阴虚肠燥证便秘大鼠模型的建立及其评价.pdf

2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 阴虚肠燥证便秘大鼠模型的建立及其评价谢丽，陈冬梅，朱星珲，成词松（成都中医药大学基础医学院 成都 611137）摘要：目的采用“汗下复合法”复制阴虚肠燥证便秘大鼠模型，并从动物宏观表征、微观指征两个方面进行疾病模型和“以方测证”证候模型评价，为阴虚肠燥证便秘大鼠模型研究提供实验依据。方法筛选80只大鼠随机分为空白组、模型组、模型对照组、气虚方证组、血虚方证组、阴虚方证组、阳虚方证组、热秘方证组，每组10只。模型组和5个方证组大鼠采用汗下复合法（毛果芸香碱注射+大黄酸灌胃），模型对照组采用洛哌丁胺灌胃，连续造模14天。造模结束后，各方证组采用相应经典方剂进行干预治疗，即气虚方证组-黄芪汤、血虚方证组-润肠丸、阴虚方证组-增液汤、阳虚方证组-济川煎、热秘方证组-麻子仁丸，持续治疗4天。观察大鼠一般情况、24 h粪便颗粒数、5 h粪便含水量、结肠内粪便颗粒数、结肠黏液分泌变化，采用ELISA 法检测血清 VIP 含量、比色法检测血清 NO 含量、免疫组织化学法检测结肠 AQP3、AQP8 表达。结果疾病模型评价：模型组大鼠的被毛稀疏湿润，耳、鼻、唇、尾光泽暗淡，造模前期粪便稀溏而后期干硬，5 h粪便含水量、24 h粪便颗粒数明显低于空白组和模型对照组（P0.05），结肠内粪便颗粒数明显高于空白组和模型对照组（P0.01）。在微观指征方面，模型组大鼠的结肠组织杯状细胞数和阳性细胞表达面积都明显低于空白组和模型对照组（P0.01），血清神经递质（NO、VIP）含量、结肠水通道蛋白（AQP3、AQP8）表达明显高于空白组（P0.05）；证候模型的“以方测证”评价：阴虚方证组对5 h粪便含水量、24 h粪便颗粒数、肠内粪便颗粒数、结肠组织杯状细胞数和阳性细胞表达面积、血清神经递质（NO、VIP）含量、结肠水通道蛋白（AQP3、AQP8）表达的整体干预效果优于其它方证组。结论持续14天毛果芸香碱注射复合大黄酸灌胃的“汗下复合法”造模方法可以建立便秘阴虚肠燥证大鼠模型。关键词：动物模型 汗下复合法 便秘 阴虚肠燥证 大鼠doi:10.11842/wst.20220103005 中图分类号:R285.5 文献标识码:A便秘是临床常见病症，中医药治疗疗效确切1。阴虚肠燥证便秘是中医药行业标准 病证诊断疗效标准（ZY/T001.1-94）拟订的5个常见证型之一，动物证候模型复制方法目前主要是采用甲状腺素片混悬液复合洛哌丁胺灌胃2，或采用甲状腺素复合利血平模型灌胃3，从而模拟人类便秘肾阴不足、阴虚火旺病机，并且未见该类模型的“以方测证”研究报道。虽然阴虚肠燥证便秘在相关“诊疗共识意见”中也称为“阴虚秘”4，阴虚、肠燥也是便秘较为常见和重要的证候要素5，好发于老年人6、小儿7、熬夜人群8，但阴虚肠燥证便秘的证候特征为大便干结、状如羊屎、口干少津，证候病机主要是阴液亏虚、肠失濡润，而非肾阴不足或阴虚火旺。因此，本实验根据中医学“汗津同源”理论，从津液亏耗角度设计“汗下复合法”造模方法，采用毛果芸香碱注射复合大黄酸灌胃来复制阴虚肠燥证便秘大鼠模型，并对证候模型进行“以方测证”评价，以期为相关研究提供动物模型依据。1 材料与方法 1.1动物与分组筛选 SPF 级 SD 大鼠 80只，体质量（18020）g，分笼饲养。饲养条件：温度（201），湿度60%-70%，自 收稿日期：2022-01-03 修回日期：2022-05-25 通讯作者：成词松，教授，硕士生导师，主要研究方向：中医证候基础研究。1140 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝肠疾病研究动光暗控制（7 00-19 00光照，19 00-7 00暗置）。大鼠适应性饲养7天，根据体质量编号，随机分为8组：空白组、汗下复合法模型组（简称模型组）、洛哌丁胺模型组（简称模型对照组），以及5个“以方测证”组（气虚方证组、血虚方证组、阴虚方证组、阳虚方证组、热秘方证组），每组动物10只。本实验已经过成都中医药大学动物伦理审查会批准（编号2021-38）。动物生产许可证编号：SCXK（川）2020-030；动物环境许可证编号：SYXK（川）2017-179。实验过程中对动物的处置符合科技部发布的 关于善待实验动物的指导性意见 的规定。1.2模型复制在参考相关研究实验方案的基础上9-10，通过反复预实验观察，确定实验方案如下：模型组和5个“以方测证”组大鼠持续造模14天，其中，造模第1-7天在上午8 00进行大黄酸混悬液灌胃（每次120 mgkg-1）和毛果芸香碱皮下注射（每次 1 mgkg-1），造模第 8-14天在上午8 00降低大黄酸混悬液灌胃剂量（每次30 mgkg-1），同时增加毛果芸香碱皮下注射量次（每次1mgkg-1，每日3次，时间为8 00、12 00、16 00），造模期间轻度控制饮水，按正常大鼠平均饮水量（每天每只51 mL）的2/3投置饮水量（每天每只34 mL）；模型对照组大鼠在每天8 00采用洛哌丁胺混悬液灌胃（每次3 mgkg-1），持续造模14天，造模期间常规饲养；空白组大鼠常规饲养。1.3“以方测证”干预造模结束后，对5个“以方测证”组大鼠分别给予相应方药干预治疗，即气虚方证组-黄芪汤、血虚方证组-润肠丸、阴虚方证组-增液汤、阳虚方证组-济川煎、热秘方证组-麻子仁丸。灌胃剂量据“人与动物体表面积折算法”计算11，按70 kg成人日服生药量100 g计，根据经方配比折算如下：黄芪汤（太平圣惠方）：黄芪16 g、知母 8 g、石膏16 g、芍药8 g、麦门冬8 g、炙甘草 4 g、白茯苓 8 g、桂心 8 g、升麻 8 g、熟地8 g、人参8 g；润肠丸（沈氏尊生书）：当归20 g、生地 20 g、火麻仁 20 g、桃仁 20 g、枳壳 20 g；增液汤（温病条辨）：玄参38 g、麦冬31 g、生地31 g；济川煎（景岳全书）：当归38 g、牛膝15 g、肉苁蓉22 g、泽泻11 g、升麻7 g、枳壳7 g；麻子仁丸（伤寒论）：麻子仁 25 g、大黄 25 g、白芍 12.5 g、枳实 12.5 g、厚朴12.5 g、杏仁 12.5 g。200 g大鼠日服生药量=100561.8 g，折合药液量为0.9 ml/天，每日灌胃治疗前称取大鼠体重，根据大鼠体重变化进行干预治疗。中药水煎液制备：加10倍量水浸泡30 min，大火煮沸转文火煎煮 30 min，过滤后再加 10 倍量水，同法煎煮 30 min。合并两次滤液，文火煎煮浓缩至 2 gmL-1，药液置于4冰箱保存备用。连续灌胃治疗4天。模型组、模型对照组大鼠同步等量生理盐水灌胃，空白组常规饲养。1.4模型评价1.4.1宏观表征评价一般情况：观察大鼠精神状态，静息姿势，毛发、耳、鼻、唇、尾色泽，粪便性状等；排便情况：每天记录大鼠粪便颗粒数，测定5 h粪便含水量。用托盘电子天平称取大鼠粪便湿重，于电热恒温培养箱120烘烤8 h后称取粪便干重。粪便含水量=（粪便湿重-粪便干重）粪便湿重100%；结肠粪便颗粒数：治疗结束后，观察大鼠结肠内粪便颗粒数。1.4.2微观指征评价结肠黏液分泌状态：取大鼠结肠组织约 1 cm（距直肠3 cm处），固定、包埋、切片，经碘酸雪夫氏染色（PAS染色），观察结肠黏液分泌情况；血清神经递质：经腹主动脉取动脉血 5 mL，静置 30 min，离心（2000 rmin-1）10 min，取上清液，采用酶联免疫吸附测定 法（Elisa）检 测 血 清 血 管 活 性 肠 肽（Vasoactive intestinal peptide，VIP）含量，采用比色法检测一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量。结肠水通道蛋白表达：取结肠组织1 cm（距直肠4 cm处），采用免疫组织化学法染色后在光镜下观察水通道蛋白 3（Aquaporin 3，AQP3）、水通道蛋白8（Aquaporin 8，AQP8）表达。1.5设备与试剂硝酸毛果芸香碱，148-72-1，98%，成都化夏化学试剂有限公司；大黄酸，478-43-3，98%，成都化夏化学试剂有限公司；盐酸洛哌丁胺胶囊，H10910085，西安杨森制药有限公司；Rat VIP ELISA KIT，ZC-37398，96T，上海茁彩生物科技有限公司；一氧化氮（NO）测定试剂盒，A013-2-1，96T，南京建成生物工程研究所；AQP3，兔克隆抗体，1:200（浓度），AF5222，Affinity；AQP8，兔克隆抗体，1:200（浓度），DF9224，Affinity。1.6数据分析采用SPSS 23.0软件统计分析数据，计量资料以均值标准差（x s）表示，使用单因素方差分析，若不满足1141 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 方差分析条件，使用非参数检验分析。设定P0.05）；造模后，模型组大鼠的5 h粪便含水量、24 h粪便颗粒数明显低于空白组和模型对照组（P0.05），模型对照组与空白组之间具有显著性差异（P0.01）；动物处死后，模型组大鼠结肠内粪便颗粒数明显高于空白组和模型对照组（P0.01）。2.1.3大鼠结肠组织形态学评价表2显示，造模后，模型组大鼠结肠杯状细胞数量及阳性细胞表达面积都明显低于空白组和模型对照组（P0.01）。2.1.4大鼠血清神经递质含量及结肠水通道蛋白表达评价表3、4显示，造模后，模型组、模型对照组大鼠的血 清 神 经 递 质（NO、VIP）含 量、结 肠 水 通 道 蛋 白（AQP3、AQP8）表达明显高于空白组（P0.05）。2.2“汗下复合法”便秘的中医证候模型评价2.2.1“以方测证”的宏观表征评价表5显示，5组方药都可以改善模型大鼠5 h粪便含水量、24 h排便量、结肠内粪便颗粒数（P0.05）。2.2.2“以方测证”的结肠组织形态学评价表6显示，5个方证组大鼠杯状细胞数量和黏膜阳性细胞表达面积都明显高于模型组（P0.05）。图1显示，空白组大鼠结肠黏膜杯状细胞形态饱满、圆润，黏液分泌丰富；模型组、模型对照组大鼠结肠黏膜杯状细胞出现不同程度的萎缩，黏液分泌较少。各方证治疗组大鼠经过药物治疗后，阴虚方证组、热秘方证组杯状细胞形状、黏液分泌情况均有所改善，其中阴虚方证组趋近空白组水平，杯状细胞饱满、圆润，黏液分泌丰富。2.2.3“以方测证”的血清神经递质含量及结肠水通道蛋白表达评价表7-8显示，阴虚方证组经药物干预治疗后，能够显著降低模型大鼠血清NO和VIP含量（P0.01），以及结肠水通道蛋白AQP3和AQP8表达（P0.05），干预效果明显优于其它方证组（P0.01）。表1造模对大鼠5h粪便含水量、粪便颗粒数的影响（x s，n=10）组别空白组模型组模型对照组5 h粪便含水量（%）造模前54.170.8854.400.5454.800.44造模后54.770.6635.590.20*44.030.85*24 h粪便颗粒数（颗）造模前51.000.6049.900.8751.800.59造模后150.709.5369.703.01*118.805.66*结肠内粪便颗粒数（颗）0.200.207.900.31*1.900.31*注：与空白组比较，*P0.05，*P0.01；与模型对照组比较，P0.01。表2造模对大鼠结肠杯状细胞的影响（x s，n=6）组别空白组模型组模型对照组杯状细胞数量（个）191.679.89113.398.40*170.7213.60阳性细胞表达面积（%）12.450.915.400.34*17.850.46*注：与空白组比较，*P0.01；与模型对照组比较，P0.01。表3造模对大鼠血清神经递质含量的影响（x s，n=10）组别空白组模型组模型对照组NO（molL-1）5.250.638.880.56*8.740.56*VIP（pgmL-1）22.213.2248.563.15*45.593.35*注：与空白组比较，*P0.001。表4造模对大鼠结肠水通道蛋白表达的影响（x s，n=6，AOD）组别空白组模型组模型对照组AQP30.20380.00640.25660.0094*0.26520.0029*AQP80.19810.00500.25150.0088*0.24640.0080*注：与空白组比较，*P0.001。1142 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝肠疾病研究表5基于5 h粪便含水量、粪便颗粒数的“以方测证”评价（x s，n=10）组别空白组模型组气虚方证组血虚方证组阴虚方证组阳虚方证组热秘方证组5 h粪便含水量（%）造模后54.770.6635.590.20*35.110.12*35.160.15*36.000.32*38.070.69*39.111.01*治疗后54.520.4536.320.38*52.650.8953.170.9955.000.3252.611.0453.600.9624 h粪便颗粒数（颗）造模后150.709.5369.703.01*68.902.15*74.903.03*74.203.11*81.102.46*75.203.44*治疗后142.901.8480.601.35*86.401.71*85.801.59*92.802.34*87.700.94*62.801.09*结肠内粪便颗粒数（颗）0.200.207.900.31*4.300.37*3.300.26*2.400.453.800.41*1.900.31注：与空白组比较，*P0.01；与模型组比较，P0.05，P0.01。表7基于血清神经递质含量的“以方测证”评价（x s，n=10）组别空白组模型组气虚方证组血虚方证组阴虚方证组阳虚方证组热秘方证组NO（molL-1）5.250.638.880.56*6.630.666.790.714.950.186.670.427.750.56VIP（pgmL-1）22.213.2248.563.15*36.454.97*38.812.99*25.502.8338.273.62*41.963.66*注：与空白组比较，*P0.01；与模型组比较，P0.05，P0.01。表6基于结肠杯状细胞的“以方测证”评价（x s，n=6）组别空白组模型组气虚方证组血虚方证组阴虚方证组阳虚方证组热秘方证组杯状细胞数量（个）191.679.89113.398.40*177.399.45159.0016.20209.895.64168.0019.46210.1110.50阳性细胞表达面积（%）12.450.915.400.34*10.540.199.021.35*14.570.6510.691.2117.991.20*注：与空白组比较，*P0.05，*P0.01；与模型组比较，P0.05，P0.01。表8基于结肠水通道蛋白表达的“以方测证”评价（x s，n=6）组别空白组模型组气虚方证组血虚方证组阴虚方证组阳虚方证组热秘方证组AQP30.20380.00640.25660.0094*0.22720.0074*0.24640.0051*0.20410.00570.24290.0039*0.25380.0047*AQP80.19810.00500.25150.0088*0.21240.10540.22350.01110.18180.00290.21670.00940.24690.0061注：与空白组比较，*P0.05,*P0.01；与模型组比较，P0.01。图1各组大鼠结肠黏膜PAS染色图（400）1143 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 3 讨论 3.1“汗下复合法”复制阴虚肠燥证便秘模型的理论依据景岳全书秘结 曰“凡属老人、虚人、阴脏人及产后、病后、多汗后，或小水过多，或亡血、失血、大吐、大下之后，多有病为燥结者，盖此非气血之亏，即津液之耗。”提示阴虚肠燥证便秘的基本病机为阴津不足，肠失濡润。汗之本源为津液所化，“津汗同源”，汗出、泻下可导致津液流失12-13。毛果芸香碱是动物实验的常用发汗药物14，大黄酸则是动物泻下造模的常用药物15-16。因此，本实验从“津液流失”的核心病机出发，采用毛果芸香碱皮下注射致大鼠出汗复合大黄酸灌胃致大鼠泻下，创立“汗下复合法”以模拟人类大量汗出、泻下过度而致津液流失的情况。3.2“汗下复合法”复制便秘的疾病模型评价观察动物宏观表征，模型组大鼠的被毛稀疏湿润，耳、鼻、唇、尾光泽暗淡，造模前期粪便稀溏而后期干硬，5 h粪便含水量、24 h粪便颗粒数明显低于空白组和模型对照组（P0.05），结肠内粪便颗粒数明显高于空白组和模型对照组（P0.01），与 中医临床诊断术语 拟订的“阴虚肠燥证”证候“大便干结、艰涩难下，多日一便，状如羊屎，口鼻、咽喉、皮肤干燥”基本一致，提示“汗下复合法”造模可以引起大鼠津液耗伤，肠失濡润，“汗下复合法”复制的便秘模型效果优于西药洛哌丁胺法。本实验发现，模型组大鼠的结肠组织杯状细胞数和阳性细胞表达面积都明显低于空白组和模型对照组（P0.01），血清神经递质（NO、VIP）含量、结肠水通道蛋白（AQP3、AQP8）表达明显高于空白组（P0.05）。研究表明，结肠杯状细胞分泌黏蛋白而形成肠道黏液屏障，对维持肠道黏膜屏障的完整性和稳定性起着重要作用17。NO及其合成酶NOS可通过多个途径参与消化道的运动调节18，抑制肠道平滑肌运动，津亏状态下 NOS 酶的活性增强19。肠道神经递质 VIP 具有抗炎20-21、抑制平滑肌收缩22、促进肠道液体分泌23等作用。水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）介导水分子跨细胞膜转运24，AQP3、AQP8在肠道津液代谢中起着重要作用25。上述微观指标提示“汗下复合法”造模可以影响肠道动力、肠道液体分泌、水液吸收功能，从而导致便秘。3.3“汗下复合法”复制便秘大鼠模型的“以方测证”评价“以方测证”是验证中医证候模型的重要佐证方法26，其理论依据是“证”与“方”之间的内在关联性，即“方证对应”或“方证相关”27。基于此，本实验在设立空白组、模型组、阴虚方证治疗组的基础上，根据便秘的临床常见证型，还设立了气虚、血虚、阳虚、热秘方证对照组。实验发现阴虚方证组药物对模型大鼠5 h粪便含水量、24 h粪便颗粒数、肠内粪便颗粒数、结肠组织杯状细胞数和阳性细胞表达面积、血清神经递质（NO、VIP）含量、结肠水通道蛋白（AQP3、AQP8）表达的整体干预效果优于其它方证组，提示“汗下复合法”复制的便秘大鼠模型更符合阴虚肠燥证特质。3.4“汗下复合法”复制大鼠便秘模型的特点洛哌丁胺灌胃是目前复制便秘模型的成熟造模方法28，通过抑制肠道平滑肌收缩、抑制肠液分泌、减少肠道蠕动，导致大鼠粪便干硬、排便数量减少、肠道运输减慢，具有造模时间短、动物耐受性良好、可操作性强、易于复制的特点，但是，咯哌丁胺复制的是便秘的疾病模型。“汗下复合法”复制的是便秘的中医证候模型，其模型设计符合便秘“阴虚肠燥证”的基本病机，具有病证结合特点。4 结论 阴虚肠燥证是便秘的常见证型之一，开展动物证候模型研究对于揭示其证候生物学基础具有积极意义。本实验根据中医学“汗津同源”理论，创立“汗下复合法”复制便秘证候模型，并且从宏观指征和微观指标角度分别进行疾病模型和证候模型“以方测证”评价，证实毛果芸香碱注射复合大黄酸灌胃的“汗下复合法”造模方法可以复制阴虚肠燥证便秘大鼠模型。回顾本实验，后续研究有待进一步明确：一是造模时间设计。阴虚肠燥证属于虚性便秘，病程相对较长。本实验是在参考相关研究和反复预实验的基础上，确定造模时间为14天，动物造模是否需要持续更长时间？二是方证对照设计。便秘的临床常见证型还包括冷秘和气秘，有待进一步扩大方证对照组设计；三是微观指标选择。便秘的生物学机制涉及肠动力、粘膜屏障、肠道内环境、神经递质、水通道蛋白等多个方面，增加“以方测证”的微观指标分析，对于揭示其证候生物学机制具有积极意义。1144 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝肠疾病研究参考文献 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Sweating compound diarrhea method,and to evaluate the macroscopic characterization,microscopic biological 1145 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 indications,and the Syndrome Differentiation through Formula Effect Assessment of the model,so as to provide an experimental basis for the study of the rat model of constipation yin deficiency with intestinal dryness.MethodsEighty rats were randomly divided into blank group,model group,model control group,Qi-deficiency prescription group,blood-deficiency prescription group,yin-deficiency prescription group,yang-deficiency prescription group,heat secret prescription group,10 rats in each group.The rats in the model group and each formula group were gavaged with Rhein and injected with Pilocarpine,and the rats in the model control group were gavaged with loperamide for 14 days.At the end of modeling,each formula group was treated with classical formula for constipation:Huang Qi Tang for Qi-deficiency prescription group,Run Chang Wan for blood-deficiency prescription group,Zeng Ye Tang for yin-deficiency prescription group,Ji Chuan Jian for yang-deficiency prescription group,and Ma Zi Ren Wan for heat secret prescription group,and the treatment lasted for 4 days.The rats were observed for general condition,body weight,food intake,fecal properties,the number of 24 h fecal pellets,5 h fecal water content,and the number of fecal pellets in the colon after execution;the mucus secretion of the colon were detected,the serum VIP content was detected by ELISA,the serum NO content was detected by colorimetric method,and the colonic AQP3 and AQP8 expressions were detected by immunohistochemistry.ResultsEvaluation of disease model:The coats of the rats in the model group are sparse and moist,the ears,nose,lips,and tail are dull,and the stools are sparse in the early stage of modeling and dry and hard in the later stage.The water content of feces at 5 h and the number of fecal particles at 24 h are significantly lower than those of the blank group.And the model control group(P0.05),the number of fecal particles in the colon was significantly higher than that of the blank group and the model control group(P0.01).In terms of microscopic indications,the number of goblet cells in the colon tissue and the expression area of positive cells in the model group were significantly lower than those in the blank group and the model control group(P0.01),serum neurotransmitter(NO,VIP)content,colon The expression of aquaporin(AQP3,AQP8)was significantly higher than that of the blank group(P0.05);The evaluation of the syndrome model of using prescriptions:the Yin deficiency prescription group had an effect on 5 h fecal water content,24 h fecal particles,intestinal The number of internal stool particles,the number of goblet cells in colon tissue and the expression area of positive cells,the content of serum neurotransmitters(NO,VIP),and the expression of colonic aquaporin(AQP3,AQP8)have better overall intervention effects than other prescription groups.Conclusion The injection of pilocarpine combined with rhein for 14