一种可观察小鼠小肠全长的切片制备技术.pdf

254 CHINESE JOURNAL OF ANATOMY Vol.46 No.3 2023 解剖学杂志 2023 年第 46 卷第 3 期一种可观察小鼠小肠全长的切片制备技术*梁艳清 叶晓霞 吴民华 胡 利 衣艳梅 张 标 何攀峰（广东医科大学组织学与胚胎学教研室，湛江 524023）A section preparation technique for observing the whole length of mouse small intestine*Liang Yanqing，Ye Xiaoxia，Wu Minhua，Hu Li，Yi Yanmei，Zhang Biao，He Panfeng（Department of Histology and Embryology，Guangdong Medical University，Zhanjiang 524023，China）*国家自然科学基金（81873885）；国家级大学生创新训练计划项目（202210571027）第 1 作者 E-mail： 通信作者，E-mail：收稿日期：2022-05-18；修回日期：2023-04-03doi：10.3969/j.issn.1001-1633.2023.03.015技术方法制备小肠组织切片以观察其组织结构特点和小肠各段的变化和结构差异，是组织学实验教学和动物实验组织学研究中的一种常规方法。由于小肠是一种较长、连续而迂曲的肌性管道，并且各段粗细不均、不易固定成形，因此肠管修切多采用局部横切或纵切1。但是上述常规小肠制片方法只能观察小肠某段局部结构，不能完整观察到整段小肠的组织结构及其连续变化。故笔者探索了一种可在同一切片中连续观察小鼠小肠全长组织结构的切片制备方法，并通过染色观察其制备效果。现将该方法介绍如下。1 材料和方法1.1 实验动物 12周C57BL/6小鼠，SPF级，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司。1.2 主要试剂 10%中性福尔马林固定液、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、二甲苯、苏木精、伊红、0.9%NaCl注射液、PBS缓冲液。1.3 取材小鼠常规饲养。禁食24 h后，予以2.5%戊巴比妥钠麻醉（75 mg/kg），大约10 min小鼠翻正反射消失后开始取材。小鼠眼眶放血后，打开腹腔和胸腔，使用0.9%NaCl注射液对小鼠予以心灌注，待肝由红色变为灰白色即可，接着予以10%中性福尔马林灌注固定，待5 min后，找到小鼠胃幽门部，用眼科镊分离出整个小肠。用冰PBS缓冲液冲洗内容物后，根据参考文献2，将整段小肠大致分割为连续的3段：十二指肠（图1A-a）、空肠（图1A-b）和回肠（图1A-c）。1.4 肠腔平铺 整个操作于冰上进行。用小直剪沿着小肠肠系膜剪开，并用眼科镊轻轻把肠腔展平、使肠腔面朝上，用注射器吸取固定液于肠组织上进行初步固定，以防组织自溶。1.5 肠管卷曲十二指肠是小肠的起点，且在小肠3段中管径最粗、以后逐渐变细。因此连续分割的3段小肠分别用长直镊从最宽处肠端卷起，一圈一圈滚动叠加成环状（图1B），最后用大头针从肠末端经过镊子中心贯穿整个组织以固定小肠环3（图1C）。1.6 固定将卷曲并经大头针固定的小肠环组织块投入10%中性甲醛溶液中固定4。24 h后，取出大头针。1.7 脱水、透明、浸蜡、包埋组织块从固定液中取出，经梯度乙醇脱水：70%乙醇和80%乙醇各6 h，95%乙醇、各1.5 h，100%乙醇、各1 h。透明：二甲苯、约各30 min。60浸蜡2次共3 h，石蜡包埋（图1D）。1.8 切片和染色Leica RM2245石 蜡 切 片 机 进 行 组 织 切 片，厚 度 为 4 m。将连续3段小肠的组织切片裱在同一张载玻片上。石蜡切片常规脱蜡后，入苏木精染液10 min，自来水返蓝 45 min，伊红染液8 min。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，新型环保封片胶封片5。2 结果将连续分割的3段小肠环组织切片裱在同一张载破片上，从左到右顺序依次为十二指肠、空场和回肠（图2A）。经H-E染色后观察，肉眼可见小肠组织呈同心圆状排列，中心为起始段，边缘为末端。低倍镜下观察，小肠呈纵切面环形排列，清晰可见小肠管壁的黏膜、黏膜下层、肌层等分层结构，以及皱襞、小肠绒毛、小肠腺等小肠特征性结构。高倍镜下观察，可见十二指肠段的黏膜下层有大量十二指肠腺（图2B），肠绒毛呈较宽叶片状排列；空肠段肠绒毛呈较高指状紧密排列（图2C）；回肠段肠绒毛呈矮柱状，排列疏松，有较多淋巴组织（图2D）。利用此方法，实现了在一张载玻片上同时观察小肠全长的形态学结构，能够比较小肠各段（十二指肠、空场、回肠）的结构特点、变化规律及特征性结构。255 1Caaabbb321ccc3 讨论在常规肠组织切片的制备中，由于局部取材和不同切面等原因容易出现部分切片组织结构不完整、缺少典型特征性结构等问题，这对于观察、认识和研究小肠结构的连续变化和某些特殊结构都很不方便。利用本改良肠组织切片制备方法，实现了在一张载玻片上同时观察小肠全长连续的组织学结构，能够清晰观察和方便比较小肠各段的结构特点、连续变化规律和某些特征性结构，如潘氏细胞、小肠派尔斑的分布。与以前的小肠瑞士卷法相比3，本制片方法将小肠大致分割为连续的3段、并且将3段小肠环组织放在了同一张载玻片上，以保证后续连续完整观察小肠。同时实验步骤中还进行了一定改良：取材时采用了灌注固定法，等待 5 min后再进行小肠取材，且后续所有操作均保持在冰上完成，减少了肠组织自溶，实验结果观察组织结构清晰；采用4 PBS缓冲液清洗肠内容物，并在肠道平铺清洗干净后立即在肠腔面加入固定液进行初步固定；在组织平铺、卷曲和选择切面方向时，注意考虑各特征性结构的位置。如小肠派尔斑一般位于肠系膜对侧面，平铺后选择小肠肠系膜侧处剪开，以避免破坏派尔斑；肠腔卷曲时慢慢叠加，尽量使所有的肠管位于同一水平面，便于切片时切到所有卷曲层的肠腔全貌；组织块包埋时考虑组织切片的方向。经过此改良方法制备得到的小肠组织切片，固定和染色效果好，图 1 小肠全长连续取材、卷曲和组织蜡块制备。A：整段小肠分割为连续的 3 段，ac 分别为十二指肠、空肠和回肠；B：卷曲好的小肠环；C：大头针固定好的小肠环；D：包埋好的小肠环石蜡块，ac 分别为十二指肠、空肠和回肠.图 2 小肠全长连续组织切片和 H-E 染色结果。A：3 段小肠环组织切片裱片（肉眼）；B：十二指肠，100；C：空肠，100；D：回肠，100。1：十二指肠腺；2：小肠绒毛（指状）；3：淋巴小结.1A2A1B1D2B2C2D 256 CHINESE JOURNAL OF ANATOMY Vol.46 No.3 2023 解剖学杂志 2023 年第 46 卷第 3 期并且完整保留了小肠全长3段结构和各层次所有组织。这种改良的小肠组织制片方法有显著的应用优点：在组织学教学中，便于学生快速直观观察、比较小肠全长及各段的形态学结构，容易掌握各段特点、区别小肠各段；应用于科研，利用这种技术方法，结合免疫组织化学、免疫荧光组织化学、原位杂交组织化学等技术，能够直观观察某类物质、分子标志物等在小肠的整体分布、在各段各层次的表达差异以及定位、定量情况，可大大减少实验工作量及相关试剂的使用，提高科研工作效率；随着数字切片技术的逐步广泛应用，将用这一方法制备的小肠组织切片扫描为数字切片，更方便直接地浏览小肠全貌，能更进一步提高教学、科研效率。但此法也有一定的局限性，对制片人的取材、卷曲、固定等方面有较高技术要求；另外此法所取得的组织块较大，因此对于肠管粗且长的较大动物和人不太适用。参 考 文 献1 瞿文生，尹继业，王仪娜，等.大鼠肠管制片方法的改进与优化J.军事医学，2019，43（3）：221-224.2 刘克剑，盖仁华.小鼠组织学M.北京：北京科学技术出版社，2019：47-49.3 Moolebeek C，Ruitenberg E J.TheSwiss roll：A simple technique for histological studies of the rodent intestineJ.Lab Anim，1981，15：57-59.4 赵玉琼，李瑞生，陈华.三种固定液对大、小鼠肠道组织石蜡切片质量的影响J.中国比较医学杂志，2014，24（11）：53-56.5 代鹏，肖磊，周晟.三种封片胶封片的效果比较J.临床与实验病理学杂志，2020，36（2）：227-228.doi：10.3969/j.issn.1001-1633.2023.03.016教学研究*遵义医科大学教改资助项目（XJJG2018-06-069）第 1 作者 E-mail： 通信作者,E-mail：收稿日期：2022-03-17；修回日期：2023-03-13形象比喻法与课程思政相结合在组织学胚胎学 免疫系统教学中的应用*周 怡 王凤月 赵 朔 何志全（遵义医科大学形态学实验室，遵义 563000）An application of combining figurative method and ideological and political teaching in immune system teaching of histology and embryology*Zhou Yi，Wang Fengyue，Zhao Shuo，He Zhiquan（Morphological Laboratory，Zunyi Medical University，Zunyi 563000，China）组织学与胚胎学是医学生首次接触的基础医学形态学课程之一。该课程对于医学新生来说较陌生，新名称、新概念及知识点多，且零散，细胞及其结构相似度高，容易混淆。另外，组织学胚胎学虽为医学形态学科，但所涉及的细胞及其结构肉眼不可见，显微镜下及图片均是二维结构，因此学起来抽象、难理解。新版教材及青年教师传授知识时仅有形态结构及功能，未能很好阐述形态结构为什么是这样，结构如何服务于功能等知识，学生不能理解记忆，只能死记硬背。基于上述原因，学生在学习过程中逐渐丧失学习兴趣。笔者在教学过程中进行了一系列教学改革1-7，主要是实验教学改革，也取得较好的教学效果。但学生在理论知识学习和自主学习上仍存在较大困境，如何提高学生学习兴趣、增强对知识的理解记忆成为理论教学过程中的关键。形象比喻为用熟悉的事物来比喻要记忆的事物，使之生动直观，进而在头脑中留下具体完整的形象，以便于识记。该法用于教学，使抽象知识更具体、更通俗易懂。课程思政以构建全员、全程、全课程育人格局的形式将各类课程与思想政治理论课同向同行，形成协同效应，把“立德树人”作为教育根本任务的一种综合教育理念。形象比喻法在中小学课程中开展较多8-9，深受学生喜欢，在医学课程运用反而少10-11，组织学胚胎学教学中更少12。将课程思政与之结合的教学模式还未被运用。因此，笔者将形象比喻法和课程思政结合，运用于组织胚胎学免疫系统的教学中，拟通过合理的教学设计，实行形象比喻和课程思政结合教学模式。将零散知识整合化，抽象结构形象化、复杂知识简单化，结构和功能统一化，以此提高学生学习兴趣和对知识点理解记忆，增强责任感和从医荣誉感、自豪感。1 研究对象与方法1.1 研究对象2020级临床专业1315班、2225班共计306人。