors,thus inhibiting angiogenesis.KeywordsKeywords idiopathic pulmonary fibrosis;angiogenesis;benefiting-Qi nourishing-Yin activating-blood method特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fi-brosis，IPF）是一种病因不明的以肺间质纤维化改变为主的慢性疾患，临床发病率呈增长趋势。其起病隐匿，病因、病机尚不明确，目前尚无有效治疗方法，病死率高，IPF确诊后平均生存时间约35年1。临床常见的死亡原因多为IPF患者生理指标的急性恶化、感染、突发呼吸衰竭、心脏衰竭、急性冠状动脉综合征、静脉血栓栓塞性疾病等2。IPF患者存在广泛血管新生现象，血管新生是受促血管新生因子和抑制血管新生因子动态平衡调控，当肺组织受损，该平衡被打破，血管新生3。常见的促血管生长因子包括血清低氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）；色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor，PEDF）和内皮生长抑制素（endo-statin，ES）为血管新生抑制因子。当促血管生长因子分泌增加，动态平衡失衡，大量血管新生形成，加重肺纤维化；血管新生抑制因子高表达，则血管新生抑制，从而改善毛细血管通透性及肺部微循环，改善缺氧状态，抑制 IPF进一步发展4。血管新生已成为IPF防治的新靶点。IPF属中医“肺痿”范畴。笔者根据IPF患者的中医证候学特点，提出“肺失治节，因虚致瘀”理论。以肺肾气阴两虚为本，痰瘀阻滞肺络为标，故提出益气养阴活血法。本课题在既往研究的基础上，探讨益气养阴活血法对IPF大鼠血管新生相关因子的影响，明确调控靶点及其干预机制。1 资料与方法1.1动物SPF 级雄性 SD 大鼠 128 只，体质量（26020）g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK（鲁）2014-0007。大鼠于安徽中医药大学第一附属医院实验中心动物房饲养。1.2药品醋酸泼尼松片剂（浙江仙琚制药股份有限公司；批号：20180407，规格：5 mg/片）；参七虫草方（西洋参15 g，三七10 g，冬虫夏草3 g）来自安徽中医药大学第一附属医院中药房。盐酸博来霉素（125 mg，invitrogen，批号：1935037）。1.3分组、造模及给药将128只大鼠随机分为空白组、模型组、泼尼松组、参七虫草组，每组32只，每组4笼大鼠，一笼8只。采用气管滴注法造模5：10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔内注射，将大鼠仰卧固定于鼠板上，剪去颈毛，皮肤消毒。在颈部中间做一长约1 cm切口，分离暴露气管。用弯眼科钳稍微抬高气管，将含有5 mg/mL的博来霉素（5 mg/kg）注射器针头经两软骨环穿刺进气管快速给药，将大鼠直立并反复旋转810次。无菌操作缝合表皮。空白组以同样方法注射等量生理盐水造模。空白组、模型组均灌胃生理盐水（1 mL/kg d），泼尼松组灌胃泼尼松混悬液（3.5 mg/kg d），参七虫草组灌胃参七虫草方汤剂（0.38 g/kg d）。各组大鼠造模后第2天开始给药，连续28天。1.4取材与标本采集分别于造模后第 7、14、21、28天取材。先将大鼠腹腔麻醉，暴露腹腔腹主动脉，收集大鼠腹主动脉血样本，静置2 h，离心半径10 cm，3000 r/min离心10 min收集上清液，-80 冰箱保存备用。大鼠处死后迅速打开胸腔，分离肺组织，取左肺下叶固定于10%福尔马林溶液中备用。1.5指标检测1.5.1大鼠一般状态观察大鼠反应、呼吸状态、毛发、死亡情况等。1.5.2肺组织病理切片及血清 HIF-1、PDGF、PEDF、ES检测病理切片制作：从固定液中取出肺15Western Journal of Traditional Chinese Medicine,2023 Vol.36 No.9中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 组织，切块（2.0 cm2.0 cm0.3 cm），再在固定液中固定2 h，后用不同浓度乙醇脱水，脱水后的肺组织分别用二甲苯、透明，透明后浸蜡、包埋、切片，最后展片、贴片。HE染色：将制备好的切片脱蜡、复水，然后苏木精染色，乙醇分化见颜色变浅，漂洗，返蓝，乙醇脱水，伊红复染，再次脱水，最后二甲苯透明封片。Masson染色：将返蓝后的切片（步骤同HE染色）用丽春红品红染色液染色，再亮绿染色、增鲜、脱水、透明封片。酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）具体操作按照试剂盒说明书进行。1.6统计学方法应用 SPSS 21.0统计软件分析数据，符合正态分布的计量资料用x s表示，方差齐采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1大鼠一般状态空白组大鼠反应灵敏，活泼好动，呼吸正常，无爪甲紫绀，毛发光泽。模型组大鼠反应迟钝，呼吸急促，有痰鸣音，口鼻可见大量分泌物，爪甲紫绀，毛发枯槁，舌质紫暗。泼尼松组大鼠及参七虫草组大鼠反应及呼吸状态等优于模型组，参七虫草组状态更佳。实验中模型组死亡4只，泼尼松组死亡3只，参七虫草组死亡2只。2.2HE染色结果造模后第7、14、21、28天空白组大鼠肺组织结构完整，模型组大鼠肺泡间隔逐渐增宽，间质内炎性细胞逐渐减少，第21天炎性细胞较第14天少，第28天几乎未见炎性细胞。参七虫草组、泼尼松组病理改变与模型组相似，但程度较轻，以参七虫草组程度最轻。见图1。2.3Masson 染色结果造模后，空白组大鼠肺泡间隔未见蓝染区，模型组大鼠肺泡间隔均可见染成蓝色的胶原纤维沉积，颜色逐渐加深，蓝色区域面积逐渐增大，甚至整个显微镜视野下均为蓝染区；与模型组相比，泼尼松组、参七虫草组蓝染区面积较小，颜色较浅，纤维化程度较轻，参七虫草组改善最明显。见图2。2.4ELISA法检测结果2.4.1大鼠血清 HIF-1表达造模后，与空白组比较，模型组、泼尼松组、参七虫草组HIF-1含量均增高（P0.01）；与模型组比较，相同时间点泼尼松组与参七虫草组HIF-1含量降低（P0.01）；泼尼松组与参七虫草组比较差异无统计学意义（P0.05）。见表1。2.4.2大鼠血清PDGF表达造模后，不同时间点与空白组比较，模型组、泼尼松组、参七虫草组PDGF含量升高（P0.01）；与模型组相比，泼尼松组与参七虫草组PDGF表达降低（P0.01）；泼尼松组与参七虫草组比较差异无统计学意义（P0.05）。见表2。2.4.3大鼠血清PEDF表达造模后，各时间点，模型组、泼尼松组、参七虫草组PEDF含量高于空白组（P0.01）；与模型组相比，同时间点泼尼松组、参七虫草组PEDF表达升高（P0.01）；泼尼松组与参七虫草组比较差异无统计学意义（P0.05）。见表3。2.4.4大鼠血清ES表达造模后，各时间点，与7 d14 d21 d28 d空白组 模型组 泼尼松组 参七虫草组图2 各组各时间段大鼠肺组织病理学观察（Masson，400）空白组 模型组 泼尼松组 参七虫草组7 d14 d21 d28 d图1 各组各时间段大鼠肺组织病理学观察（HE，400）16中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 2023年第36卷第9期空白组比较，模型组、泼尼松组、参七虫草组ES含量上升（P0.01）；与模型组比较，同时间点泼尼松组、参七虫草组ES表达升高（P0.01）；泼尼松组与参七虫草组比较差异无统计学意义（P0.05）。见表4。3 讨论肺泡上皮损伤与修复是IPF发展过程中的重要组织病理改变。血管新生是机体愈合的重要组成部分，是肺组织广泛受损后机体修复的最初环节，而异常血管新生是肺部组织形成肺纤维化的重要驱动力。研究发现，IPF中微纤维化区毛细血管的密集程度较严重纤维化区域程度高，成纤维细胞中无血管组织分布，表明IPF早期血管新生程度较高，如果在肺部组织受损的早期能阻断异常血管新生，或许能够减轻肺纤维化发展，可为治疗IPF提供新理念5。HIF-1是机体调节氧平衡重要的氧敏感因子，其与正常细胞代谢、增殖、分化关系密切，也与炎症反应、血管新生密切相连6。肺纤维化过程中主要的病理特点是机体缺氧，而HIF-1是调控机体氧缺乏应激的“开关”，当机体血氧饱和度降低时，HIF-1高分泌，导致下游VEGF高表达，进而导致血管生成因子表达增加，新血管形成，促进肺纤维化7。PDGF是一种潜在转化生长因子，能使多种间质细胞增殖与趋化，通过促使这些细胞增殖、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）高表达，诱导血管新生。在机体修复过程中，因肺组织上皮细胞受损，缺血、缺氧，PDGF高表达，促使损伤的肺组织血管内皮表1各组大鼠干预第7、14、21、28天血清HIF-1表达（x s）ng/L组别空白组模型组泼尼松组参七虫草组鼠数32282930第7天10.650.5325.410.54*23.480.75*22.111.28*#第14天15.570.9630.500.34*25.131.65*23.770.55*#第21天17.261.8533.510.42*27.191.57*26.160.59*#第28天18.230.6436.140.81*27.810.63*27.050.81*#注：*表示与空白组比较，P0.01；表示与模型组比较，P0.01；#表示与泼尼松组比较，P0.05表2各组大鼠干预第7、14、21、28天血清PDGF表达（x s）ng/L组别空白组模型组泼尼松组参七虫草组鼠数32282930第7天23.412.3552.326.27*37.203.75*34.281.72*#第14天21.862.1040.754.27*29.983.48*28.8111.79*#第21天15.190.1338.365.54*28.034.37*23.981.26*#第28天13.252.6937.905.73*26.063.35*22.981.50*#注：*表示与空白组比较，P0.01；表示与模型组比较，P0.01；#表示与泼尼松组比较，P0.05表3各组大鼠干预第7、14、21、28天血清PEDF表达（x s）ng/L组别空白组模型组泼尼松组参七虫草组鼠数32282930第7天22.563.3759.069.55*94.6111.31*105.209.62*#第14天23.751.4757.108.81*91.2911.92*102.929.23*#第21天24.582.0148.894.82*89.155.94*98.008.45*#第28天25.693.1735.592.06*81.728.60*90.7711.61*#注：*表示与空白组比较，P0.01；表示与模型组比较，P0.01；#表示与泼尼松组比较，P0.05表4各组大鼠干预第7、14、21、28天血清ES表达（x s）g/L组别空白组模型组泼尼松组参七虫草组鼠数32282930第7天75.944.88136.8411.81*174.1210.40*180.9811.67*#第14天81.056.99133.9811.07*168.1415.99*174.1913.51*#第21天82.186.88129.239.80*160.0814.83*169.4322.44*#第28天84.635.82121.0710.26*151.4912.63*161.3811.78*#注：*表示与空白组比较，P0.01；表示与模型组比较，P0.01；#表示与泼尼松组比较，P0.0517Western Journal of Traditional Chinese Medicine,2023 Vol.36 No.9中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 细胞分泌大量VEGF，促进组织再血管化8。PEDF是一种血管新生抑制因子，研究发现在人和动物的成纤维化细胞中可见PEDF高表达，同时伴有 VEGF表达降低9。ES是广泛存在于血管外周基底膜的血管生成抑制剂，通过抑制血管内皮细胞增殖、迁移，促进内皮细胞凋亡从而抑制新生血管形成10。研究发现，与正常组比较，肺损伤患者肺泡灌洗液中ES表达水平升高，提示ES参与损伤肺组织的修复过程11。IPF多归于中医“肺痿”范畴，肺主治节，治理调节全身气、血、津液及脏腑生理功能12-13。IPF为肺脏慢性虚损疾患，病机多为本虚标实，本虚责之于肺气虚，肺失治节则气不化津且失于输布，痰浊内生，痹阻肺络；然肺为气之主，肾为气之根，肾主摄纳，乃为水脏，久则母病及子，由肺及肾，且肺肾乃金水滋生之脏，病久必然伤及肾阴，耗损肾气，导致肺肾气阴两虚。标实责之于瘀血内阻。肺主气，朝百脉而主治节，现肺气虚，肺失治节，一则运血无力，另则化津不足，阴虚津亏，血脉失养，脉络不畅，则滞而留瘀，痹阻肺络。虚瘀互结，日久肺脏虚损，津气耗伤，失却濡润以致肺叶枯萎。总之，肺肾气阴两虚是本病产生的内在基础，而肺失治节，因虚致实，瘀血阻滞肺络是其主要病理因素14。院内制剂参七虫草胶囊以益气养阴活血立法，其中西洋参为君，益气养阴，清热生津，能够补益肺肾气阴两虚，并祛虚火；冬虫夏草为臣，补益肺肾，化痰止血，药性考 载：“甘味性温，秘精益气，专补命门”；佐以化瘀止血之要药三七，止血不留瘀，化瘀不伤正，诸药合用，标本同治。前期研究发现参七虫草胶囊能调整IPF大鼠血清Th1/Th2细胞因子失衡；抑制肺泡上皮细胞间质转化过程和 MMP-9 与 TIMP-1 表达，减轻 IPF大鼠肺组织炎症及病理改变；改善免疫蛋白、血液流变部分指标、降低TGF-1与外周血骨桥蛋白表达，延缓肺功能恶化，改善患者生活质量15-16。本研究结果显示模型组血清 PDGF、PEDF、ES含量早期分泌旺盛，后期逐渐减少，HIF-1后期升高，可能与IPF患者后期严重缺氧有关，表明在IPF早期，肺泡壁不仅发生炎症反应，还伴随胶原纤维沉积、血管新生，早期炎症反应与血管新生表达旺盛。炎症是机体损伤后的应激反应，血管新生是肺组织纤维化修复的重要影响因素。与模型组比较，参七虫草组促血管生长因子分泌减小，血管新生抑制因子升高，HE染色、Masson染色示参七虫草组大鼠炎症反应及纤维化程度低于模型组。本研究结果显示，参七虫草组促血管生长因子含量降低，抑制因子表达旺盛，表明参七虫草方可能通过抑制促血管新生因子分泌、促进血管抑制因子表达而干预血管新生，从而达到延缓肺纤维化的目的。参考文献1OLSON A L，SWIGRIS J J.Idiopathic pulmonary fibrosis：diagnosis and epidemiologyJ.Clinics in Chest Medicine，2012，33（1）：41-50.2FRANKEL S K，SCHWARZ M I.Update in idiopathic pul-monary fibrosisJ.Current Opinion in Pulmonary Medicine，2009，15（5）：463-469.3HANUMEGOWDA C，FARKAS L，KOLB M.Angiogenesis in pulmonary fibrosis：too much or not enough？J.Chest，2012，142（1）：200-207.4陈炜，胡梦娟.中医药干预特发性肺纤维化血管新生相关通路研究进展 J.辽宁中医药大学学报，2018，20（10）：19-22.5龚玲，刘代顺.特发性肺纤维化发病机制及血管新生作用的研究进展 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